Introduction
Transcriptionele studies uitgevoerd op het weefsel niveau worden de transcriptomes zeer gespecialiseerde maar zeldzame celtypen vaak gemaskeerd door overvloediger omringende cellen. Een voorbeeld van zo'n gespecialiseerde celtypes zijn de cellen van de vrouwelijke reproductieve lijn (kiembaan) in planten. Het vrouwtje kiemlijn wordt opgegeven binnen de ontwikkeling van eitjes, de voorlopers van zaden binnen de gynoecium van de bloem 1,2. De megaspore moedercel (MMC) is de eerste cel van de vrouwelijke kiemlijn. Ondergaat meiosis een viertal verminderde megasporen vormen. Gewoonlijk slechts één van deze megaspores overleeft en scheidt mitotisch zonder cytokinese, dat wil zeggen in een syncytium. Deze mitosen worden gevolgd door cellularization aan de rijpe gametophyte, die meestal bestaat uit vier soorten cellen vormen: drie antipodals, twee synergid cellen, het ei, en de centrale cel. Het ei en de centrale cellen zijn de vrouwelijke gameten die krijgen bevrucht door twee zaadcellen tijdens double bevruchting aanleiding geven tot het embryo en endosperm van de zich ontwikkelende zaad 1,2 geven. In de seksuele modelsysteem Arabidopsis thaliana, alleen ~ 50 zaden ontwikkelen per bloem terwijl ongeveer 50-80 zaden ontwikkelen per bloem in het nauw verwante geslacht Boechera. Dus de vrouwelijke kiemlijn bestaat uit slechts enkele zeer gespecialiseerde celtypen, waardoor het een uitstekend model voor ontwikkelingsprocessen, zoals celspecificatie en differentiatie te bestuderen.
Bovendien kan inzicht in het gen regulerende processen die reproductie planten van de toegepaste waarde. In planten, kan zowel geslachtelijke en ongeslachtelijke voortplanting door middel van zaden (apomixis) optreden. Terwijl geslachtelijke voortplanting genereert genetische diversiteit in een populatie, apomixis leidt tot de vorming van klonale nakomelingen die genetisch identiek aan de moederplant. Daarom apomixis heeft een groot potentieel voor toepassingen in de landbouw en de productie van zaaizaad, want zelfs complexe moeder genotypen kanover meerdere generaties 3,4,5 ongewijzigd worden gehandhaafd. Omdat apomixis niet van nature voorkomt in alle belangrijke soorten gewassen, de engineering van apomixis in gewassen is van groot belang 3,4,5. Echter, deze lange-termijn doel is moeilijk te bereiken, omdat de onderliggende genetische en moleculaire basis van apomixis niet begrepen wordt in voldoende detail 6.
Om inzicht in de transcriptie basis betreffende apomictische reproductie, celtype-specifieke transcriptie profiling met behulp van laser-assisted microdissectie (LAM) en next generation sequencing (NGS) te krijgen is een zeer krachtige benadering 7,8. LAM eerst is vastgesteld voor dieren en biomedisch onderzoek. In de afgelopen jaren LAM is ook toegepast om te planten biologie 6,9,10. In tegenstelling tot andere systemen die een beoordeling van afzonderlijke cellen en weefseltypes, is LAM niet het genereren van markeerlijnen 6,9,10 vereisen. Daarom kan het appgelogen om een cel of weefsel type, zonder voorafgaande moleculaire kennis. Een ander voordeel van LAM is dat het kan worden toegepast op elk celtype mits de cel droge delen te herkennen op basis van de positie en / of structurele kenmerken. LAM heeft als bijkomend voordeel dat gefixeerde weefsels worden toegepast, waarbij afwijkingen van de transcriptionele profiel voorkomt tijdens de verwerking.
Het weefsel van belang, bijvoorbeeld bloemen weefsel wordt gefixeerd in een niet-verknopende fixatief voorafgaand aan inbedding in paraffine. Inbedding in paraffine kan handmatig worden gedaan, na vastgestelde protocollen 9,11. Het gebruik van een geautomatiseerde weefselprocessor voor dehydratatie en infiltratie van de was resulteert in het algemeen in hogere reproduceerbaarheid in termen van het behoud van kwaliteit en RNA weefselmorfologie. De alternatieve strategie voor het inbedden van weefsels in hars is ook met succes toegepast voor celtype-specifieke analyses van LAM 8. Het gebruik van een automated weefselprocessor voor het inbedden in was zeer tijdbesparend, zoveel monsters tegelijkertijd de vereiste minimale hands-tijdig kan verwerken. Hoewel meestal geen significant verlies van kwaliteit RNA optreedt tijdens fixatie en inbedding, de bereiding van dunne secties met de microtoom en in het bijzonder de montage op de frameslides voor LAM blijft een kritische stap voor het behoud van RNA kwaliteit. Dit werd eerder opgemerkt en het gebruik van een tape transfersysteem is beschreven leiden tot een betere kwaliteit RNA bij deze stap 12. Echter, dit geeft een additionele tijdrovende stap tijdens de bereiding van de glijbanen en vereist ook speciale apparatuur. De geoptimaliseerde protocol hieronder beschreven produceert reproduceerbaar RNA dat is van voldoende kwaliteit voor de transcriptie profilering met GeneChips en Next Generation Sequencing (NGS) benaderingen 7,11,13,14. Bovendien, met de laser microdissectie microscoop gebruikt, een hoge zuiverheid van de geïsoleerde celtypes is routinely geproduceerd 7,11,13,14.
