Introduction
조직 수준에서 수행 전사 연구에서 매우 전문화하지만 희귀 세포 유형의 전 사체는 종종 더 풍부 주변 세포에 의해 마스크된다. 이러한 고도로 전문화 된 세포 유형에 대한 예는 식물에서 여성의 생식 계통 (생식 세포)의 세포이다. 여성 생식 계열은 꽃 1, 2의 gynoecium 내부 개발 난자 내 씨의 전구체를 지정합니다. megaspore 모 세포 (MMC)는 여성 생식계의 첫번째 셀이다. 그것은 감소 megaspores의 테트라을 형성하는 감수 분열을 거친다. syncytium에, 즉, 일반적으로 이러한 megaspores 중 하나만이 살아과 세포질 분열없이 mitotically 나눕니다. 세 antipodals 두 synergid 세포, 난자, 중앙 셀 : 유사 분열이 전형적으로는 네 종류의 세포로 구성된 성숙 배우체를 형성 cellularization 뒤 따른다. 계란과 중앙 세포는 DOU 동안 두 개의 정자 세포에 의해 수정 된 얻을 여성의 생식있다BLE 시비 현상 시드 1,2 배아 및 배유을 야기한다. 80 씨앗 밀접한 관련 속 Boechera에 꽃 당 개발 - 약 50 동안 성적 모델 시스템 애기 장대에서 만 ~ 50 씨앗은 꽃마다 개발한다. 따라서 암컷 생식선은 휴대 사양과 분화 발달 과정 등을 연구하는 우수한 모델을 만드는 몇 매우 특별한 종류의 세포로 구성된다.
또한, 식물의 재생을 지배하는 유전자 조절 과정에 대한 통찰력은 응용 가치가있을 수 있습니다. 식물, 씨앗 (무수정 생식)을 통해 모두 성적과 무성 생식가 발생할 수 있습니다. 유성 생식은 인구의 유전 적 다양성을 생성하는 동안, 어머니 공장에 유 전적으로 동일 클론 자손의 형성에 리드를 무수정 생식. 따라서, 무수정 생식은 복잡한 산모의 유전자형이 할 수있는, 농업과 종자 생산에 응용 프로그램에 대한 큰 잠재력을 가지고여러 세대 3,4,5를 통해 변경되지 않은 유지 될 수있다. 무수정 생식 자연스럽게 주요 작물에 발생하지 않기 때문에, 작물의 무수정 생식의 공학은 큰 관심의 3,4,5이다. 그러나, 이러한 장기 목표 무수정 생식의 근본적인 유전 및 분자 기초는 충분히 상세히 6에서 이해되지 않기 때문에 달성하기 어렵다.
레이저를 이용한 미세 절제 (LAM) 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 apomictic 재생, 세포 유형 특정 전사 프로파일 링을 지배하는 전사 기준에 대한 통찰력을 확보하는 것은 매우 강력한 방법 7,8를 나타냅니다. LAM 먼저 동물과 생물 의학 연구를 위해 설립되었습니다. 지난 몇 년 동안 LAM은 식물학 6,9,10 적용되었다. 개별적인 세포 및 조직 유형의 프로파일을 허용하는 다른 방법들과 대조적으로, LAM 마커 라인 6,9,10의 생성을 필요로하지 않는다. 따라서, 애플리케이션이 될 수있다이전 분자 지식없이 세포 또는 조직 유형에 거짓말. LAM의 또 다른 장점은 셀이 위치 및 / 또는 구조적 특성에 기초하여 건조 부에서 인식 될 수있는 것이 긴 어떠한 세포 유형에 적용 할 수 있다는 것이다. LAM은 처리 중에 전사 프로파일의 변화를 방지 고정 조직을 사용하는 추가적인 장점을 갖는다.
관심, 예를 들어, 꽃 조직의 조직은, 이전에 파라핀 왁스에 매립 비 가교 고정액에 고정되어있다. 파라핀 왁스에 포함 설립 프로토콜 9,11 다음, 수동으로 수행 할 수 있습니다. 그러나, 왁스의 침투와 탈수를위한 자동 조직 프로세서의 사용은 일반적으로 RNA 품질 및 조직 형태의 보전의 관점에서 높은 재현성을 초래한다. 수지 조직을 포함하는 대안의 전략은 성공적 LAM 8 세포 유형 특정한 분석을 위해 사용되어왔다. 그러나, 자동 게이트의 사용많은 샘플 일단 시간의 실질적인 최소 요구 처리 될 수있는 왁스 매립 ated 조직 프로세서는 시간이 매우 효과적이다. RNA의 질 전형적으로 상당한 손실이 고정 및 매립시 발생하는 동안, 마이크로톰 얇은 부분의 제조 및 특히는 LAM에 사용 frameslides에 장착하면 RNA 품질의 보존을위한 중요한 단계 남아있다. 이는 앞서 언급 한 내용 및 테이프 이송 시스템의 이용이 단계 (12)에서 더 RNA 품질 결과를 설명 하였다. 그러나,이 슬라이드의 제조시 추가의 시간 소모적 인 단계를 추가하고 또한 특별한 장치를 필요로한다. 설명 최적화 된 프로토콜은 재현성 GeneCHIPs 및 차세대 시퀀싱 (NGS)이 7,11,13,14 접근과 전사 프로파일에 충분한 품질의 RNA를 생성합니다. 또한, 사용되는 레이저 미세 절제 현미경 단리 세포 유형의 고순도 ROUT은inely은 7,11,13,14을 생산했다.
