Introduction
В транскрипционных исследованиях, проведенных на уровне тканей, Транскриптом узкоспециализированных, но редких типов клеток часто маскируется более обильными окружающих клеток. Примером таких узкоспециализированных типов клеток являются клетки женской репродуктивной линии (зародышевой) в растениях. Самка зародышевой задается в развивающихся яйцеклеток, предшественники семян внутри гинецеем цветочной 1,2. Мегаспор материнская клетка (MMC) является первой ячейкой женского зародышевых. Он подвергается мейоза с образованием тетраду восстановленных мегаспор. Как правило, только один из этих мегаспор выживает и делит митотически без цитокинеза, то есть, в синцитий. Эти митозы следуют cellularization с образованием зрелого гаметофит, который, как правило, состоит из четырех типов клеток: три antipodals, два synergid клетки, яйца и центральной клетки. Яичные и центральные клетки являются женские гаметы, которые получают оплодотворенные двумя сперматозоидами во время доуBLE оплодотворение , чтобы дать начало зародыша и эндосперма Проявочной семян 1,2. В сексуальной модели системы Резуховидка Таля, только ~ 50 семян развиваются на цветок в то время как около 50 - 80 семян развиваются на цветок в тесно связанного рода Boechera. Таким образом, самка зародышевой состоит из всего лишь нескольких узкоспециализированных типов клеток, что делает его отличной моделью для изучения процессов развития, такие как спецификации и дифференцировки клеток.
Кроме того, способность проникновения в суть регуляторных процессов генов, регулирующих размножение растений может быть прикладной ценности. У растений, как половое и бесполое размножение через семена (апомиксису) может произойти. В то время как половое размножение создает генетическое разнообразие в популяции, апомиксис приводит к образованию клонального потомства, генетически идентичны материнского растения. Поэтому апомиксису имеет большой потенциал для применения в сельском хозяйстве и производстве семян, так как даже сложные материнские генотипы могутподдерживаться неизменным на протяжении нескольких поколений 3,4,5. Поскольку апомиксису , естественно , не происходит ни в одном основных видов сельскохозяйственных культур, инженерный апомиксиса в посевах представляет большой интерес 3,4,5. Тем не менее, это долгосрочная цель трудно достичь , потому что основной генетический и молекулярная основа апомиксисом не понята достаточно подробно 6.
Для того, чтобы получить представление о транскрипционной основе , регулирующие апомиктическое воспроизводства, типа клеток специфических транскрипционных профилирование с помощью с помощью лазера микродиссекции (LAM) и следующего поколения секвенирования (NGS) представляет собой очень мощный подход 7,8. LAM сначала был создан для животных и биомедицинских исследований. За последние несколько лет LAM также применяется к биологии растений 6,9,10. В отличие от других способов , позволяющих профилирование отдельных клеток и тканей типов, Lam не требует генерации маркерных линий 6,9,10. Таким образом, это может быть приложениелгал любой клетки или ткани типа без предварительного молекулярного знания. Еще одним преимуществом является то, что LAM он может быть применен к любому типу клеток до тех пор, как клетка может быть распознана в сухих участках в зависимости от положения и / или структурных характеристик. LAM имеет дополнительное преимущество в том, что используются фиксированные ткани, что предотвращает изменения транскрипционного профиля во время обработки.
Ткани интерес, например, цветочной ткани, фиксируется в несшивающий закрепителя до встраивания в парафин. Вложение в парафин может быть сделано вручную, в соответствии с установленными протоколами 9,11. Тем не менее, использование автоматизированного процессора ткани для дегидратации и инфильтрации с воском обычно приводит к более высокой воспроизводимостью с точки зрения сохранения качества РНК и морфологии тканей. Альтернативная стратегия встраивания ткани в смолу также успешно используется для анализа типа специфических клеточных LAM 8. Тем не менее, использование автомПроцессор ткани ованные для встраивания в воске очень много времени эффективным, так как многие образцы могут быть обработаны сразу же требует как минимум практического времени. В то время как, как правило, нет значительной потери качества РНК происходит во время фиксации и встраивание, приготовление тонких срезов с микротома и, в частности, монтаж на frameslides, используемых для LAM остается важным шагом для сохранения качества РНК. Это ранее было отмечено , и использование системы передачи ленты была описана в более высокое качество РНК на данном этапе 12. Тем не менее, это добавляет еще один шаг больших затрат времени при подготовке слайдов, а также требует специального оборудования. Оптимизированный протокол , описанный ниже воспроизводимо производит РНК , которая обладает достаточным качеством для транскрипционного профилирования с GeneChips и следующего поколения секвенирования (NGS) подходы 7,11,13,14. Кроме того, с помощью лазерного микроскопа микродиссекции, используемого, высокая чистота выделенных типов клеток является беспорядочное бегствоinely производства 7,11,13,14.