Het geslacht Boechera is een uitstekend model voor het bestuderen van de belangrijkste stappen van apomictische reproductie. In Boechera, hebben verschillende seksuele en apomictische toetredingen geïdentificeerd en kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses 15,16,17. In een vergelijking van celtype-specifieke transcriptomes van cellen van de vrouwelijke kiemlijn van seksuele Arabidopsis en apomictische Boechera, we geïdentificeerde genen en van de wegen die differentieel uitgedrukt, waardoor nieuwe aspecten van de regulerende processen te identificeren met betrekking tot apomixis 7. Daarnaast is deze studie bevestigde de geschiktheid van LAM voor celtype-specifieke transcriptionele analyses van kleine en zeldzame celtypen. We hebben stond met het protocol voor de analyse van diverse celtypen in verschillende plantensoorten, maar soort- en weefsel-specifieke modificaties aan het protocol in bepaalde gevallen nodig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Dit protocol beschrijft weefsel voorbereiding, laser bijgestaan microdissectie en RNA-extractie voor transcriptie profilering. Gebruik handschoenen altijd in alle stappen van het protocol. Bestuderen en overwegen de veiligheidsvoorschriften voor elke chemische stof gebruikt. In het bijzonder, in gedachten houden dat Xyleen is gevaarlijk en kan handschoenen binnendringen en dat methanol is giftig. Voor alle instrumenten gebruikt, moet u daarom verwezen naar handleidingen.
1. Verwijdering van RNAse activiteit van glaswerk en andere apparatuur
- Voor gebruik omwikkel te glaswerk in aluminiumfolie vóór het bakken voor ~ 8 uur bij 180 ° C te garanderen vrije RNAse kwaliteit.
- Behandel metalen oppervlakken (bijvoorbeeld pincet) en de werkbank en de verwarmingsplaat met een geschikte RNase decontaminatie oplossing. Daarna was de oppervlakken met RNAse-vrij water aan de decontaminatie oplossing te verwijderen. Vervolgens, het reinigen van de oppervlakken verder met 70% EtOH.
- Gebruik alle plastic verbruiksgoederen (bijvoorbeeld tubes) gloednieuwe zonder enige voorbehandeling. Indien beschikbaar, gebruik plastic verbruiksgoederen die zijn gecertificeerd vrij te RNAse.
2. Tissue Fixatie
- Bereid 10 ml fixeermiddel landbouwer (3: 1, v / v ethanol: azijnzuur) in een verse 15 ml buis op ijs. (Altijd bereiden fixatief verse Farmer's voor gebruik). Als alternatief, de niet-verknopende fixatief ethanol: azijnzuur (5: 1, v / v) kan worden gebruikt 18.
- Gebruik een fijne pincet om knoppen te verzamelen in het ontwikkelingsstadium van belang. Onmiddellijk onderdompelen knoppen in het ijskoude fixeermiddel. Gebruik 10 ml fixeermiddel voor het fixeren van ~ 20 knoppen of bloemen uit Arabidopsis of Boechera. Opmerking: Bij gebruik plantensoorten met grotere bloemen wordt aanbevolen om de bloemen met een scheermesje ontleden tot kleinere stukken vóór fixatie genereren.
- Om volwassen gametofyten verkrijgen, castreren de 2-3 grootste bloemknoppen van de inflorescence 2 dagen voor de oogst.
- Vul onderaan een exsiccator met ijs. Open de buizen met de monsters, bijvoorbeeld, bloemen, en plaats ze op ijs, hetzij door direct gebruik te nemen ijs dat ze omvallen of door een geschikte houder. Vacuüm infiltreren gedurende 15 minuten voorafgaand aan de release van het vacuüm.
- Herhaal het vacuüm infiltratie eenmaal 15 min.
- Laat de stofzuiger en op te slaan 's nachts (~ 12 uur) op ijs. Bedek het ijs emmer met deksel of aluminiumfolie en bewaar de emmer in een 4 ° C kamer of koelkast om het ijs ontdooien te voorkomen. Let op: Verlengen van de fixatie tijd wordt niet aanbevolen.
3. Tissue Embedding, Thin Sectioning en Montage op Dia's voor LAM
- Tissue inbedding.
- Ruil de fixerende tot 70% ethanol bereid met pure ethanol en RNAse gratis water. Laat de monsters op ijs tot verdere verwerking. start embedding van de monsters dezelfde dag. In het geval dat er geen weefsel-machine beschikbaar is, ga dan naar manuele verankering zoals elders beschreven 9,11 en ga verder met stap 3.1.11.
- Voorzichtig de monsters overbrengen naar weefselverwerkingsproces cassettes met een pincet. Stevig sluiten van de cassettes. Kritische stap: Vermijd zelfs gedeeltelijk drogen van het monster tijdens deze stap. Vermijd knijpen monsters met de pincet.
Opmerking: Om de cassettes een potlood te gebruiken label, bij voorkeur door het schrijven op het hellende oppervlak van de cassette. - Bewaar de inbedding cassette geladen met de knop of bloem in 70% ethanol tot alle materiaal overgebracht naar cassettes en de inbedding machine kan worden geladen. Hiervoor gebruikt u een glas kleuring bak gevuld met 70% ethanol.
- Verwijder de korf van de weefselprocessor uit de retort van de machine en breng de inbedding cassettes de mand met de hellende oppervlakken tegenover de top en in dezelfde richting. CRICALE STAP: Voer deze snel één drogen van de weefsels te voorkomen. Indien voor vele inbedding cassettes tegelijk plaats het mandje in een geschikte vrije RNAse container gevuld met 70% ethanol voorafgaand aan het laden van de monsters.
- Doe de deksel op de mand en zet de mand terug in de retort. Sluit de retort.
Opmerking: Het weefsel processor ontwatert automatisch de monsters, verandert het oplosmiddel xyleen, en doet de infiltratie met gesmolten paraffine. Dit wordt typisch gedaan overnacht. - Start het programma van de weefselprocessor. Aanbevolen standaard instellingen 1 uur 70% EtOH, drie maal 1 uur 90% EtOH, drie maal 1 uur 100% EtOH, tweemaal 1 uur 100% xyleen, één keer 1 uur 15 min 100% xyleen bij kamertemperatuur, gevolgd door infiltratie met paraffine tweemaal gedurende 1 uur en één keer gedurende 3 uur bij 56 ° C 11.
Let op: Om ervoor te zorgen dat de blokkering station klaar is met de was gesmolten is, schakelt de machine in enkele uren voor aanvang ofGebruik daarom de timerfunctie om de geschatte starttijd te selecteren.
Opmerking: Als het weefsel niet onmiddellijk daarna mogelijk in plaats van de 3 uur verwerkt langere incubatietijden in paraffine bij 56 ° C worden bij 56 ° C. Raadpleeg de handleiding van het instrument. Doorgaans zal de cassettes met tissues automatisch blijven in gesmolten was, totdat het commando "lege retort" is goedgekeurd. Indien de was niet smelt bij het starten van de weefselprocessor, wordt de retort gevuld met 70% ethanol en het programma wacht blijft tot het moment van starten. - Legen retort en geeft de monsters over te brengen naar een paraffinewas bad bij 56 ° C in een blokkerende station. Verwijder het deksel van de mand en omvatten de paraffine bad van de blokkering station met het deksel.
- Paal veel verse balanceren trays op het oppervlak van de blokkering station verwarmd tot 56 ° C omdat er cassettes in de mand.
Opmerking: Een ethanol-resistente permanent marker kan worden gebruiktd onderaan het evenwicht trays labelen. Aceton-resistente permanent markers worden niet aanbevolen. - Met de blokkering station, vult een voorverwarmde verse plastic bakje evenwicht met gesmolten paraffine bij 56 ° C. Open de klep van het paraffinebad, neem een cassette slechts per keer en de monsters brengen van de cassettes tot de vloeibare paraffine bij 56 ° C in evenwicht openen via een pincet.
Kritische stap: Vermijd verharding van de wax rond het monster tijdens het hanteren van de cassette door snel te werken.- Plaats alle monsters volgens de behoeften met een preparaat naald vóór de uitharding van de was. Gewoonlijk worden meerdere bloemen in een afweging lade afzonderlijk afstand van ongeveer 1 cm in elke richting.
- Herhaal stap 3.1.9 totdat alle monsters worden overgebracht.
- Plaats de korf terug naar het weefsel processor en het reinigen van de retort met behulp van een passend programma (zie gebruiksaanwijzing).
- Schakel weefsel processor en het blokkeren station. Ga verder met stap 3.1.13.
- In het geval dat er geen weefselinfiltratie machine en geen inbedding station beschikbaar is, gebruik dan een verwarming oven voor op paraffine smelten bij 56 ° C. Op de bank, vul de gesmolten was in plastic trays balancing, de monsters over te dragen aan de was, en het gebruik van de voorbereiding naalden om de monsters te positioneren.
- Laat de paraffine uitharden bij kamertemperatuur gedurende ~ 1-3 uur alvorens de monsters bij 4 ° C. Monsters kunnen vervolgens worden vers verwerkt of opgeslagen tot enkele maanden.
- Voorbereiding van de dunne secties en dia's voor LAM.
- Op een lichte tafel het verlichten van de wax blok van onderen, verwijder de paraffine met de monsters uit de omringende plastic trays. Ontleden uit een vierkante wax blok met het weefsel, bijv., Een knop of een bloem, met behulp van een RNAse gratis scheermesje. Hiertoe altijd oriënteren de monsters naar de bovenkant van het wasblok (zie
- Bereid paraffineblokjes van alle monsters die moeten worden gebruikt voor LAM tegelijk.
- Op een lichte tafel het verlichten van de wax blok van onderen, verwijder de paraffine met de monsters uit de omringende plastic trays. Ontleden uit een vierkante wax blok met het weefsel, bijv., Een knop of een bloem, met behulp van een RNAse gratis scheermesje. Hiertoe altijd oriënteren de monsters naar de bovenkant van het wasblok (zie
- Monteer de blokken te verwerken inbedding cassettes gevuld met geharde paraffine: smelten van een stukje of druppel paraffinewas op het uiteinde van een passende spatel met een Ethanol lamp en gebruik de hete was om het blok vast op de drager (met de ingebedde weefsels bovenop).