속 Boechera는 apomictic 재생의 주요 단계를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. Boechera에서, 상이한 성적 apomictic 가입 나 다양한 식별되고, 비교에 사용될 수 15, 16, 17은 해석한다. 성적 애기 장대와 apomictic Boechera에서 여성의 배아에서 세포의 세포 유형 별 전 사체의 비교에서, 우리는 이에 7 무수정 생식에 적용되는 규제 프로세스의 새로운 측면을 식별 차별적으로 발현되는 유전자와 경로를 확인했다. 또한,이 연구는 세포 유형 특이 적 전사 대 LAM의 적합성 작은 희귀 세포 유형의 분석을 확인 하였다. 이미 식물 종의 다양한 상이한 세포 유형의 분석이 프로토콜을 사용하지만, 종 - 상기 프로토콜 조직 - 특이 적 변형은 특정한 경우에 요구 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 :이 프로토콜은 조직 준비, 레이저를 이용한 미세 절제하고, 전사 프로파일 링을위한 RNA 추출을 설명합니다. 항상 프로토콜의 모든 단계에 걸쳐 장갑을 사용합니다. 연구 및 사용 된 각 화학 물질에 대한 안전 지침을 고려하십시오. 크 실롤은 유해와 장갑을 관통 할 수 있으며 메탄올은 독성이 있음을 특히 명심하십시오. 사용되는 모든 악기를 들어, 따라서 사용 설명서를 참조하시기 바랍니다.
유리 및 기타 장비에서의 RNAse 활동 1. 제거
- 사용하기 전에, 종래의 RNAse 무료로 품질을 보장하기 위해 180 ℃에서 ~ 8 시간 동안 소성을 알루미늄 호일에있는 유리를 바꿈.
- 금속 표면 처리 (예를 들어, 핀셋의 쌍)뿐만 아니라 워크 벤치와 적절한의 RNAse 오염 제거 용액을 가열 플레이트. 그 후, 제 염액을 제거의 RNA 분해 효소가없는 물을 가진 표면을 세척한다. 그 후, 70 % EtOH로 추가로 표면을 청소합니다.
- 모든 플라스틱으로를 사용하여틱 소모품 (예를 들어, 튜브) 아주 새로운 어떤 전처리없이. 가능한 경우, 무료의 RNase하는 인증 플라스틱 소모품을 사용합니다.
2. 조직 고정
- 농부의 고정액 10 ml의 준비 (3 : 1, v / V를 에탄올 : 아세트산) 얼음에 신선한 15 ML 튜브에. (항상 사용하기 전에 신선한 농부의 정착액을 준비). 다른 비 - 가교 고착성 에탄올 : 아세트산 (5 : 1, V / V) (18)를 사용할 수있다.
- 관심의 발달 단계에 꽃 봉오리를 수집하는 핀셋의 벌금 쌍을 사용합니다. 즉시 얼음처럼 차가운 정착액에 싹 잠수함. ~의 고정을 위해 애기 장대 또는 Boechera 20 싹이나 꽃을 고정액 10 ㎖를 사용하여 참고 :. 그 전에 고정에 작은 조각을 생성하는 면도날과 꽃을 해부하는 것이 좋습니다 큰 꽃과 식물 종을 사용하는 경우.
- inflor 3 큰 꽃 봉오리 - 성숙 배우체를 얻기 위해서는,이 무기력수확하기 전에 이일 escence.
- 얼음과 함께 습기 제거제의 바닥을 채우십시오. 직접 그들이 넘어 질 수없는 방법으로 얼음에 넣어 또는 적절한 홀더를 사용하여, 샘플, 예를 들어, 꽃이 들어있는 튜브를 열고 얼음에 배치합니다. 진공은 진공의 출시에 앞서 15 분 동안 침투.
- 15 분 동안 한 번 진공 침투를 반복합니다.
- 얼음에 진공 저장 하룻밤 (~ 12 시간)을 놓습니다. 뚜껑 또는 알루미늄 호일로 얼음 통을 덮고 해동에서 얼음을 방지하기 위해 4 ° C 형 방이나 냉장고에 양동이를 저장합니다. 참고 : 고정 시간을 연장하지 않는 것이 좋습니다.
3. 조직 임베딩, 얇은 단면 및 LAM을 위해 슬라이드에 장착
- 조직 삽입.
- 순수 에탄올과 RNAse가없는 물로 제조 70 % 에탄올에 정착액을 교환한다. 추가 처리 될 때까지 얼음에 샘플을 남겨주세요. embe 시작샘플 설정된 뒤 같은 날. 어떤 조직 가공 기계를 사용할 수없는 경우, 다른 곳에서 9,11 설명 된대로 수동 삽입으로 진행 단계 3.1.11를 계속합니다.
- 부드럽게 핀셋으로 조직 매립 카세트에 샘플을 옮긴다. 단단히 카세트를 닫습니다. 중요한 단계 :이 단계에서 시료의 경우에도 부분적인 건조를하지 마십시오. 핀셋으로 샘플의 압박하지 마십시오.
참고 : 이상적으로 카세트의 경사면에 작성하여, 연필을 사용해야 카세트 레이블을 지정하려면. - 모든 재료가 카세트에 전송되고, 내장 시스템이로드 될 때까지 70 % 에탄올의 싹이나 꽃으로로드 삽입 카세트를 저장합니다. 이를 위해, 70 % 에탄올로 채워진 유리 염색 통을 사용한다.
- 기계의 증류기에서 티슈 프로세서의 바스켓을 제거하고 상부에 대향하는 경사면과 동일한 방향으로 바구니 매립 카세트 옮긴다. CRI광 케이블 (optical) 단계 : 조직의 건조를 방지하기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다. 한 번에 여러 삽입 카세트를 처리 할 경우, 이전에 샘플을로드에 70 % 에탄올로 가득 적절한 RNAse가없는 용기에 바구니를 배치합니다.
- 바구니에 뚜껑을 넣고 레토르트에 다시 바구니를 넣어. 레토르트를 닫습니다.