Род Boechera является отличной моделью системы для изучения ключевых шагов апомиктическому воспроизводства. В Boechera, множество различных сексуальных и апомиктических присоединений были идентифицированы и могут быть использованы для сравнительного анализа 15,16,17. При сравнении типа клеток специфических Транскриптом клеток из женских зародышевых от сексуальных Arabidopsis и апомиктическому Boechera, мы идентифицировали гены и пути , которые дифференцированно выражены, выявляя тем самым новые аспекты регуляторных процессов , определяющих апомиксис 7. Кроме того, это исследование проверяется пригодность LAM для транскрипции типоспецифичной клеток анализ малых и редких типов клеток. Мы уже использовали этот протокол для анализа различных типов клеток в различных видов растений, но видо- и ткане-специфические модификации протокола может потребоваться в некоторых случаях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол описывает подготовку тканей, с помощью лазера микродиссекции и экстракции РНК для транскрипции профилирования. Всегда используйте перчатки на протяжении всех этапов протокола. Исследование и рассмотреть инструкции по технике безопасности для каждого химического вещества, используемого. В частности, иметь в виду, что ксилола вредно и может проникать перчатки и что метанол является токсичным. Для всех используемых инструментов, пожалуйста, обратитесь к соответствующим руководствам пользователя.
1. Удаление РНКазы деятельности из стеклянной посуды и другого оборудования
- Перед использованием обернуть любую стеклянную посуду в алюминиевую фольгу Перед выпечкой в течение ~ 8 ч при 180 ° С для обеспечения РНКазы качества.
- Лечить любые металлические поверхности (например, пара пинцетов), а также работа скамейка и нагревательная пластина с соответствующим обеззараживающим раствором РНКазы. После этого промойте поверхность с РНКазы водой, чтобы удалить обеззараживающим раствором. Затем очистите поверхности дополнительно с 70% этанола.
- Используйте все товарные объявленияTIC расходные материалы (например, трубы) совершенно новый без предварительной обработки. Если есть возможность, используйте пластиковые расходные материалы, которые сертифицированы быть РНКазы.
2. Ткань Фиксирование
- Приготовьте 10 мл фиксаторе фермера (3: 1, об / об этанол: уксусная кислота) в свежем 15 мл пробирку на льду. (Всегда готовьте закрепитель свежей Фермера перед использованием). В качестве альтернативы, несшивающий закрепителя этанол: уксусная кислота (5: 1 об / об) может быть использовано 18.
- Используйте тонкую пару пинцета, чтобы собрать почки на стадии развития интереса. Немедленно погрузите почки в ледяной закрепителя. Используйте 10 мл закрепитель для фиксации ~ 20 бутоны или цветы из Arabidopsis или Boechera Примечание. При использовании видов растений с более крупными цветами рекомендуется рассекать цветы с лезвием бритвы , чтобы генерировать более мелкие куски до фиксации.
- Для того чтобы получить зрелые гаметофиты, выхолостить 2 - 3-х крупнейших цветочных почек на inflorценции 2 дня до сбора урожая.
- Заполните дно эксикаторе со льдом. Откройте пробирки , содержащие образцы, например, цветы, и разместить их на льду, либо путем непосредственного ввода их в лед таким образом , что они не могут упасть или с помощью соответствующего держателя. Вакуумный просочиться в течение 15 мин до высвобождения вакуума.
- Повторите вакуумной пропитки один раз в течение 15 мин.
- Отпустите вакуума и хранить в течение ночи (~ 12 ч) на льду. Накройте ведро льда с фольгой крышкой или алюминиевой и хранить в ведро 4 ° C комнате или холодильник с тем чтобы предотвратить лед от таяния. Примечание: Продлите время фиксации не рекомендуется.
3. Ткань Вложение, Тонкий Секционирование и монтирование на слайдах для LAM
- Тканевая вложение.
- Заменить закрепитель до 70% этанола, полученного с чистым этанолом и РНКазы водой. Оставьте образцы на льду до дальнейшей обработки. Начало embedding образцов в тот же день. В случае , если нет ткани машинной обработки отсутствует, переходите к ручной вложении , как описано в другом месте 9,11 и перейдите к шагу 3.1.11.
- Аккуратно перенести образцы ткани на встраивание кассет с помощью пинцета. Плотно закройте кассеты. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Избегайте даже частичную сушку образца во время этого шага. Избегайте сдавливания образцов с помощью пинцета.
Примечание: Для маркировки кассеты карандаш следует использовать, в идеале, написав на наклонной поверхности кассеты. - Храните вложение загружена кассета с бутонами или цветами в 70% этанола, пока весь материал не передается на кассетах и вложение машина может быть загружен. Для этой цели используют стекло окрашивающий корыто, заполненную 70% -ным этанолом.