- Laat de wax uitharden gedurende ten minste 20 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder overtollige wax rond het monster met een scheermesje het licht aan tafel. Zorg ervoor dat u een vierkant oppervlak te houden met parallelle randen (zie figuur 1).
- Zet de verwarming plaat tot 42 ° C.
- de monsters veilig te monteren op het microtoom en voor te bereiden 6 - 10 pm dikke secties. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het gebruik van het microtoom. Opmerking: Tijdens dunnere secties zullen geven vaak betere structurele resolutie, grotere hoeveelheid RNA van higher kwaliteit kan worden verkregen met dikkere secties. Voor de cellen van Boechera rijpen gametophytes gebruiken we 7 urn als de standaard. Bewegende eerder traag met de monsters over de microtoom mes vaak resulteert in een betere histologie.
- overdracht altijd de paraffine linten met een lengte van ongeveer 10 - 15 cm in een plastic doos met een zwarte kartonnen onderaan voor hun positionering in LAM slides.
- Indien mogelijk, pre-selecteert u de delen van de paraffine stroken met de cel- of weefsel vormen van belang, bijvoorbeeld, eitjes, in het kader van een dissectie-scope en gooi de rest.
- Plaats de benodigde hoeveelheid metalen frame slides (kenmerkend 5-10) met de vlakke top van de verwarmingsplaat.
- Pipet ~ 1-2 ml RNAse vrij water op het plastic deel van de schuif. Met behulp van een scheermesje, snijd de paraffine linten in korte stukjes van ongeveer 4-5 cm lang genoeg om de kunststof ramen overspannen. Use een pincet en een preparaat naald idealiter plaats de paraffine stroken parallel aan elkaar op de kunststof ramen van de glijbanen. Til de schuif aan de ene kant om het water te verwijderen en de dia's terug.
- Als alternatief, zet de verwarming plaat onder een chemische motorkap. Breng een kleine hoeveelheid methanol om het kunststof gedeelte van de schuif juist voldoende om het oppervlak nat (dit kan een lichte golving van de schuiven veroorzaken). Plaats de paraffine strips op de glijbaan.
Opmerking: Omwille van de toxiciteit, vermijd het gebruik van methanol, indien mogelijk. Het gebruik van methanol bij deze stap verbetert wel de RNA-kwaliteit bij de resultaten die bij montage op waterkwaliteit niet voldoende. Het is zinvol testen van deze alternatieven bij de start van een nieuw project, zoals de RNA kwaliteit bereikt afhankelijk van celtype en soorten onderzocht.
- Als alternatief, zet de verwarming plaat onder een chemische motorkap. Breng een kleine hoeveelheid methanol om het kunststof gedeelte van de schuif juist voldoende om het oppervlak nat (dit kan een lichte golving van de schuiven veroorzaken). Plaats de paraffine strips op de glijbaan.
- Droog de glaasjes nachts op de verwarmingsplaat bij 42 ° C gedurende ~ 12 uur. Bedek de verwarming plaat meteen plastic deksel dat de dia's niet raakt. Zorg ervoor dat het plastic deksel van de uitwisseling van lucht niet te voorkomen. Om dit doel het deksel op pipet dozen of soortgelijke kan worden geplaatst om te worden opgeheven.
- Alternatief verminderen de droogtijd minimaal twee uur of totdat het weefsel volledig droog weergegeven. De vermindering van de tijd van het snijden aan collectie kan RNA kwaliteit te verbeteren.
- Onder een chemische motorkap, de-wax de dia's 2 keer voor 10 min in Xyleen met behulp van geschikte dia houders. Zorg volledig onderdompelen plastic gedeelte van elke dia alleen maar om verwijdering van de schuif mogelijk door op het bredere einde van het metalen frame, dat droog wordt gehouden.
- Laat de dia's drogen ~ 10 minuten onder de chemische motorkap voorafgaand aan LAM.
Noot: Slides niet direct verwerkt kunnen met deze verwarmingsplaat geplaatst bij 42 ° C met het weefsel omhoog tot enkele uren. Zo voorkomt u dat vocht uit te boeten RNA kwaliteit tot verdere verwerking.
4. Laser bijgestaan Microdissection (LAM)
Opmerking: De procedure voor LAM zal variëren met het gebruikte instrument. Bepaalde details van dit protocol zijn aangepast aan een specifiek instrument en de technologie van het verzamelen van de monsters op een cap gebruik te maken van elektrostatische krachten. Bovendien kan details verschillen zelfs tussen verschillende versies van de software. Raadpleeg de instructies van de fabrikant en de gebruiker handboeken voor een gedetailleerde beschrijving en specifieke instructies over het instrument en de software.
- Schakel de inrichtingen voor LAM (computer, microscoop, laser bedieningskast).
- Start het programma sturen van de microscoop en laser.
- Schakel de laser door op de corresponderende knop op de schakelkast.
- Plaats een dop (0,5 ml, zonder diffusor) in de dop houder en plaats deze in het instrument.
- Steun de LAM dia met een glasplaatje voor microscopie. Zorg ervoor dat het vlakke oppervlak van de dia met deweefsel bevestigd wordt geconfronteerd met de glasplaatje.
- Plaats de dia in het instrument met het glaasje eronder.
- Selecteer de 4X Doelstelling. In het programma, selecteren om de kap van de positie "up" te verplaatsen en ga verder met een scan van de dia te maken.
- Doorzoek de glijbaan en identificeren van de structuren van belang. Identificeren en hun posities besparen op de slede te kunnen terug naar de juiste positie voor de snijstap.
- Selecteer het juiste doel (bijv 40X of 60X).
- Indien nodig, aan te passen laser snelheid, focus en laservermogen, en ook het podium beweging kalibreren door te verwijzen naar de gebruiksaanwijzing van het instrument. Zodra een account is ingesteld voor het specifieke weefsel van belang, kunnen de instellingen worden hergebruikt.
- Controleer de laserpositie door een enkel schot door op de "laser shot" knop van het programma, bij voorkeur in een gedeelte van het membraan zonder weefsel.
- Indien nodig, kalibreren de laser positie door het volgen van thinstructies e van de fabrikant voor het instrument.
- Controleer de kalibratie van het doel door het bewegen van een duidelijke structuur aan alle vier de hoeken van de software venster op de monitor, het bijhouden van de rechter muisknop ingedrukt. Controleer of de positie van de hand ten opzichte van de hand liggende structuur is hetzelfde in alle vier hoeken. Anders de doelstellingen volgens de softwarehandleiding kalibreren.
- Met de dop in de 'down' positie, gebruik maken van de 'kant-pen' tool om de grenzen van het type cel of weefsel van belang, bijvoorbeeld, de eicel te markeren. Ontleden de cel van belang met de laser door op 'cut'. Opmerking: Vaak snijden moet worden herhaald als de rand om de cel niet geheel ontleed tegelijk. In dit geval wordt aanbevolen om de software automatisch doen twee herhalingen van de sectie als norm.
- Til de kap en ga naar de volgende opgeslagen positie met de structuur van belang. Herhaal stap 4.13van de procedure om de volgende cel delen ontleden totdat alle cellen van belang van de ene dia worden verzameld. Zorg ervoor dat de kap is geplaatst op een manier die het nieuwe gedeelte vasthoudt aan een lege positie op de dop.
Opmerking: Het wordt aanbevolen om grotere stukken van de weefsels te isoleren (bijvoorbeeld delen van de hele bloemen of delen ervan) van elke dia na de isolatie van enkele cel secties op een verse dop. Deze kunnen worden gebruikt voor RNA-kwaliteitscontrole. - Verwijder de glijbaan en ga verder met de volgende dia door het herhalen van de stappen 4,4-4,9 en 4,13-4,14.
- Herhaal stap 4.15 en aanverwante stappen totdat de celtypen van interesse van alle dia's zijn geïsoleerd. Opmerking: Het is niet aan te raden om te oogsten langer dan ~ 4-5 uur op dezelfde dop.
- Visueel te inspecteren de dop oppervlak nadat LAM om niet-specifieke verontreinigingen van het monster uit te sluiten. Terwijl de niet-ontleed weefsels worden beschermd door de folie, kan stof vasthouden aan de oppervlakte door elektrostatische hechting.
- To visueel de dop, verwijder de dia uit het instrument. Plaats de dop houder in de stand 'down' en inspecteren van het oppervlak met de 4X doelstelling.
- In het geval van kleine stukjes stof zichtbaar zijn, verwijder ze met een kleine (2 pl) pipetpunt. Als alternatief, zet de schuif terug op het instrument, plaats de dop op een vrij deel van de schuif (geen weefsels) en de verontreiniging met behulp van de laser volledig te vernietigen.
- Sluit caps en vries de droge secties bij -80 ° C tot verder gebruik. Desgewenst kunnen monsters gedurende verscheidene weken. Echter, gaan snel in deze stap wordt aanbevolen.
5. RNA isolatie en Quality Control
Opmerking: RNA kan geïsoleerd worden met elke werkwijze geschikt voor kleine hoeveelheden RNA. In dit protocol het gebruik van een RNA isolatie kit die voor kleine hoeveelheden RNA wordt beschreven. Volg de instructies van de fabrikant.
- Gebruik de buizen met het monster vastgemaakt aande kap direct of na verwijdering van -80 ° C.
- Open de tubes en voorzichtig pipet 11 pi extractiebuffer aan de wand van elke buis met behulp tipjes. Verander tips tussen de monsters.
- Sluit het deksel en schud de extractiebuffer tot aan de dop van de buis.
- Plaats de buizen met de dop in een verwarmingsoven voorverwarmd op 42 ° C. Incubeer gedurende 30 min de instructies van de fabrikant.
- De instructies van de fabrikant voor bereiding kolom en het extract verzamelen op de bodem van de buisjes.
- Als materiaal van meerdere maximum te worden gecombineerd tot één monster, verder met de stappen 5.1.1 - 5.1.2 afzonderlijk voor elke buis / cap.
- Daarna pool de extracten voor een monster in een buis en meet de hoeveelheid samengevoegde extract met een pipet voor toevoegen van een equivalente hoeveelheid EtOH (zie instructies van de fabrikant).
- Zorg ervoor dat het bedrag van EtOH toegevoegd voordat de kolom gelijk is aan het volume van de samengevoegde extract.
- Na RNA precipitatie met EtOH, gaat snel om het laden van de kolommen volgens de instructies van de fabrikant. Ga door het protocol met de 100 XG centrifugeren stap.