참고 : 조직 프로세서가 자동으로 샘플을 탈수 크 실롤에 용매를 변경하고, 녹은 파라핀 왁스와 함께 침투 않습니다. 일반적으로이 밤새 이루어집니다. - 조직 프로세서의 프로그램을 시작합니다. 권장 표준 설정이 침투 한 후, 1 시간에 70 % EtOH로 세 번으로 1 시간 90 % EtOH로 세 번, 1 시간 100 % EtOH로 2 배, 1 시간 100 % 크 실롤, 한 번에 1 시간, 실온에서 15 분 100 % 크 실롤있다 두 번 1 시간 56 ° C (11)에서 3 시간 동안 한 시간 파라핀 왁스.
참고 : 차단 스테이션이 녹은 왁스와 준비가되어 있음을 보장하기 위해, 시작하기 전에 몇 시간에 컴퓨터를 켜거나대략의 개시 시간을 선택하기 위해 타이머 기능을 사용한다.
참고 : 경우 조직은 56 ° C에서 대신 3 시간 56 ° C에서 즉시 이후에 가능 파라핀 왁스에 이상 배양 시간을있다 처리 할 수 없습니다. 기기의 사용 설명서를 참조하십시오. 은 "빈 레토르트"명령이 승인 될 때까지 일반적으로 조직과 카세트가 자동으로 녹은 왁스를 유지합니다. 조직 처리를 시작할 때 왁스가 용융하지 않으면, 레토르트 70 % 에탄올로 채워지고 시작할 준비가 될 때까지 프로그램은 보류 상태로 유지. - 레토르트 비우기 즉시 차단 역에서 56 ° C에서 파라핀 왁스 목욕에 샘플을 전송합니다. 바구니에서 뚜껑을 제거하고 그 뚜껑 차단 스테이션의 파라핀 욕조 커버.
- 바구니에 카세트 있기 때문에 차단 역의 표면에 더미 많은 신선한 균형 트레이는 56 ° C로 가열.
참고 : 에탄올에 강한 영구 마커를 사용 할 수 있습니다d는 균형 트레이의 바닥에 레이블을합니다. 아세톤에 강한 영구 마커는 권장되지 않습니다. - 차단 스테이션을 사용하여 56 ° C에서 녹은 파라핀 왁스와 함께 미리 예열 신선한 플라스틱 균형 트레이를 입력합니다. 파라핀 조의 뚜껑을 들어 한 번에 하나의 카세트를 픽업하여 핀셋을 사용하여 균형을 트레이 56 ° C에서 유동 파라핀 왁스 카세트로부터 샘플을 옮긴다.
중요한 단계 : 신속하게 협력하여 카세트를 처리하는 동안 샘플을 둘러싼 왁스의 경화를 피하십시오.- 왁스의 경화 전에 준비 바늘을 사용하여 필요에 따라 모든 샘플을 놓습니다. 일반적으로, 여러 꽃 개별적으로 각 방향으로 약 1cm 간격 균형 트레이에 배치되어있다.
- 모든 샘플이 전송 될 때까지 단계를 반복 3.1.9.
- 다시 조직 프로세서에 바구니를 놓고 적절한 프로그램을 (사용 설명서 참조)를 사용하여 레토르트를 청소하십시오.
- 조직 프로세서와 차단 역을 끕니다. 단계 3.1.13를 계속합니다.
- 경우에는 조직 침윤 기계없이 매립 작업대가없고, 56 ℃로 파라핀 왁스를 용융하는 가열로를 사용한다. 벤치에서, 플라스틱 균형 트레이에 녹은 왁스를 작성 왁스로 샘플을 전송하고, 샘플의 위치를 준비 바늘을 사용합니다.
- 4 ° C에서 샘플을 저장하기 전에 3 시간 - 파라핀 왁스 ~ 1 상온에서 경화 할 수 있습니다. 샘플은이어서 신선 가공 또는 수 개월까지 저장할 수있다.
- LAM 얇은 섹션과 슬라이드의 준비.
- 아래에서 왁스 블록을 조명 라이트 테이블에, 주변의 플라스틱 트레이에서 샘플 파라핀 왁스를 제거합니다. 상기 조직을 함유하는 왁스 제곱 블록 해부 예., RN 아제 (RNase) 자유 면도날을 사용하여 또는 꽃 봉오리. 이를 위해, 항상 왁스 블록의 상단을 향해 샘플의 방향 (또한 참조
- 한번에 LAM 사용해야 모든 시료의 왁스 블록을 준비한다.
- 아래에서 왁스 블록을 조명 라이트 테이블에, 주변의 플라스틱 트레이에서 샘플 파라핀 왁스를 제거합니다. 상기 조직을 함유하는 왁스 제곱 블록 해부 예., RN 아제 (RNase) 자유 면도날을 사용하여 또는 꽃 봉오리. 이를 위해, 항상 왁스 블록의 상단을 향해 샘플의 방향 (또한 참조
- 강화 된 파라핀 왁스로 가득 카세트를 포함 처리 할 블록을 탑재 : 에탄올 램프를 사용하여 적절한 주걱의 끝 부분에 작은 조각 또는 파라핀 왁스의 방울을 녹여 포함 된 조직으로 (지원에 블록을 해결하기 위해 뜨거운 왁스를 사용 위쪽).
- 왁스는 4 ° C에서 적어도 20 분 동안 경화 할 수 있습니다.
- 빛 테이블에 면도날로 샘플을 둘러싼 과잉 왁스를 제거합니다. 병렬 가장자리 (그림 1 참조) 사각 표면을 유지해야합니다.
- 42 ° C까지 가열 플레이트를 설정합니다.
- 안전하게 마이크로톰에 샘플을 탑재하고 6 준비 - 10 μm의 두께 섹션. 마이크로톰을 사용하여 제조업체의 지침을 참조하십시오. 참고 : 얇은 섹션은 종종 더 나은 구조 해상도, highe의 RNA의 큰 금액을 줄 것이다 동안R 품질 두꺼운 부분으로 얻을 수있다. Boechera의 세포가 배우체 성숙한 위해 우리는 기본으로 7 μm의를 사용합니다. 마이크로톰 나이프를 통해 샘플 오히려 천천히 이동하면 종종 더 나은 조직 학적 결과.
- LAM 슬라이드에서 그들을 배치하기 전에 바닥에 검은 종이와 플라스틱 상자에 15cm - 항상 약 10의 길이에 파라핀 리본을 전송합니다.
- 가능하면 해부 스코프 하에서, 예를 들어 관심의 세포 - 또는 조직 유형, 난자를 함유하는 파라핀 스트립의 부분을 사전에 선택하고 나머지를 버린다.
- 가열 접시 위에 평평한 표면 - 금속 프레임 슬라이드의 필요한 양 (10 일반적으로 5)을 놓습니다.
- 피펫 1 ~ - 슬라이드의 플라스틱 부품에 RNAse가없는 물 2 ㎖. 플라스틱 윈도우에 걸쳐 충분한 길이 5cm - 면도날을 사용하여, 약 4의 짧은 조각 파라핀 리본 잘랐다. 유핀셋 이상적 파라핀 스트립 슬라이드 플라스틱 창에 서로 평행하게 배치하는 준비 SE는 바늘. 조심스럽게 물을 제거하고 다시 슬라이드를 배치 한 끝에 슬라이드를 올립니다.
- 대안 적으로, 화학적 후드 가열판 장소. 표면을 습윤하기에 충분한 슬라이드의 플라스틱 부품의 메탄올 소량 적용 (이 슬라이드의 약간의 주름이 발생할 수있다). 슬라이드에 파라핀 스트립을 놓습니다.
참고 : 가능하면 독성의 이유로, 메탄올의 사용을 피하십시오. 그러나,이 단계에서 메탄올의 사용은 물에 장착함으로써 달성 품질이 충분하지 않은 경우에, RNA의 질을 개선한다. 달성 RNA 품질 조사에서 세포 유형과 종류에 따라 변화로는, 새로운 프로젝트의 시작이 대안을 테스트 할 가치가있다.
- 대안 적으로, 화학적 후드 가열판 장소. 표면을 습윤하기에 충분한 슬라이드의 플라스틱 부품의 메탄올 소량 적용 (이 슬라이드의 약간의 주름이 발생할 수있다). 슬라이드에 파라핀 스트립을 놓습니다.
- ~ 12 시간 동안 42 ° C에서 하룻밤 가열 접시에 슬라이드를 건조시킵니다. 와 가열판 커버슬라이드를 만지지 않는 플라스틱 뚜껑. 플라스틱 뚜껑은 공기의 교환을 방해하지 않도록하십시오. 이 뚜껑은 목표 피펫 박스 또는 유사한 배치 될 수있는 해제한다.
- 대안 적으로, 2 시간의 최소 또는 조직이 완전히 건조 나타날 때까지의 건조 시간을 줄인다. 콜렉션 시간 슬라이싱에서의 감소는 RNA의 품질을 향상시킬 수있다.
- 화학 후드에서, 탈 왁스 슬라이드에게 적절한 슬라이드 홀더를 사용하여 크 실롤에서 10 분 동안 2 회. 완전히 건조 된 상태로 유지되며 금속 프레임의 넓은 끝을 터치하여 슬라이드를 제거 할 수 있습니다 만 그러나 각 슬라이드의 플라스틱 부품 잠수함해야합니다.
- 슬라이드가 LAM 이전에 화학 후드 ~ 10 분을 건조하도록 허용합니다.
참고 : 즉시 처리하지 슬라이드 조직이 몇 시간까지 가입 향 42 ° C에서 다시 가열 접시에 배치 할 수 있습니다. 이는 추가 처리 될 때까지 RNA의 품질을 손상시키지 어떠한 습기를 방지한다.
4. 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)
참고 : LAM에 대한 절차는 사용하는 기기에 따라 달라집니다. 이 프로토콜의 특정 세부 사항은 특정 악기와 정전기력의 모자를 만드는 사용에 대한 샘플을 수집하는 기술에 적용된다. 또한, 세부 사항은 심지어 소프트웨어의 다른 버전 사이에 다를 수 있습니다. 자세한 설명과 장비 및 소프트웨어에 대한 특정 지침은 제조업체의 지침과 사용자 핸드북을 참조하십시오.
- LAM (컴퓨터, 현미경, 레이저 제어 상자)에 대한 장치에서 전환합니다.
- 현미경과 레이저를 조종 프로그램을 시작합니다.
- 컨트롤 박스에 해당하는 버튼을 눌러 레이저를 전환합니다.
- 캡 홀더에 (디퓨저없이 0.5 ml의) 모자를 놓고 악기에 위치.
- 현미경 유리 슬라이드와 LAM 슬라이드를 지원합니다. 그 확인과 슬라이드의 평탄면부착 된 조직을 유리 슬라이드에 직면 해있다.
- 아래에있는 유리 슬라이드와 악기에 슬라이드를 놓습니다.
- 4 배 목표를 선택합니다. 프로그램에서 "최대"위치로 캡을 이동하고 슬라이드의 스캔을 진행하기 위해 선택합니다.
- 슬라이드를 통해 검색 및 관심있는 구조를 식별합니다. 정확하게 및 절단 공정의 정확한 위치로 다시 이동할 수 있도록 슬라이드에 자신의 위치를 저장한다.
- 해당 목적 (예 : 40X 또는 60X)을 선택합니다.
- 필요한 경우, 레이저 속도, 초점 레이저 전력을 조정하고, 또한 기기의 사용자 매뉴얼을 참조하여 상기 스테이지 이동을 보정. 계정이 관심있는 특정 조직에 대해 설정되면, 설정을 재사용 할 수 있습니다.
- 이상적으로는 조직없이 막의 일부에, 프로그램의 "레이저 샷"버튼을 누름으로써 하나의 슛 레이저의 위치를 확인한다.
- 필요한 경우, 제 따라 레이저의 위치를 보정기기의 전자 제조업체의 지침.
- 누르면 마우스 오른쪽 버튼을 유지, 모니터의 소프트웨어 윈도우의 네 모서리에 명백한 구조를 이동하여 목적의 교정을 확인합니다. 명백한 구조에 대한 손의 위치가 네 모서리에서 동일한 지 확인합니다. 그렇지 않으면 소프트웨어 설명서 다음 목표를 교정.
- '아래'위치에있는 캡으로, 세포 유형 또는 관심의 조직, 예를 들면, 계란 셀의 경계를 표시하기 위해 '손으로 펜'도구를 사용합니다. '컷'을 압박하여 레이저와 관심의 세포를 해부하다. 참고 : 종종 요구 절편하는 것은 반복되는 셀의 테두리 전체가 한 번에 절개되지 않은 경우. 이 경우, 자동 표준 단면의 두 반복을 수행하는 소프트웨어를 설정할 것을 추천한다.
- 뚜껑을 들어 올려 관심의 구조와 다음 저장된 위치로 이동합니다. 단계를 반복 4.13하나의 슬라이드에서 관심의 모든 세포가 수집 될 때까지 절차의 다음 셀 섹션을 해부한다. 확인 캡은 새로운 섹션은 캡의 빈 위치에 붙어있는 방식으로 배치되어 있는지 확인합니다.
참고 :이 조직의 큰 조각을 분리하는 것이 좋습니다 (예를 들어, 전체 꽃이나 그것의 부분 부분) 신선한 캡에 단일 셀 부분의 분리 후 각 슬라이드에서. 이들은 RNA 품질 관리에 사용될 수있다. - 슬라이드를 제거하고 단계 4.4 반복하여 다음 슬라이드를 계속 - 4.14 4.9 및 4.13.
- 모든 슬라이드에서 관심의 세포 유형까지 단계를 반복 4.15 및 관련 단계는 고립되었다. 참고 : 4 ~보다 오래 수확하지 않는 것이 좋습니다 - 같은 캡에 5 시간.
- 시각적으로 시료의 불특정 오염을 제외 LAM 후 캡 표면을 검사합니다. 비 해부 조직을 호일로 보호되는 반면, 먼지로 인해 정전 밀착성을 표면에 부착 할 수있다.
- 티오 시각적으로, 뚜껑을 검사 장비에서 슬라이드를 제거합니다. '아래'위치에 캡 홀더를 배치하고 4 배 목적으로 표면을 검사합니다.
- 먼지의 작은 조각을 볼 수 있습니다 경우, 작은 (2 μL) 피펫 팁을 제거합니다. 또한, 다시 악기의 슬라이드 마운트 슬라이드 (NO 조직)의 자유 부분에 뚜껑을 배치하고 완전히 레이저를 사용하여 오염을 파괴한다.
- 닫기 모자와 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 건조 섹션을 동결. 필요한 경우, 샘플 수 주까지 저장 될 수있다. 그러나이 단계에서 신속하게 진행하는 것이 좋습니다.
5. RNA의 분리 및 품질 관리
주 : RNA는 RNA 소량에 적합한 임의의 방법에 의해 분리 될 수있다. 이 프로토콜에서 RNA 소량 위해 지정된 RNA 분리 키트를 이용하여 설명한다. 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 부착 된 샘플 튜브를 사용캡 직접 또는 -80 ° C에서 제거 후.
- 튜브를 열고 조심스럽게 필터 팁을 사용하여 각 튜브의 벽에 추출 버퍼의 11 μl를 피펫. 샘플 사이의 팁을 변경합니다.
- 뚜껑을 닫고 튜브의 캡까지 추출 버퍼를 흔들어.
- 42 ° C로 예열 가열 오븐에서 아래로 캡으로 튜브를 놓습니다. 제조업체의 지침에 따라 30 분 동안 품어.
- 열 준비를 위해 제조업체의 지침에 따라 튜브의 하단에있는 추출물을 수집.
- 개별적으로 각각의 튜브 / 캡 5.1.2 - 하나 이상의 캡의 재료가 하나의 샘플로 결합해야하는 경우, 단계 5.1.1를 진행합니다.
- (제조업체의 지침 참조) 그 후, 하나의 튜브에서 하나의 샘플의 추출을 풀과의 EtOH의 동등한 양을 첨가하기 전에 피펫으로 풀 추출물의 양을 측정한다.
- 확인이 잇의 양OH 열을로드하면 풀 추출물의 부피와 동일하기 전에 추가했다.
- EtOH로 RNA 침전 후, 제조업체의 지침에 따라 열 부하에 신속하게 진행합니다. 100 XG에 원심 분리 단계와 프로토콜을 계속합니다.
- 각각의 수집 튜브의 내용을 컬럼에 통과 한 후, 플로우 스루 다음 제조사의 지시 사항을 제거하는 30 초 동안 16,000 × g으로 원심 분리 공정을 수행한다.
- 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출 및 정제를 계속합니다.
- 컬럼에 용출 버퍼의 로딩 후 열이 1 분 동안 품어 할 수 있습니다. 제조업체의 지침의 지침에 따라 원심 분리기에 튜브를로드하기 위해 계속합니다. 주 : 앞서 용출 100 XG에서 1 분 동안 원심 분리 추가적인 단계 용출의 효율을 높일 수있는 프로토콜에 나타낸 바와 같이.
- 계속에서 RNA를 추출단계이 프로토콜의 5.2.7 5.1 다음 RNA 품질 관리에 대한 rols (큰 조직 섹션).
- RNA 품질 관리 부하 1 μL 제조업체의 설명서에 따라 RNA 피코 칩을 사용하여 Bioanalyzer에 각 컨트롤 샘플의 희석 총 RNA.