- Извлеките корзины процессора ткани из реторты машины и передавать Вложение кассеты в корзину с наклонными поверхностями, обращенными верхнюю часть и в том же самом направлении. CRITical ШАГ: Выполняйте это быстро, чтобы предотвратить высыхание тканей. Если обработке большого количества встраивание кассет сразу, поместите корзину в соответствующую РНКазы емкость, наполненную 70% -ным этанолом до загрузки образцов.
- Положите крышку на корзину и поставил корзину обратно в реторты. Закройте реторты.
Примечание: Процессор ткани автоматически обезвоживает образцы, изменения растворителя к ксилолы, и делает инфильтрацию с расплавленным парафином. Как правило, это делается в течение ночи. - Запуск программы процессора ткани. Рекомендуемые стандартные настройки 1 час 70% этанола, в три раза 1 час 90% этанола, в три раза 1 час 100% этанола, два раза 1 час 100% ксилола, один раз 1 час 15 мин 100% ксилола при комнатной температуре, с последующей инфильтрацией парафином два раза в течение 1 часа и один раз в течение 3 часов при 56 ° C 11.
Примечание: Для того, чтобы гарантировать, что блокировка станция готова с воском топленого, включите машину за несколько часов до начала илииспользовать функцию таймера, чтобы выбрать приблизительный время начала.
Примечание: В случае, если ткань не может быть обработан сразу же после этого, более длительное время инкубации в парафин при температуре 56 ° С, возможно, вместо 3 ч при 56 ° С. Обратитесь к руководству по эксплуатации прибора. Как правило, кассеты с тканями автоматически остаются в расплавленном воске, пока команда "пустой реторты" не утвержден. Если воск не плавится при запуске процессора ткани, реторта заполняется 70% -ным этанолом, и программа остается на удержании, пока готов к запуску. - Очищать реторту и немедленно передать образцы в восковую ванну парафина при температуре 56 ° С в блокирующем станции. Удалите крышку из корзины и покрывают парафином ванну блокирующей станции с крышкой.
- Ворсовые, как много свежих балансирующие подносы на поверхности блокирующего станции нагревали до 56 ° С, поскольку есть кассеты в корзине.
Примечание: этанол-устойчивый постоянный маркер можно использоватьd, чтобы обозначить нижнюю часть балансировочных лотков. Не рекомендуется использовать Ацетон устойчивые перманентные маркеры. - Использование блокировки станции, заполняют предварительно подогретый свежий пластиковый поднос с балансирования растопленным парафином при 56 ° C. Поднимите крышку парафиновой ванны, поднимите одну кассету только в то время, и передавать образцы из кассет для жидкого парафина при температуре 56 ° С в балансирующего лотке с помощью пинцета.
ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Избегайте затвердевания воска, окружающей образец при обращении с кассеты, работая быстро.- Поместите все образцы в соответствии с потребностями с помощью иглы препарат до затвердевания воска. Как правило, несколько цветов расположены в балансировочном лоток индивидуально разнесенных примерно на 1 см в каждом направлении.
- Повторите шаг 3.1.9, пока все образцы не передаются.
- Поместите корзинку обратно в процессор ткани и очистки реторты с помощью соответствующей программы (обратитесь к руководству пользователя).
- Выключите процессор ткани и блокировки станции. Перейдите к шагу 3.1.13.
- В случае, если нет ткани инфильтрация машина и не вложение станции не имеется, использовать нагревательную печь для плавления парафина при температуре 56 ° С. На скамейке, заполнить расплавленный воск в пластиковые лотки балансировки, передавать образцы в воск, а также использовать иглы подготовки для размещения образцов.
- Дайте парафин затвердевать при комнатной температуре в течение ~ 1 - 3 ч перед хранением образцов при температуре 4 ° С. Образцы могут быть впоследствии обработаны свеже или храниться в течение нескольких месяцев.
- Получение тонких срезов и горками для LAM.
- На светостоле осветительного блока воска снизу, удалить парафин с образцами из окружающих пластиковых лотках. Рассеките из квадратную воска блок , содержащий ткань, например., Бутон или цветок, используя РНКазы лезвие бритвы. Для этой цели всегда ориентировать образцы в направлении верхней части блока воска (также см
- Готовят восковые блоки всех образцов, которые должны использоваться для LAM в то время.
- На светостоле осветительного блока воска снизу, удалить парафин с образцами из окружающих пластиковых лотках. Рассеките из квадратную воска блок , содержащий ткань, например., Бутон или цветок, используя РНКазы лезвие бритвы. Для этой цели всегда ориентировать образцы в направлении верхней части блока воска (также см
- Установите блоки для обработки встраивания кассеты, заполненные затвердевшего парафина: растопить небольшой кусочек или капли парафина на кончик соответствующего шпателя с использованием Этанол лампу и использовать горячий воск, чтобы зафиксировать блок на опоре (со встроенными тканей наверху).
- Дайте воску затвердеть в течение по меньшей мере 20 мин при температуре 4 ° С.
- Удалите излишки воска, охватывающую образец с лезвием бритвы на световом столе. Убедитесь в том , чтобы держать квадратную поверхность с параллельными краями (см рисунок 1).
- Установите нагревательную пластину на 42 ° C.
- Безопасное крепление образцов к микротома и подготовить 6 - 10 мкм толщиной секций. Обратитесь к инструкциям производителя для использования микротома. Примечание: В то время как более тонкие участки часто дают лучшее структурное разрешение, большее количество РНК ВЫСОКачество R может быть получен с более толстыми секциями. Для клетки Boechera зрелых гаметофиты мы используем 7 мкм в качестве значения по умолчанию. Перемещение довольно медленно с образцами над микротома нож часто приводит к улучшению гистологии.
- Всегда передавать парафиновой ленты на длине приблизительно 10 - 15 см в пластиковой коробке с черного картона в нижней части перед установкой их в LAM слайдами.
- Если это возможно, предварительно выбрать части парафиновых полосок , содержащих сотовом или ткани типа , представляющие интерес, например, яйцеклеток, под рассекает-рамки и отбросить все остальное.
- Поместите необходимое количество металлических каркасах слайдов (как правило, 5 - 10) с плоской поверхностью сверху на нагревательной пластине.
- Внесите ~ 1 - 2 мл РНКазы свободной воды на пластиковой части слайда. С помощью лезвия бритвы, вырезать парафиновые ленты в короткие отрезки около 4 - 5 см достаточно долго, чтобы охватить пластиковые окна. Uсе пинцета и иглы подготовки к идеально поместить парафиновые полоски параллельно друг другу на пластиковых окнах слайдов. Осторожно поднимите слайд на одном конце, чтобы удалить воду и поместите слайды обратно.
- В качестве альтернативы, поместите нагревательную пластину под химическим капотом. Нанесите небольшой объем метанола, в пластмассовой части ползуна только достаточного для смачивания поверхности (это может привести к небольшому гофрированностью слайдов). Поместите парафиновые полоски на слайдах.
Примечание: Из соображений токсичности, избегать использования метанола, если это возможно. Тем не менее, использование метанола на этом этапе действительно улучшает качество РНК в случае качество достигается за счет установки на воде недостаточно. Стоит тестирования этих альтернатив на старте нового проекта, поскольку качество РНК достигается изменяется в зависимости от типа клеток и вида исследуемого.
- В качестве альтернативы, поместите нагревательную пластину под химическим капотом. Нанесите небольшой объем метанола, в пластмассовой части ползуна только достаточного для смачивания поверхности (это может привести к небольшому гофрированностью слайдов). Поместите парафиновые полоски на слайдах.
- Высушить слайды на ночь на нагревательной пластине при 42 ° С в течение ~ 12 ч. Закройте нагревательный элемент спластиковая крышка, которая не соприкасается с горками. Убедитесь, что пластиковая крышка не препятствует обмену воздуха. С этой целью крышку можно поместить на пипетку коробки или аналогичные быть сняты.
- В качестве альтернативы, сократить время сушки до минимума двух часов или пока ткань появляется абсолютно сухой. Сокращение времени нарезка в коллекции может улучшить качество РНК.
- Под капотом химической, де-воск слайды 2 раза в течение 10 мин в ксилоле с использованием соответствующих держателей слайдов. Убедитесь, чтобы полностью погрузить пластмассовую часть каждого слайда только, но, чтобы позволить удаление слайда, прикоснувшись к более широкому концу металлической рамы, которая хранится сухой.
- Разрешить слайды высохнуть в течение ~ 10 мин под капотом химической предварительной до LAM.
Примечание: Слайды не сразу обработанные может быть помещен обратно на нагревательной пластине при 42 ° С ткань лицевой стороной вверх до нескольких часов. Это предотвратит любую влажность от не ставя под угрозу качество РНК до дальнейшей обработки.
4. помощью лазера микродиссекция (LAM)
Примечание: Процедура LAM будет меняться в зависимости от используемого инструмента. Некоторые детали этого протокола адаптированы к конкретному инструменту и технологии сбора образцов на использовании Колпачок решений электростатических сил. Кроме того, детали могут различаться даже между разными версиями программного обеспечения. Пожалуйста, обратитесь к инструкциям производителя и руководств пользователя для подробного описания и инструкции по инструменту и программному обеспечению.
- Включите устройства для LAM (компьютер, микроскоп, блок управления лазера).
- Запустите программу рулевого микроскопа и лазера.
- Включите лазер, нажав на соответствующую кнопку на панели управления.
- Поместите колпачок (0,5 мл, без рассеивателя) в держатель колпачка и поместите его в приборе.
- Поддержка LAM слайд с стекло для микроскопии. Убедитесь в том, что плоская поверхность с горкойТкань крепится обращена к предметное стекло.
- Поместите слайд в приборе с предметное стекло под ним.
- Выберите Цель 4X. В программе, выберите, чтобы переместить крышку в положение "вверх" и продолжить, чтобы сделать сканирование слайдов.
- Провести поиск слайда и определить структуры, представляющие интерес. Точечные и сохранить свои позиции на слайде, чтобы иметь возможность вернуться к точному положению на стадии резки.
- Выберите подходящую цель (например , 40X или 60X).
- При необходимости регулировать скорость работы лазера, фокус и мощность лазера, а также откалибровать сценическое движение, обращаясь к руководству пользователя прибора. После того, как настройки учетной записи для конкретной интересующей ткани, параметры могут быть использованы повторно.
- Проверьте положение лазера с помощью одного выстрела, нажав на кнопку "лазерный выстрел" программы, в идеале в части мембраны без ткани.
- При необходимости калибровки лазера позиции, следуя йИнструкция е изготовителя для инструмента.
- Проверьте калибровку объектива, сдвинув очевидную структуру для всех четырех углов окна программного обеспечения на мониторе, удерживая правую кнопку мыши нажатой. Убедитесь, что положение руки относительно очевидной структуры одинакова во всех четырех углах. В противном случае калибровки цели следующие инструкции программного обеспечения.
- С крышкой в "вниз" положение, используйте инструмент "рука пера" , чтобы обозначить границы типа клеток или ткани , представляющей интерес, например, яйцеклетки. Рассеките клеток, представляющих интерес с лазером, нажав 'вырезать'. Примечание: Часто, секционирования необходимо повторить, если граница вокруг ячейки не была полностью расчленены сразу. В этом случае рекомендуется, чтобы установить программное обеспечение автоматически делать два повторы секции в качестве стандарта.
- Поднимите крышку и перейти к следующей сохраненной позиции со структурой, представляющей интерес. Повторите шаг 4.13процедуры рассекать в следующих разделах клеток, пока все клетки интерес от одного слайда не собираются. Убедитесь, что крышка расположена таким образом, что новая секция прилипает к пустой позиции на крышке.
Примечание: Рекомендуется изолировать больших кусков ткани (например, участки целых цветков или его частей) от каждого слайда после выделения участков одиночных клеток на свежей крышкой. Они могут быть использованы для контроля качества РНК. - Удалить слайд и перейдите к следующему слайду, повторяя шаги 4.4 - 4.9 и 4.13 до 4,14.
- Повторите шаг 4,15 и связанные с ними действия, пока типы клеток интерес со стороны всех слайдах были изолированы. Примечание: Не рекомендуется собрать дольше, чем ~ 4 - 5 часов на той же крышкой.
- Осмотрите поверхность крышки после того, как LAM, чтобы исключить неспецифические загрязнения образца. В то время как не-рассеченные ткани защищены фольгой, пыль может прилипать к поверхности за счет электростатического сцепления.
- TO визуально осмотреть крышку, выньте слайд из прибора. Поместите держатель крышки в положении "вниз" и осмотрите поверхность с целью 4X.
- В случае небольшие кусочки пыли видны, удалите их с небольшим (2 мкл) пипетки. В качестве альтернативы, установите затвор назад на инструменте, установите крышку на свободной части слайда (без ткани), и полностью уничтожить загрязнения с помощью лазера.
- Закрыть колпачки и заморозить сухие участки при температуре -80 ° С до дальнейшего использования. При необходимости образцы могут храниться в течение нескольких недель. Тем не менее, быстро идет на этом этапе рекомендуется.
5. Выделение РНК и контроль качества
Примечание: РНК может быть выделена с помощью любого способа, подходящего для небольших количеств РНК. В данном протоколе, использование набора для выделения РНК, указанного для небольших количеств РНК описывается. Следуйте инструкциям производителя.
- С помощью пробирки с образцом, прикрепленной кколпачок либо непосредственно, либо после удаления от -80 & deg; С.
- Открыть пробирки и тщательно пипеткой 11 мкл буфера для экстракции к стенке каждой трубки с помощью подсказок фильтра. Изменение советы между образцами.
- Закройте крышку и встряхнуть буфера для экстракции вниз к крышке трубки.
- Место труб с цоколем вниз в нагревательную печь, предварительно нагретую до 42 ° C. Выдержите в течение 30 мин, следуя инструкциям изготовителя.
- Следуйте инструкциям производителя для подготовки колонки и сбора экстракта в нижней части труб.
- Если материал, из более чем одного колпачка должна быть объединены в одну выборку, выполните шаги 5.1.1 - 5.1.2 индивидуально для каждой трубки / колпачка.
- Затем, бассейн выдержки для одного образца в одной пробирке и измеряют количество объединенном экстракта с помощью пипетки перед добавлением эквивалентного количества этанола (см инструкции изготовителя).
- Убедитесь, что количество EtОН добавлены перед загрузкой колонку равно объему объединенном экстракта.
- После осаждения РНК с этанолом, быстро перейти к загрузке колонн следующих инструкций изготовителя. Продолжить протокол с стадии центрифугирования 100 XG.
- После того, как содержимое каждой коллекторной трубы были пропускают через колонку, выполнить шаг центрифугирования 16 000 мкг в течение 30 секунд, чтобы удалить инструкции проточный следующего производителя.
- Продолжить с экстракции РНК и очистки, следуя инструкциям изготовителя.
- После загрузки буфера для элюции в колонке позволяет колонке инкубировать в течение 1 мин. Продолжайте загружать пробирки в центрифугу, следуя инструкциям в инструкции изготовителя. Примечание: дополнительный шаг центрифугирования в течение 1 мин при 100 мкг до элюирования, как указано в протоколе может повысить эффективность элюции.
- Извлечение РНК из продРОЛС (большие срезах ткани) для контроля качества РНК следующие шаги 5.1 до 5.2.7 настоящего протокола.
- Для РНК нагрузки контроля качества 1 мкл неразбавленной суммарную РНК каждого контрольного образца на Bioanalyzer с использованием РНК-Pico Chip в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Извлеченный РНК можно использовать для линейного усиления и анализа транскриптом с использованием микрочипов или РНК-Seq 7,11,13,14. В идеале контроль качества следует указать РНК Целостность Число (RIN) , по меньшей мере , 7. Ряд поставщиков обеспечивают подходящие наборы для амплификации, подходящие примеры приведены в 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подготовка проб и LAM сделаны в последовательных шагов
Ряд последовательных шагов , которые необходимы для подготовки РНК для транскрипции анализа из выбранных типов клеток по LAM (рисунок 1). Это начинается с урожаем цветов и немедленной фиксации, чтобы гарантировать, что популяция РНК остается неизменным после сбора урожая. Ткань вложен, разрезали, и смонтированный на салазках. Это позволяет изоляцию клеток с помощью LAM и объединения секций типа специфических клеток на одной или нескольких крышек (рисунок 1). Материал может быть заморожена после этого или непосредственно обработаны с помощью экстракции РНК. Помимо преимущество LAM быть применимо для типа клеток специфического анализа в обоих типовых и не типовых видов, метод остается довольно много времени. По крайней мере одна неделя рабочего времени, иногда больше, требуется для шагов от тиСГУП урожая для экстракции РНК (Рисунок 1). Необходимо учитывать, что часто секции заготовленные в течение нескольких дней ЛАМ являются объединенном в одном биологическом образце, и РНК-экстракции. Для клеток яичных Boechera, использование , по меньшей мере , ~ 200 участков на выборку , настоятельно рекомендуется, с до ~ 100 секций изолированы в день.
Выделение типов клеток процента зависит от их видимости в засушливых разделах
Выделение участков типа конкретных клеток является наиболее трудоемким этапом протокола. До сих пор ни автоматизация этого шага не было разработано в связи со сложным характером образцов. Идентификация интересующих клеток при помощи программного средства не представляется возможным, так как сухие участки имеют низкий контраст и плоскости сечения изменяется между образцами из-за того, что семяпочек ориентированы под разными углами шithin ткани (рисунок 2). Тем не менее, уникальная морфология зрелого женского гаметофита с синергид, яйцеклеткой и центральной клетки (антиподальные клетки дегенерируют до оплодотворения) позволяет однозначно идентифицировать яйцеклеток исследователем (рис 2B, C; Рисунок 3). Действительно, в Boechera divaricarpa, яйцеклетка часто сжимается немного во время подготовки и , таким образом отделяется от окружающих тканей, особенность выгодно для изоляции популяций яйцеклетку высокой чистоты (рис 2B, C; Рисунок 3).
Визуальный осмотр Cap после LAM Рекомендуется
Визуальный осмотр поверхности крышки после LAM позволяет идентифицировать любые возможные загрязнения образца, например, пылью. Кроме того, было бы полезно, чтобы гарантировать, что С.Е.ctions прилипают к кепке, а иногда участки теряются во время процедуры. Как правило, многие отдельные разделы, например, яйцеклетки, можно увидеть на одной крышкой после нескольких часов LAM.
Установленный рабочий процесс воспроизводимо Результаты в хорошем РНК качества
От типа клеток специфических LAM выделениями из женских гаметофита, общие количества РНК только в низком диапазоне нг. Это ограничение количества РНК делает необходимым использовать репрезентативную управления, изолированных из больших тканей каждого слайда в качестве приближения для контроля качества РНК после LAM. Об этом свидетельствует сравнение типа клеток специфической РНК из B. divaricarpa яйцеклетки по сравнению с контрольной группой из более крупных областей ткани , выделенных из тех же слайдах, что указывает на аналогичное качество РНК (фиг.4А, В). Используя этот метод, хорошо к высокому качеству РНК с номерами Rin & #8805; 7 воспроизводимо получен. Качество РНК достигнуто подходит для типа клеток специфической РНК-Seq, что приводит к идентификации 236 генов, выраженных в апомиктическому яйцеклетки, но не в апомиктическому центральной клетки, synergid клетки, или апомиктическому исходной ячейки, ни в клетках или зрелая сексуальная гаметофита Резуховидка Таля (рисунок 5) 7.
Рисунок 1:. Схема ступеньках протокола, с указанием Минимальное время на шаг Фиксирование цветов или тканей , представляющих интерес делается в течение ночи. На следующий день, вложение запускается, которая проходит в течение ночи, в результате чего внедренного материала на 3-й день протокола. В день 3 Микротом секции, начиная от встроенных образцов в восковых блоков могут быть получены. Ленточки тонких секций парафиновых смонтированы на салазках и оставляют сохнуть в течение ночи. Напотребуется е несколько дней LAM, чтобы получить достаточное количество материала для одной биологической репликации. После выделения РНК и контроля качества, библиотека подготовка к РНК-Seq могут быть выполнены , чтобы подготовить анализ транскриптом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: яйцеклеток ясно узнаваемыми в шлифах, обусловленные характерными морфологию женского гаметофита (А) Схематическое изображение зрелого женского гаметофита (типа Polygonum) (B - C) шлифах через яйцеклеток укрывательство женские гаметофиты. Покупатели . Boechera divaricarpa. Яичные клетки хорошо видны. Благодаря морфологии женского гаметофита часто не все типы клеток (яйцеклетка: е, синергид: ами, Центральная клетка: сс) открыты в одном разделе. Шкала баров = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. LAM из яйцеклеток Boechera divaricarpa. А и С. Раздел зрелого гаметофита B. divaricarpa на 7 мкм до и, B и D, после того, как микродиссекции с лазерным устройством (яйцеклетка: е, синергид: S, центральная клетка: сс). Шкала баров = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
<сильный> Рисунок 4. РНК Качество лазерно-рассеченные яйцеклеток и управления разделами. (А) качество РНК как было проанализировано из секций яйцеклетка по сравнению с (В) более больших областей ткани добываемых из одних и тех же слайдах , как контроль. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Идентификация генов экспрессируется только в Cell апомиктическому яйцо по сравнению с клетками апомиктических и половозрелыми гаметофита или апомиктических исходной ячейки. Heatmap 236 генов , выраженных в апомиктическому яйцеклетки , но ни в апомиктическому центральной клетки, клетки synergid или апомиктическое исходная клетка B. gunnisoniana , ни клетки зрелого полового гаметофита А. thaliana 7 Иерархическаягруппирование образцов и генов было основано на евклидова расстояния и иерархического агломерационного кластеризацию. Красный означает высокую экспрессию и черный низкую экспрессию. Цвета масштабируются в строке. аро:. апомиктическое Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол подходит для различных мобильных и типов тканей
LAM в сочетании с транскриптом анализа с помощью микрочипов или РНК-Seq является ценным инструментом , чтобы получить представление о специфических форм активности генов , регулирующих развитие организма или физиологические процессы 7-11,13,14. Однако пригодность этого метода для любого данного типа клеток критически зависит от структурных вопросов. Клетка должна быть четко видна и однозначно идентифицируемых в сухих участках, используемых для LAM. В Boechera divaricarpa, морфология гаметофита позволяет легко идентифицировать яйцеклетку (рисунок 2, рисунок 3). В конце концов, скорость выделения конкретной популяции клеток также зависит от частоты, при которой тип клеток может быть найден на одном слайде, как обмен слайдов и сканирование новых слайды трудоемкие шаги. Учитывая, что в зависимости от типа клеток, по меньшей мере, 200 - 250 клеток сектаионы должны быть объединены в образце, пригодность метода для определенной конструкции исследования во многом зависит от требований времени на этапе LAM.
Кроме того, в зависимости от морфологии ткани, может быть предпочтительным с точки зрения структуры, чтобы уменьшить толщину секций до 6 мкм. Точно так же, более толстые участки в идеале ≥ 8 мкм, как правило, приводит к более высоким количеством РНК и РНК несколько более высокого качества из того же количества срезов ткани. Кроме того, клетки интерес, должны иметь, по крайней мере, диаметром 8 - 10 мкм, чтобы сделать изоляцию от LAM осуществимым.
В принципе, протокол, описанный здесь, может быть отрегулировано в различных тканей и клеток типов из отдаленное родственных видов. Тем не менее, качество РНК может варьировать даже между различными типами клеток того же вида 7,10,13. Этот протокол был скорректирован на основе малых и критических типов клеток. Таким образом, теперь он может быть применен к broadeг диапазон образцов без дополнительных корректировок. Незначительные модификации протокола, возможно, тем не менее, требуется, в зависимости от типа клеток и вида исследуемого. Рекомендуется сначала использовать оба альтернативных фиксаторов (см протокол 1.1) при настройке метода для нового вида или типа клеток для сравнения морфологии и качества РНК.
