ここで説明する方法は、焦点平面ドリフトを補正する光学切片および再調整の単純な戦略を実行することができる顕微鏡解剖蛍光を用いて、ゼブラフィッシュ胚における器官の発達の時間経過解析を可能にします。
器官形成を理解するために、組織の発育中に発生する空間的および時間的変化を記録する必要があります。ここで説明する方法は、構造化照明およびzスタックの取得のために装備蛍光解剖顕微鏡を用いて、ゼブラフィッシュ胚における正常および減損腎臓発生の経時分析を可能にします。腎形成を視覚化するために、トランスジェニックゼブラフィッシュ(Tgは(wt1b:GFP))、蛍光標識された腎臓構造を有するが、使用されました。腎欠陥はウィルムス腫瘍遺伝子wt1a、腎臓の開発のために重要であることが知られている因子に対するアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドの注射によって誘発されました。
実験の利点は、追加の機器なしで、X、Yまたはz方向で再調整の動きのためのシンプルな戦略とズーム顕微鏡を組み合わせたものです。温度変化や機械的振動によって引き起こされる焦点ドリフトを回避します、オートフォーカス方式は、通常、必要な環境チャンバを利用するのではなく、適用されました。 XYドリフトによる位置変化を再調整するために、インプリント再配置グリッドの撮像チャンバーを使用しました。
このような共焦点レーザー走査または光シート顕微鏡などの光学切片とタイムラプス撮影のために、より複雑な設定と比較して、ズーム顕微鏡は、取り扱いが容易です。また、そのようなフィールドの高い深さと拡張作動距離などの顕微鏡固有の利点を解剖提供しています。
ここに提示器官形成を研究するための方法は、光学セクショニングすることができない蛍光実体顕微鏡で使用することができます。高スループットのために制限されているが、この技術は、通常、開発組織や臓器のダイナミクスのタイムラプス撮影のために使用される、より複雑な機器への代替手段を提供しています。
原腸形成に続いて、器官は、個人のライフサイクルの次の段階です。これは、組織および器官を生成するために再配置、相互作用および細胞の非常に多くの場合、移行を含みます。臓器の開発の基礎をなす過程での不正確さは、多くの場合、その後の人生で直ちにまたはも現れることができる疾患につながります。したがって、理解器官形成は、発生生物学と生物医学研究における主要な取り組みとなっています。特定の器官の発達を調査することができるようにするために、それも、胚の体壁を通して可視でなければなりません。これは、開発中に発生する空間的、時間的変化の記録を可能にします。また、器官形成に関与する因子の重要性を分析するためには、操作の影響を受けやすいことが必要です。
in vivoでの器官の調査のために非常に適している一つの生物はゼブラフィッシュです。そのtranspar蛍光トランスジェニック系統の使用と組み合わせて、胚発生時のencyは、タンパク質の局在と発現動態の観察だけでなく、内臓1の可視化を可能にします。これは、その臓器顕微鏡分析のためにアクセスできません哺乳動物のモデルに比べてリアルタイムで臓器開発の調査に関するユニークな利点を提供します。また、異なるツールは、ゼブラフィッシュの胚発生を操作するために利用可能です。変異株の生成の横に、アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド(MO)は、特定の器官の発達に関与する特定の遺伝子の活性をノックダウンするために使用することができます。 MOはスプライス部位または翻訳開始コドン(8月)を対象とし、それにより、プレmRNAのスプライシングまたは翻訳を妨害するのどちらか。
ゼブラフィッシュの胚性腎臓、前腎は、腎臓の開発とGENの機能を研究するために、解剖学的にシンプルですが、貴重なモデルです腎臓病2に関連したエス。これは、ネフロンと呼ばれる2つだけの機能ユニットで構成されています。各ネフロンは、血液濾過が行わ3を取る糸球体で構成されています。さらなる成分は、短いネック領域だけでなく、排出腔4で終了溶質およびダクトの分泌及び再吸収のためのセグメント化された細管、です。かかわらず、そのシンプルな構成の、組織とゼブラフィッシュ前腎の異なる種類の細胞は、哺乳動物の腎臓5,6と非常によく似ています。