주 : 추출 된 RNA는 선형 증폭과 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ 7,11,13,14을 이용하여 전 사체 분석을 위해 사용될 수있다. 이상적으로, 품질 관리는 공급 업체의 수를 증폭에 적합한 키트를 제공 적어도 7의 RNA 무결성 번호 (RIN)을 적절한 예는 9에 제시되어 표시해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
샘플 준비 및 LAM은 연속 단계에서 완료
연속적인 단계들의 수는 LAM (도 1)에 의해 선택된 세포 유형에서 전사 분석을 위해 RNA를 준비해야한다. 이 RNA의 인구는 수확 후 변경되지 않도록 꽃과 즉시 고정의 수확을 시작합니다. 조직은 임베디드 구분, 슬라이드에 장착된다. 이 LAM에 의해 세포 하나 또는 여러 개의 모자 (그림 1)의 세포 유형 특정 섹션의 풀링의 분리를 할 수 있습니다. 재료는 이후 동결 또는 직접 RNA 추출법에 의해 처리 될 수있다. 외에 두 모델 비 모델 종 LAM 분석의 장점은 셀 타입 별 적용되어야에서, 상기 방법은 시간 소모적 오히려 남아있다. 때로는 더 많은 시간을 작업 중 적어도 1 주일, TI의 단계에 필요RNA 추출에 ssue 수확 (그림 1). 그것은 LAM 몇 일 동안 수확 자주 절 하나의 생물학적 시료와 RNA 추출에 풀링 고려 될 필요가있다. 100 ~에 대한 부분은 하루에 격리와 Boechera 계란 세포의 경우, 샘플 당 적어도 ~ 200 섹션의 사용을 적극 권장합니다.
관심의 세포 유형의 분리 건조 섹션에서의 가시성에 따라 다름
세포 유형 특이 부분의 분리는 프로토콜의 가장 시간이 많이 걸리는 공정이다. 지금까지,이 단계에는 자동화 인해 샘플의 복잡한 특성 때문에 개발되지 않았다. 건조 섹션 낮은 콘트라스트를 가지며, 단면 평면 인해 난자 w는 서로 다른 각도로 배향되어 있다는 사실에 샘플 사이 다르기 때문에 소프트웨어 툴을 사용하여 관심있는 셀의 식별이 가능하지조직을 ithin (그림 2). 그럼에도 불구하고, 성숙한 여성 synergids와 배우체, 난자, 중앙 셀 (정반대 세포가 수정하기 전에 퇴화)의 독특한 형태는 연구자에 의해 난자 세포 (도 3 그림 2B, C)의 명확한 식별을 할 수 있습니다. 사실, Boechera의 divaricarpa에서, 난자 세포는 종종 준비하는 동안 약간의 수축하므로, 주변 조직으로부터 고순도 (그림 2B, C도 3)에서 계란 세포 집단의 분리를위한 유리한 기능을 분리한다.
LAM 후 캡의 육안 검사가 권장된다
LAM 후 캡 표면의 육안 검사는 먼지, 샘플, 예를 들어, 모든 가능한 오염의 식별을 할 수 있습니다. 또한, 상기 SE되도록 도움ctions는 때때로 부분이 절차를 수행하는 동안 분실, 캡에 충실. 일반적으로, 많은 선택 섹션은, 예를 들어, 달걀 세포 LAM 몇 시간 후 1 캡을 알 수있다.
기존의 워크 플로우 재현성 좋은 RNA 품질의 결과
여성에서 배우체 세포 유형 특이 LAM 아이솔레이션에서 총 RNA 량 만 NG 낮은 범위에있다. RNA의 양이 제한은 필요 LAM RNA 후 품질 관리에 대한 근사 각 슬라이드 큰 조직에서 분리 된 대표적인 제어를 사용하는 것을 가능하게한다. 이것은 B.으로부터 세포 유형 특이 RNA의 비교에 의해 설명된다 같은 divaricarpa 달걀 세포 유사 RNA의 품질을 나타내는 동일한 슬라이드에서 분리 된 큰 조직 영역에서 대조군에 비해 (도 4A, B). RIN 번호 & # 높은 RNA의 품질이 방법을 사용, 좋은8805; 7 재현성이 얻어진다. 달성 된 RNA의 품질이 아닌 apomictic 중앙 셀 synergid 셀 또는 apomictic 초기 셀에 apomictic 난자 표현 236 유전자의 식별에 이르는, 세포 유형 특이 적 RNA-SEQ 적합했다 나 세포 또는에 애기 장대의 성숙 성 배우체 (그림 5) 7.
그림 1 :. 의정서의 단계의 계획 단계마다 필요한 최소 시간을 나타내는 고정 꽃 또는 관심의 조직 밤새 이루어집니다. 다음 날, 매립이 시작되는 프로토콜의 날 3에 포함 된 물질의 결과로, 밤을 통해 실행한다. 하루 왁스 블록에 포함 된 샘플부터 3 마이크로톰 절편을 생성 할 수있다. 얇은 파라핀 섹션의 리본 슬라이드에 장착하고, 밤새 건조 남아 있습니다. 에LAM의 수일 즉 하나 생물학적 복제에 충분한 재료를 획득해야한다. RNA 분리 및 품질 관리 후, RNA-서열에 대한 라이브러리 준비가 사체 분석을 준비하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 계란 세포가 인해 여성 배우체의 특성 형태학 (A) 성숙한 여성 배우체 (폴리 고눔 타입)의 개략도 (B - C)에, 얇은 섹션에서 명확하게 식별 할 수있는 여성 배우체를 품고 난자를 통해 얇은 섹션.. Boechera의 divaricarpa. 계란 세포는 명확하게 볼 수 있습니다. 즉, synergids : S 인해 종종 암 배우체 형태의 모든 유형의 세포 (난자에중앙 셀 : CC)는 하나의 섹션에서 볼 수 있습니다. 스케일 바는 50 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Boechera divaricarpa. (A)의 계란 세포와 B의 성숙 배우체의 C. 제 그림 3. LAM , B와 D 및 이전에 7 μm의에서 divaricarpa, 레이저 장치 (난자 : 전자, synergids : S, 중앙 셀 : CC)과 미세 절제 후. 스케일 바는 50 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
<강한> 레이저 해부 계란 세포 및 제어 섹션의 그림 4. RNA 품질. 컨트롤과 동일한 슬라이드에서 수확 (B) 큰 조직 영역에 비해 난자 섹션에서 분석으로 (A) RNA 품질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
236 apomictic 계란 세포에서 발현 유전자하지만 어느 것도 apomictic 중앙 셀, synergid 셀의 Apomictic 및 성적 성숙 배우체 또는의 세포에 비해 만 Apomictic 계란 셀에 표현 유전자의 그림 5. 확인은 Apomictic 초기 셀. 히트 맵 , B의 또는 apomictic 초기 셀 gunnisoniana도 A의 성숙 성 배우체의 세포 장대 7 계층샘플 및 유전자의 클러스터링은 유클리드 거리와 계층 적 응집성 클러스터링을 기반으로했다. 레드 높은 발현과 검은 색 낮은 발현을 나타낸다. 색상은 행마다 조정됩니다. 아포 :. apomictic 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
의정서는 다른 세포와 조직에 적합하다
사체와 함께 LAM은 마이크로 어레이 또는으로 분석 RNA-서열은 개발 또는 생리 학적 과정 7-11,13,14을 조절하는 유전자 활동의 특정 패턴에 대한 통찰력을 얻을 수있는 유용한 도구입니다. 그러나, 특정 세포 타입에 대해,이 방법의 적합성 구조적 문제에 비판적으로 의존한다. 셀은 명확하게 볼 수 있고 LAM에 사용되는 건조 섹션에서 명확하게 식별 할 필요가있다. Boechera의 divaricarpa에서 배우체의 형태는 계란 세포 (그림 2, 그림 3)의 쉽게 식별 할 수 있습니다. 결국, 특정 세포 집단의 분리 속도 또한 세포 유형 새로운 슬라이드를 슬라이드 교환 스캔으로 하나의 슬라이드에서 발견 될 수있는 주파수에 따라 시간이 걸리는 단계이다. 250 셀 분파 - 적어도 (200), 세포 유형에 해당 의존을 감안할 때이온이 샘플 당 풀링되어야 특정 연구 디자인에있어서의 적합성은 크게 LAM 단계의 시간 조건에 따라 다르다.
또한, 조직의 형태에 따라서는 6 μm의 부분의 두께를 감소시키는 구조의 측면에서 유리할 수있다. 유사하게, 이상적 ≥ 8 ㎛의 두꺼운 부분은 일반적으로 조직 절편 동일한 양의 다소 높은 품질의 높은 RNA 량 및 RNA 초래한다. LAM 가능하여 분리를 만들기 위해 10 μm의 - 또한, 관심있는 셀 (8)의 적어도 직경을 가져야한다.
원칙적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 먼 관련된 종으로부터의 상이한 세포 및 조직 유형으로 조정될 수있다. 그러나, RNA의 질도 7,10,13 같은 종의 상이한 세포 유형에 따라 다를 수있다. 이 프로토콜은 작고 중요한 세포 유형에 따라 조정되었습니다. 따라서, 그것은 이제 broade 적용될 수있다추가 조정없이 샘플의 연구 범위. 프로토콜의 약간의 변형은 그럼에도 조사중인 세포 유형 및 종류에 따라 요구 될 수도있다. RNA 형태와 품질의 비교를위한 새로운 종 또는 세포 유형의 방법을 설정할 때 처음 두 대안 고정 제를 사용하는 것이 권장된다 (프로토콜 1.1 참조).
원칙적으로,이 프로토콜에 적용 할 수있는 레이저 미세 절제 9 적합한 다른 기기로 수행 하였다. 그러나, 기기가 샘플링하는 기술뿐만 아니라, 레이저 전력 및 적용 할 수있는 레이저 빔의 최소 폭 둘 다를 주목해야한다. 특히 좁은 레이저 경로의 결과로 작은 세포 및 조직 분야, 레이저의 분리를 위해 더 적합합니다. 우리가 사용하는 장비의 레이저 빔 (~ 1 μm의 넓은) 오히려 괜찮 작은 세포의 해부를 할 수 있습니다. CEL를 수집하는 샘플링 기술정전 부착에 의해 스티커 캡 표면 LS 작은 세포 유형 및 단일 셀 부분의 분리에 특히 유리하다. 이것은 정전기 효과에 의한 시료 손실의 위험을 최소화한다.
얻어진 RNA의 품질 또한 전사 분석을 위해 중요하다
성공적인 RNA-SEQ 라이브러리 제조를위한 가장 중요한 점 중 하나는 RNA의 품질이다. 증폭 키트 여러 제공자가 더 낮은 무결성 RNA 그들의 기술을 최적화하면서, 마이크로 어레이를 하나 또는 RNA-SEQ 의해 사체 분석 후의 데이터의 품질은 일반적으로 입력 RNA의 품질을 증가시킨다. 이 설정 프로토콜을 사용하여, 좋은 재현성 RNA의 여성 생식 조직의 다양한 발달 단계에 대한 품질 및 애기 Boechera의 생식선을 수득 하였다 (예를 들면,도 4). 상기 방법은 적용 할 수 있지만또한 더 멀리 떨어진 종 (예를 들면, 토마토, 미공개)에 대한, 예를 들면, 작은 최적화 또는 변형 종 조직 유형에 따라 요구 될 수 있음을 고려하고, 심지어 실험실 환경으로 할 필요가 고습도 슬라이드 준비와 LAM 동안 RNA의 무결성을 손상시킬 수 있습니다.
프로토콜 동안 중요한 단계는 슬라이드 표본을 함유하는 구획 왁스 줄무늬의 장착된다. 여기에, 특히 물에 대한 접촉은 중요한 단계이다. EtOH로하여 물을 교체하는 분리 (미 출판) 후 RNA의 무결성의 상당한 개선을 초래하지 않지만, 메탄올로 물을 교체한다. 그러나, 메탄올은 화학 후드 아래 큰주의하여 취급해야합니다. 메탄올의 사용에 대한 대안으로서, 시료의 종류에 따라 물에 부착 한 후, 건조 시간은 동일 RNA 양호한 품질 결과 ~ 2 시간 (3.3.3.1 참조)을 저감 할 수있다.어느 세포 유형과 관심의 종 물이나 메탄올에 장착 의해 달성되는 RNA의 품질을 테스트하는 시험을 수행하는 새로운 프로젝트의 시작 부분에 좋습니다.
LAM은 전사 분석을위한 강력한 기술이다
결론적으로, 우리는 성공적으로 최적화 LAM과 애기 장대와 Boechera 종의 성적 apomictic 생식 세포 계보의 다른 세포 마이크로 어레이 및 RNA-서열에 의한 세포 유형 특정 사체 분석의 조합을 적용했습니다. 따라서 비교 전사 분석을 가능하게 7,11,13,14 (또한 그림 5 참조). 세포 유형 특이 적 전사 분석을 허용하는 다른 기술과 비교하여 기술 된 방법은 다수의 이점을 맺는다. 중요하게는, 세포 유형 또는 부분에 관심 조직의인지 가능성에 따라서는 두 모델 희귀 세포 유형에 적용 할 수있다이러한 Boechera SPP.에서 성숙한 여성 배우체의 세포와 같은 비 - 모델 종, 또는 심지어 예를 들어 셀룰러 도메인, 셀 (19)의 극성 반을 분리하는데 사용될 수있다. 유사 응용 프로그램은 세포 또는 핵 (FACS / 팬) (10)의 형광 활성화 정렬에 의존하는 다른 방법으로 가능하지 않을 것입니다.
상기 방법의 주요 단점은 시간이 요구된다. 고정 및 삽입 시간에 손 - 확장이 필요하지 않으며, 동시에 꽃 다량 LAM 대해 완료 할 수 있지만 이러한 3 주에 매우 시간이 걸리는 셀 유형 특정 분석 및 통상적으로 3 일로서 LAM은 (레이저 현미경에서 하루 평균 5 시간에) 계획 될 필요가있다. 이런 점에서 제대로 연구를 설계 대상으로 특정 세포 유형의 분리 속도 일부 예비 시험을 수행하는 것이 도움이된다. 이 최적의 프로토콜을 사용하는 경우에도 또한, 시험은 고도로 다시되는 RNA의 품질을 테스트하기칭찬.
요약하면, LAM은 다른 기존의 방법을 사용하여 달성 할 수없는 개개의 세포 유형 또는 셀에도 하위의 해상도에서, 전사 분석을위한 강력한 툴이다. 이러한 점에서, 매우 높은 공간적 해상도, 발달 과정들, 예를 들어, 분석을 허용하는 엄청난 가능성을 맺는다. 이 작업은 애기 장대와 Boechera 7,11,13,14 성적과 apomictic 재생의 모든 주요 단계에서 세포의 전 사체의 분석에 의해 예시 하였다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 1,009,861,000 | absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP |
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939AA | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Ambion Nuclease free water | life technologies | AM9932 | |
| ASP200 S | Leica | 14048043624 | tissue processor |
| black cardboard | can be purchased in special paper shops | ||
| DNA- and RNAse-free Frame Slides | Micro Dissect GmbH | 1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| ethanol lamp | |||
| exsiccator | Sigma-Aldrich | Z354074-1EA | Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment |
| filter tips 10 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 1,000 µl | Axon Lab AG | AL60010 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 20 µl | Axon Lab AG | AL60020 | can be replaced by similar tips |
| filter tips 200 µl | Axon Lab AG | AL60200 | can be replaced by similar tips |
| forceps precision | VWE | 232-1221 | |
| glass slide holder | Huber & Co.AG | 10.0540.01 | Färbekästen nach Hellendahl |
| glass staining trough | Huber & Co.AG | 10.0570.01 | Färbekasten |
| Heated Paraffin Embedding Module Leica | Leica | Leica EG 1150 H | blocking station, similar devises are suitable |
| Heating and Drying Table | Medax | 15501 | other models and/or suppliers are suitable |
| ice bucket | VWR ice bucket with lid | 10146-184 | similar buckets equally suitable |
| light table | UVP An Analytical Jena Company | TW-26 | white light transluminator |
| microscope slide | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| microtome blade | Thermo Scientific | FEAHS35 | S35 microtome blade disposable |
| MMI Cell Cut Plus Instrument | MMI (Molecular Machines and Industries) | ||
| Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml | life technologies | AM12475 | |
| Paraplast X-TRA | Roth | X882.2 | for histology |
| PicoPure RNA Isolation Kit | life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| plastic balancing trays | Semadeni AG | 2513 | |
| plastic box | Semadeni AG | 2971 | Plastikdose PS |
| plastic lid for heating plate | homemade | ||
| preparation needle | VWR | 631-7159 | |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse free microfuge tubes | life technologies | AM12400 | |
| RNAse ZAP Decontamination Solution | life technologies | AM9780 | |
| Semi-automated Rotary Microtome | Leica | RM2245 | similar devices are equally suitable |
| Tissue Loc Histo Screen Cassettes | Thermo Scientific | C-1000_AQ | similar cassettes of other suppliers are suitable |
| Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl | MMI (Molecular Machines and Industries) | 50204 | |
| Xylol (Isomere) ROTIPURAN | VWR | 4436.2 | min. 99%, p.a., ACS, ISO SP |
| process embedding cassettes | Leica | 14039440000 | Leica Jet Cassette I without lid |
| Universal Oven | Memmert | UF55 | other models and/or suppliers are suitable |
References
- Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
- Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
- Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
- Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
- Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
- Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).
- Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
- Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
- Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
- Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
- Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).
- Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685 (2012).
- Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
- Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
- Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
- Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
- Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).