В принципе, этот протокол может быть адаптирован к и выполнены с различными инструментами , пригодных для лазерной микродиссекции 9. Тем не менее, необходимо отметить, что инструменты различаются как по мощности лазера и минимальной ширины лазерного луча, который может быть применен, а также в технологии отбора проб. В частности, для выделения мелких клеток и областей ткани, лазеров, в результате узкого лазерного пути лучше подходят. Лазерный луч прибора мы используем довольно тонкая (~ 1 мкм широкий) и позволяет рассечение мелких клеток. Технология выборки сбора CELLs на клейкой поверхности колпачка с помощью электростатической адгезии является особенно предпочтительным для небольших типов клеток и выделения участков одиночных клеток. Это сводит к минимуму риск потери образца под воздействием электростатических эффектов.
РНК Качество Получено важно для дальнейшего транскрипционные Анализы
Одна из самых критических точек для успешной РНК-Seq подготовки библиотеки является качество РНК. В то время как несколько провайдеров усиления комплектов оптимизировали технологию РНК еще более низкой целостности, качество данных, полученных в результате анализа транскриптома либо путем микрочипов или РНК-Seq обычно увеличивается с качеством входного РНК. Используя этот протокол , установленный, был получен хороший и высоко воспроизводимое качество РНК для различных стадий развития женских репродуктивных тканей и зародышевой в Arabidopsis и Boechera (например, рисунок 4). В то время как метод применимтакже для более отдаленное родственных видов (например, томат, неопубликованные данные ), то необходимо принимать во внимание , что небольшие оптимизации или модификации , которые могут потребоваться в зависимости от вида, типа ткани, и даже лабораторных условиях , как, например, высокая влажность может поставить под угрозу целостность РНК в процессе подготовки слайдов и LAM.
Важным шагом в процессе протокола является монтаж разделяемую восковых полосок, содержащих образцы к слайдам. Здесь, в частности, контакт с водой является важным шагом. При замене воды от этанола не приводит к какой-либо значительному улучшению целостности РНК после выделения (неопубликованные данные), замена воды метанолом делает. Тем не менее, метанол следует обращаться только под капотом химического и с большой осторожностью. В зависимости от типа образца, в качестве альтернативы использованию метанола, время сушки после монтажа с водой может быть уменьшено до ~ 2 ч (см 3.3.3.1), в результате чего в равной степени хорошим качеством РНК.Выполнение испытание, чтобы проверить качество РНК достигается за счет монтажа либо на воде или метаноле для типа клеток и видов, представляющих интерес, рекомендуется в начале нового проекта.
LAM это мощная технология для транскрипционные Анализы
В заключение, мы успешно оптимизированы и применили комбинацию LAM и типа клеток конкретного анализа транскриптома по микрочипов и РНК-Seq к различным клеткам сексуального и апомиктическому зародышевой линии в Резуховидка Таля и в Boechera SPP., Что позволяет сравнительный транскрипционные анализы (смотрите также рисунок 5) 7,11,13,14. Описанный способ имеет ряд преимуществ по сравнению с другими технологиями, позволяющими типоспецифической клеточный транскрипционный анализ. Важно отметить, что в зависимости от узнаваемости типов клеток или тканей, представляющих интерес в секции, он может быть применен к редких типов клеток как в моделии не модельные виды, такие как клетки зрелого женского гаметофита в Boechera SPP., или может даже быть использован для выделения клеточных доменов, например, полярные половины клеток 19. Подобные приложения не было бы возможно с другими методами , которые полагаются на флуоресцентной активированный сортировки клеток или ядер (FACS / веера) 10.
Основным недостатком этого метода является требование времени. В то время как фиксация и вложение не требует длительного практического времени и может одновременно было сделано для большого количества цветов, LAM как таковой очень много времени, и для анализа типа конкретных клеток, как правило, 3 дней до 3 недель LAM (в среднем 5 часов в день на лазерного микроскопа) необходимо планировать. В связи с этим, было бы полезно сделать некоторые предварительные тесты на скорости выделения конкретного типа клеток целевой правильно спроектировать исследование. Кроме того, даже при использовании этого оптимизированный протокол, испытания для проверки качества РНК высоко повторнопохвал.
Таким образом, LAM является мощным инструментом для анализа транскрипционных при разрешении отдельных типов клеток или даже поддоменов клеток, которые не могут быть достигнуты с использованием альтернативных существующих методов. В связи с этим, он несет огромный потенциал , чтобы позволить анализы, например, процессов развития, с очень высоким временным и пространственным разрешением. Это было продемонстрировано на примере анализов Транскриптом клеток на всех ключевых стадиях сексуального и апомиктическому воспроизводства в Arabidopsis и Boechera 7,11,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).