- Nadat de inhoud van elke verzamelbuis zijn door de kolom gepasseerd, voeren een 16.000 xg centrifugatiestap gedurende 30 seconden de aanwijzingen van de doorstroming na fabrikant verwijderen.
- Ga verder met RNA extractie en zuivering volgens de instructies van de fabrikant.
- Na het laden van de elutiebuffer aan de kolom zodat de kolom incuberen 1 min. Blijf de buizen in de centrifuge volgens de instructies in de instructies van de fabrikant te laden. Opmerking: Een extra centrifugatiestap gedurende 1 min bij 100 xg voorafgaand aan elutie zoals in het protocol kan de efficiëntie van elutie verhogen.
- Uittreksel RNA uit de contRols (grotere weefselcoupes) voor RNA-kwaliteitscontrole volgende stappen 5.1 tot en met 5.2.7 van dit protocol.
- Voor RNA kwaliteitscontrole lading 1 ui onverdunde totaal RNA van elk controlemonster op de Bioanalyzer met een RNA Pico Chip de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Het geëxtraheerde RNA kan worden gebruikt voor lineaire amplificatie en transcriptoom analyse door middel microarrays of RNA-Seq 7,11,13,14. Idealiter zou de kwaliteitscontrole geven een RNA integriteit Number (RIN) van ten minste 7. Een aantal leveranciers geschikte kits voor amplificatie worden geschikte voorbeelden gegeven 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monstervoorbereiding en LAM worden gedaan in opeenvolgende stappen
Een aantal opeenvolgende stappen vereist RNA bereiden transcriptionele analyse van geselecteerde celtypen door LAM (figuur 1). Dit begint met de oogst van de bloemen en onmiddellijke fixatie dat de RNA populatie ongewijzigd blijft na de oogst. Het weefsel is ingebed, coupes, en gemonteerd op dia's. Hierdoor kan de isolatie van de cellen door LAM en de uitwisseling van celtype-specifieke secties in één of meerdere caps (figuur 1). Het materiaal kan vervolgens worden ingevroren of direct verwerkt door RNA extractie. Naast het voordeel van LAM toepasbaar voor celtype-specifiek analyses in zowel model en nietmodelproducten diersoort, wijze blijft vrij tijdrovend. Ten minste één week van de arbeidstijd, soms meer, is nodig voor de stappen van tissue oogst RNA-extractie (figuur 1). Er moet rekening die vaak gedeelten geoogst meerdaagse hefboommechanisme zijn samengevoegd in een biologisch monster en RNA-extractie te nemen. Voor Boechera eicellen, is het gebruik van ten minste ~ 200 delen per monster sterk aanbevolen, met tot ~ 100 punten per dag geïsoleerd.
Isolatie van de Cell Soorten rente hangt af van hun zichtbaarheid in Dry Secties
Isolatie van het celtype-specifieke gedeelten is de meest tijdrovende stap van het protocol. Tot dusver is geen automatisering van deze stap ontwikkeld vanwege de complexe aard van de monsters. De identificatie van de cellen plaats met behulp van een software tool niet toelaat de droge gedeelten weinig contrast en het doorsnedevlak varieert tussen de monsters als gevolg van het feit dat eitjes zijn georiënteerd onder verschillende hoeken wedurende het weefsel (Figuur 2). Toch is de unieke morfologie van het rijpe vrouwelijke gametofyt met synergiden, eicel en centrale cel (antipodal cellen degenereren voor de bevruchting) kan de ondubbelzinnige identificatie van de eicellen die de onderzoeker (Figuur 2B, C, figuur 3). Inderdaad, in Boechera divaricarpa de eicel krimpt vaak wat tijdens bereiding en scheidt van de omringende weefsels, een eigenschap voordelig voor de isolatie van eicel populaties met hoge zuiverheid (figuur 2B, C, figuur 3) aldus.
Visuele inspectie van het GLB na LAM is Aanbevolen
Visuele inspectie van de dop oppervlak nadat LAM maakt de identificatie van de eventuele verontreinigingen van het monster, bijvoorbeeld door stof. Bovendien is het nuttig dat de SECTIES vasthouden aan de dop, want af en toe delen verdwalen tijdens de procedure. Typisch vele geselecteerde secties, bijvoorbeeld, eicellen, te zien op één GLB na enkele uren LAM.
De Gevestigde Workflow Results reproduceerbaar in Goede RNA Quality
Van celtype-specifieke LAM isolaties van vrouwelijke gametofyten, totaal RNA bedragen zijn alleen in het lage ng bereik. Deze beperkende hoeveelheid RNA noopt tot een representatieve controle geïsoleerd uit weefsels grotere elk glaasje als benadering voor RNA kwaliteitscontrole na LAM te gebruiken. Dit blijkt uit een vergelijking van celtype-specifiek RNA van B. divaricarpa eicellen in vergelijking met controles van grote weefselgebieden geïsoleerd uit dezelfde dia, wat aangeeft vergelijkbare kwaliteit RNA (Figuur 4A, B). Met behulp van deze methode, een goede tot hoge RNA kwaliteit met RIN nummers & #8805; 7 is reproduceerbaar verkregen. Het RNA kwaliteit bereikt was geschikt voor celtype-specifieke RNA-Seq, wat leidt tot de identificatie van 236 genen tot expressie gebracht in het apomictische eicel maar niet in het apomictische centrale cel, synergid cel of apomictische initiële cel, noch in de cellen of de volwassen seksuele gametophyte van Arabidopsis thaliana (Figuur 5) 7.