腎臓の開発に決定的に関与している要因の一つは、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子WT1 7によってコードされます。ゼブラフィッシュはwt1aと呼ばれる2つのパラログを有し、前腎8の開発中に重複するが同一でないパターンで発現されているwt1b。 GFP標識前腎構造を有するトランスジェニックゼブラフィッシュを使用することにより、wt1aの完全なノックダウンが示されています</ em>のまたは特定のスプライス型のは、それぞれ9,10、胚性腎臓の重度または軽度の奇形につながります。
ここで説明する方法は、構造化照明を介して光切片用に装備した蛍光解剖顕微鏡を用いることにより、ゼブラフィッシュ胚における正常および減損腎形成の経時分析を可能にします。一般的に、光学切片は、合焦の情報を含む画像の取得を可能にします。焦点外の情報は、数学的ア ルゴリズム( 例えば 、デコンボリューション)、光学設計( 例えば 、共焦点レーザ走査顕微鏡法)、または両方の組合せ( 例えば、構造化照明)など様々な手法によって回避することができます。
腎臓発生の欠陥を誘導するために、我々はトランスジェニックゼブラフィッシュの行(:GFP)のTg(wt1b)に注入したwt1aに対するアンチセンスMOを使用していました。この行は、糸球体、首と前にGFP蛍光を示しています細管9,10の一部。このようなレーザ走査または光シート顕微鏡などの光学切片とタイムラプス録画のためのより複雑なセットアップと比較して、ズーム顕微鏡は、取り扱いが容易で安価です。また、構造化照明のための装置は、容易にこのような拡張された作動距離と広い視野のような従来の蛍光機器( 例えば 、蛍光灯、フィルタ)、顕微鏡固有の利点を解剖オファーと組み合わせることができます。ドリフトの問題は通常、安定した結果を得るために必要な追加機器(環境室、除振台)を使用せずに解決されました。オートフォーカス戦略を確立したと刷り込ま移転グリッドの撮像チャンバはxまたはy方向のドリフト次の位置を再調整するために利用された焦点ドリフトを修正するには。
提示された方法はまた、蛍光ステレオmとして、光学切片のオプションなしで顕微鏡にも適用することができますicroscopesと正常に発達した組織や臓器のダイナミクスのタイムラプス撮影のために使用される、より複雑な機器への代替手段を提供しています。
ゼブラフィッシュは、ヒト疾患の脊椎動物の発生とモデリングの研究のための人気のモデル生物となっています。ゼブラフィッシュ胚は透明なままであるため、脳や心臓などの現像器官は、標準品の顕微鏡を用いて観察することができます。臓器特異的な蛍光を有するトランスジェニックラインの利点を取ることは、蛍光顕微鏡によって生きている胚内の発達の異なる段階を通じて器官の評価を可能にします。標準的な落射蛍光顕微鏡と全器官の構造の詳細を画像化するための1つの制限は、焦点面の上下にオブジェクトからの信号の影響です。この焦点外の光がない減少し、画像のコントラストや解像度で唯一の結果は、それはまた、関心13,14の重要な構造を曖昧にすることができます。ディスクconfocal-または多顕微鏡紡糸、レーザ走査confocal-ようないくつかの技術が、焦点外の情報とそれによってincreasを最小化するために開発されています電子画像のコントラストだけでなく、軸方向の解像度。光学切片を得るための別の方法は、レーザー-とスキャン無料の構造化照明顕微鏡、定期的な顕微鏡15に実装が簡単であり、広視野ベースの照明技術です。ここに提示した結果は、構造化照明によって達成光学切片は、解剖顕微鏡上に実装し、拡張焦点画像の再構成と組み合わせることを示し、正常の構造的詳細の可視化を可能にし、ゼブラフィッシュで腎臓の発達を妨げ。特に、wt1aのモルファントにおけるGFP陽性細胞は、様々な焦点深さで分散しており、焦点外れによるぼけとの1面のみの画像は、表現型の3次元複雑さを過小評価することになります。
臓器組織、転位や中断のダイナミクスに従うには、タイムラプス蛍光顕微鏡は、複雑な技術ではあるが強力です。タイムラプスの間イメージングわずかな振動やマイナーな温度の変動は、x、yのまたはz方向のドリフトを引き起こします。これは、安定した結果を得るために、追加の機器(環境チャンバ、除振台)を要求します。提示された方法は、余分な装置なしタイムラプス映像を記録するための電動式フォーカス駆動で解剖顕微鏡の機能を使用しています。安定したフォーカスを維持するために、オートフォーカス方式が確立され、撮像チャンバーの底に刻印再配置グリッドは、x、y軸の不安定性を補正するために使用しました。