Figuur 1:. Schema van de Stappen van het protocol, met vermelding van de minimale tijd die nodig is per stap Bevestiging van de bloemen of weefsels van belang wordt 's nachts uitgevoerd. De volgende dag wordt inbedding gestart, dat wil zeggen gedurende de nacht waardoor ingebedde materiaal op dag 3 van het protocol. Op dag 3 microtome secties vanaf ingebed monsters in wax blokken kunnen worden gegenereerd. De linten van de dunne paraffine secties zijn gemonteerd op objectglaasjes en gedurende de nacht drogen. Ope verscheidene dagen hefboommechanisme is vereist om voldoende materiaal te verkrijgen voor één biologische repliceren. Na RNA-isolatie en kwaliteitscontrole, kan de bibliotheek de voorbereiding van RNA-Seq worden uitgevoerd om transcriptoom analyse te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: eicellen zijn duidelijk herkenbaar in slijpplaatjes, Als gevolg van de kenmerkende morfologie van de Vrouw gametofyt (A) Schematische tekening van de volwassen vrouwelijke gametophyte (Polygonum type) (B - C) Dunne secties door middel van eitjes herbergen vrouwelijke gametophytes in.. Boechera divaricarpa. Eicellen zijn duidelijk zichtbaar. Door de morfologie van de vrouwelijke gametofyt vaak niet alle celtypen (eicel: e, synergiden: s, Centrale cel: cc) zijn zichtbaar in één sectie. Schaal bars = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. LAM van eicellen van Boechera divaricarpa. A en C. Sectie van de volwassen gametophyte van B. divaricarpa 7 urn vóór en, B en D, na microdissectie met de laser apparaat (eicel: e, synergiden: s, centrale cel: cc). Schaal bars = 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
<strong> Figuur 4. RNA Kwaliteit van Laser ontleed eicellen en controle afdelingen. (A) RNA kwaliteit als geanalyseerd vanuit eicel secties ten opzichte van (B) groter weefsel gebieden geoogst van dezelfde dia's als controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Identificatie van genen alleen tot expressie gebracht in apomictische eicel vergelijking met de cellen van apomictische en geslachtsrijp gametofyten of apomictische Initial Cell. Temperatuurkaart van 236 genen tot expressie gebracht in apomictische de eicel maar niet in het centrale apomictische cel, cel synergid of apomictische initiële cel van B. gunnisoniana noch de cellen van het rijpe seksuele gametophyte A. thaliana 7 Hierarchicalclustering van monsters en genen gebaseerd op de Euclidische afstand en hiërarchische agglomeratieve clustering. Rood geeft hoge expressie en zwarte lage expressie. Kleuren worden geschaald per rij. apo:. apomictische Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol is geschikt voor verschillende cel- en weefseltechnologie Types
LAM gecombineerd met transcriptoom analyse van microarrays of RNA-Seq is een waardevol instrument om inzicht te krijgen in de specifieke patronen van de activiteit van genen reguleren ontwikkelings- of fysiologische processen 7-11,13,14 krijgen. De geschiktheid van deze methode voor een bepaalde celtype kritisch afhankelijk structurele problemen. De cel moet duidelijk zichtbaar en ondubbelzinnig geïdentificeerd in de droge gedeelten voor LAM worden. In Boechera divaricarpa, de morfologie van de gametofyt maakt een gemakkelijke identificatie van de eicel (figuur 2, figuur 3). Uiteindelijk, de snelheid van isolatie van een specifieke celpopulatie hangt ook af van de frequentie waarmee het celtype te vinden op een slede, het uitwisselen en opvragen slides nieuwe glijbanen zijn tijdrovende stappen. Aangezien afhankelijk van het celtype, tenminste 200-250 cell sectionen worden gebundeld per monster, de geschiktheid van de werkwijze voor een bepaald onderzoek ontwerp hangt grotendeels af van de tijd eisen voor LAM stap.
Bovendien, afhankelijk van de morfologie van het weefsel, kan het voordelig zijn qua structuur aan de dikte van de secties reduceren tot 6 urn. Ook dikkere gedeelten van ideaal ≥ 8 urn meestal tot hogere hoeveelheden RNA en RNA van iets hogere kwaliteit van dezelfde hoeveelheid weefselsecties. 10 urn tot isolement van LAM mogelijk - bovendien moet de cellen van belang ten minste een diameter van 8 hebben.
In principe kan de beschreven protocol worden aangepast aan verschillende cel- en weefseltypes van ver verwante soorten. Echter, de RNA kwaliteit variëren zelfs tussen verschillende celtypen van dezelfde soort 7,10,13. Dit protocol is aangepast op basis van kleine en kritische celtypen. Derhalve kan nu worden toegepast op een broader scala van monsters zonder verdere aanpassingen. Lichte wijzigingen van het protocol zou niettemin gehouden, afhankelijk van het celtype en de soort onderzochte. Het is aanbevolen om eerst gebruik maken van zowel alternatieve fixatieven (zie protocol 1.1) bij het opzetten van de methode voor een nieuw soort of celtype voor een vergelijking van de morfologie en RNA kwaliteit.
In principe kan het protocol worden aangepast aan en trad op met verschillende instrumenten die geschikt zijn voor laser microdissectie 9. Er moet echter worden opgemerkt dat de instrumenten variëren zowel laservermogen en de minimale breedte van de laserbundel die kunnen worden toegepast, alsook in de technologie van bemonstering. Vooral voor de isolatie van cellen en kleine weefselgebieden, lasers daardoor smal pad laser beter geschikt. De laserstraal van het instrument die we gebruiken is vrij fijn (~ 1 micrometer breed) en maakt dissectie van kleine cellen. De bemonstering technologie van het verzamelen van de celIs op een plak dop oppervlak door elektrostatische adhesie is bijzonder voordelig voor kleine celtypes en de isolatie van afzonderlijke celsecties. Dit minimaliseert het risico van monster verlies door elektrostatische effecten.
Het RNA Quality Verkregen is belangrijk voor de verdere Transcriptionele Analyses
Een van de belangrijkste punten voor een succesvolle RNA-Seq bibliotheek preparaat RNA kwaliteit. Terwijl meerdere aanbieders van amplificatie kits geoptimaliseerd hun technologie voor RNA van nog lagere integriteit, de kwaliteit van het na transcriptoom verkregen met elk microarrays of RNA-Seq data typisch toeneemt met de kwaliteit van de input RNA. Met deze vastgesteld protocol, goed en zeer reproduceerbare RNA kwaliteit voor verschillende ontwikkelingsstadia van de vrouwelijke reproductieve weefsels en de kiemlijn in Arabidopsis en Boechera werd verkregen (bijvoorbeeld figuur 4). Terwijl de methode van toepassingook minder nauw verwante soorten (bijvoorbeeld tomaat, ongepubliceerd), moet rekening worden gehouden dat kleine optimalisaties of aanpassingen kunnen vereist zijn afhankelijk van de soort, weefseltype, en zelfs de laboratoriumomgeving zoals bijvoorbeeld een hoge luchtvochtigheid misschien RNA integriteit in gevaar brengen tijdens dia voorbereiding en LAM.
Een kritische stap in het protocol is de montage van de doorsnede wax strepen met de monsters op de objectglaasjes. Hier, in het bijzonder het contact met water is een kritische stap. Het vervangen van water door EtOH niet resulteert in een significante verbetering van RNA integriteit na isolatie (niet gepubliceerd), heeft de vervanging van water door methanol. Echter, methanol mag alleen onder de motorkap chemische en zorgvuldig behandeld. Afhankelijk van het type monster, als alternatief voor het gebruik van methanol, kan de droogtijden na montage met water verlaagd tot ~ 2 uur (zie 3.3.3.1), wat resulteert in even goede kwaliteit RNA.Het uitvoeren van een proef om het RNA kwaliteit bereikt door monteren hetzij water of methanol voor het type en van belang zijnde species cel testen wordt aanbevolen bij aanvang van een nieuw project.
LAM is een krachtige technologie voor Transcriptionele Analyses
Tot slot hebben we met succes geoptimaliseerd en paste de combinatie van LAM en celtype-specifieke transcriptoom analyse van microarrays en RNA-Seq aan verschillende cellen van de seksuele en apomictische kiemlijn lineage in Arabidopsis thaliana en Boechera spp., Waardoor vergelijkende transcriptie analyses (zie ook figuur 5) 7,11,13,14. De beschreven werkwijze draagt een aantal voordelen ten opzichte van andere technologieën voor celtype-specifieke transcriptionele analyse. Belangrijk, afhankelijk van de herkenbaarheid van de celtypen of weefsels van belang in het gedeelte kan worden toegepast zeldzame celtypen van beide modelen nietmodelproducten soorten, zoals de cellen van het volwassen vrouwelijke gametofyt in Boechera spp., of kan zelfs worden gebruikt om cellulaire domeinen, bijvoorbeeld polaire helften van cellen 19 te isoleren. Soortgelijke toepassingen zou niet mogelijk zijn met andere werkwijzen die berusten op fluorescentie geactiveerde sortering van cellen of kernen (FACS / ventilatoren) 10.
Een belangrijk nadeel van deze methode is de vereiste tijd. Terwijl de fixatie en inbedding vereist geen uitgebreide test uit te voeren en tegelijkertijd gedaan voor een grote hoeveelheid bloemen, LAM als zodanig is zeer tijdrovend en voor een celtype-specifieke analyse, gewoonlijk 3 dagen tot 3 weken LAM (gemiddeld 5 uur per dag bij de lasermicroscoop) moet worden gepland. In dit verband is het nuttig om een aantal pre-tests voor de snelheid van de isolatie van specifieke celtype gericht op de studie adequate opzet. Bovendien, zelfs bij gebruik van dit protocol geoptimaliseerde proeven die het RNA kwaliteit zijn zeer opnieuw testengeprezen.
Samengevat, LAM is een krachtig hulpmiddel voor de transcriptionele analyse op de resolutie van afzonderlijke celtypen of subdomeinen van cellen, die niet kan worden bereikt met alternatieve bestaande methoden. In dit opzicht draagt enorm potentieel om analyse mogelijk te maken, bijvoorbeeld van ontwikkelingsprocessen, met een zeer hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Dit werd geïllustreerd door de analyse van de transcriptoom van cellen op alle belangrijke stappen van seksuele en apomictische reproductie in Arabidopsis en Boechera 7,11,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).