胚の適切な埋め込みは、プロトコル内の重要なステップです。いくつかの練習は、それと重ね合わせずにガラス下部に、グリッドに近い付近にできるだけ近い関心のある構造を配置するために必要とされます。
この方法の主な利点は、そのような生活での成長や移行などの発生過程の直接観察のための手頃な価格とシンプルなツールであるということです数時間にわたって胚。また、このような大きな視野および拡張作動距離などの解剖顕微鏡固有の利点は、全体の臓器を含むより大きなサンプルの検査を容易にします。しかし、いくつかの制限が念頭に置いておく必要があります。位置を確認し、再調整するための実験の一時停止は、手続きの時間がかかり、堅牢な温度制御の欠如は、ゼブラフィッシュ16のために28.5℃で時間後に受精のように定義されている「標準」発生時に、変更することができます。別の潜在的な問題は、目的の構造が胚または幼虫の内側に配置される場合は特に、動物に撮像限定深さです。このような構造は、体節と卵黄嚢の間に位置しているゼブラフィッシュ前腎糸球体、です。糸球体を撮像するための制限深さは約200μm、開発の5日後に到達した距離であることが見出されました。対照的に、L蛍光構造であること長時間画像化することができる動物の表面に近いocated。例えば、肝細胞は、少なくとも9 DPFまで画像化のためにアクセス可能です。さらなる制限は、アガロースで胚または幼虫の長期固定化およびトリカイン処理はそれぞれ、成長遅延および心臓浮腫を誘導することです。これは正常な発達を妨げる可能性があるので、関心のある特定の期間にタイムラプス撮影の持続時間を制限することをお勧めします。関心の撮像構造中に正常にそれを開発することを確実にするために(最後に)動物のものと全体的な外観を比較することが有用であるのと同じ実験条件ではなく埋め込み、麻酔なしで続けました。
光学切片のzスタックを記録フォーカス画像の拡張深さの5時間とその後の計算の期間にわたって30分ごとに、通常の初期事象に関する空間的、時間的な情報を提供し、bは誘導された腎臓の開発を妨げwt1aのyモルホリノによるノックダウン。一定時間でのイメージング前腎の開発のためのGFPのラインは9,10ポイントを明らかにした:以前行っモルフォリノノックダウン実験はすでに腎臓マーカー17,18およびトランスジェニックwt1bの雇用とin situハイブリダイゼーションWt1aは前腎形成の早期かつ重要な役割を果たしていることを示しています破壊された糸球体の形態形成におけるそのwt1a欠乏結果と足細胞の仕様に失敗しました。これらの静的なアプローチとは対照的に、時間の経過記録は、直接コントロール胚と離れwt1aのモルファントで前腎領域から、GFP陽性細胞の遊走に早期腎形成のダイナミクスを可視化します。時間をかけて誤ってルーティング細胞を追跡する可能性は、より詳細な表現型解析を可能にします。
一般的には、ここに提示された方法は、安価かつ複雑に代替を使用して簡単に提供し、アクセスしにくいSEtupsは、通常、(環境室と除振台を装備した)レーザー走査顕微鏡や光シート顕微鏡のようなタイムラプスイメージングのために使用されます。ドリフト問題を解決するための説明ルーチンはまた、蛍光実体顕微鏡のような光学セクショニングオプションなしでセットアップ上のタイムラプス画像を実行するために適用することができます。
技術だけでなく、腎臓の発達を調査するのに適しているだけでなく、心臓や肝臓などの他の器官の正常な欠陥形態形成を監視するために適用することができます。さらに、この方法は、創傷治癒または再生等の胚および成体のモデル生物における種々の多くの動的プロセスを観察するために使用することができます。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、批判的に原稿を読み取り、改善するためのトーマス・ベイツに感謝します。また、魚のメンテナンスのためにクリスティーナ・エバートとサブリナStötzerに感謝します。
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |