Den metod som beskrivs här tillåter time-lapse analys av organutveckling i zebrafisk embryon genom att använda en fluorescens dissekera mikroskop kan utföra optisk sektionering och enkla strategier för justering för att korrigera fokus och plana drift.
För att förstå organogenes, de rumsliga och tidsmässiga förändringar som inträffar under utvecklingen av vävnader måste registreras. Den metod som beskrivs här tillåter time-lapse analys av normal och nedsatt njur- utveckling i zebrafisk embryon genom att använda en fluorescens dissekera mikroskop utrustat för strukturerad belysning och z-stack förvärvet. Att visualisera nephrogenesis, transgena zebrafisk (Tg (wt1b: GFP)) med fluorescerande njurstrukturer användes. Njur fel utlöstes genom injektion av en antisens-morfolino oligonukleotid mot Wilms tumör genen wt1a, en faktor kända för att vara avgörande för njurutveckling.
Fördelen med den experimentella uppställningen är kombinationen av en zoommikroskop med enkla strategier för återjuste rörelser i x, y eller z-riktningen utan extra utrustning. Att kringgå fokus avdrift som induceras av temperaturvariationer och mekaniska vibrationerVar en autofokus strategi tillämpas i stället för att använda en vanligtvis krävs klimatkammare. För att åter justera lägesförändringar på grund av en xy-drift, var avbildning kammare med präglade omlokalisering nät som används.
I jämförelse med mer komplicerade inställningar för inspelning med tidsluckor med optisk sektionering såsom konfokal laserscanning eller ljusmikroskop ark, är en zoom mikroskop lätt att hantera. Dessutom erbjuder det dissekera mikroskop specifika fördelar såsom hög skärpedjup och en utökad arbetsavstånd.
Metoden för att studera organogenes presenteras här kan också användas med fluorescens stereoluppar inte kapabla att optisk sektionering. Även begränsade för hög genomströmning, erbjuder denna teknik ett alternativ till mer komplicerad utrustning som normalt används för inspelning med tidsluckor i utvecklings vävnader och dynamik organ.
Efter gastrulation är organ nästa steg i en persons livscykel. Det handlar om omlagring, interaktion och mycket ofta migrering av celler för att producera vävnader och organ. Felaktighet i de processer som ligger till grund för utvecklingen av organ leder ofta till sjukdomar som kan manifestera sig antingen omedelbart eller också senare i livet. Således förstå organogenesen har varit en viktig insats i utvecklingsbiologi och biomedicinsk forskning. För att kunna undersöka utvecklingen av ett särskilt organ, måste det vara synlig även genom kroppsväggen av embryot. Detta gör det möjligt att spela in de rumsliga och tidsmässiga förändringar som inträffar under utveckling. Också för att analysera betydelsen av faktorer som är involverade i organogenes, måste den vara känslig för manipulation.
En organism som är synnerligen lämpad för undersökning av in vivo organogenes är zebrafisk. dess transparensency under embryonal utveckling i kombination med användningen av fluorescerande transgena linjerna tillåter observation av protein lokalisering och expressions dynamik, samt visualisering av de inre organen 1. Detta ger en unik fördel när det gäller utredning av organutveckling i realtid jämfört med däggdjurs modeller vars organ är otillgänglig för mikroskopisk analys. Dessutom olika verktyg finns tillgängliga för att manipulera embryonal utveckling av zebrafisk. Bredvid generering av muterade linjer, kan antisens-morpholino oligonukleotider (MO) kan användas för att knockdown aktiviteten av vissa gener som är inblandade i utvecklingen av vissa organ. MO: antingen rikta ett splitsningsställe eller translationsstartkodonet (AUG), och därigenom störa splitsning av pre-mRNA eller translation.
Zebrafisk embryonala njurarna, pronephros, är en anatomiskt enkel men värdefull modell för att studera njur utveckling och funktion av genes i samband med njursjukdomar 2. Den består av endast två funktionella enheter som kallas nefroner. Varje nefronet består av en glomerulus där blodfiltrering sker tre. Ytterligare komponenter är de kort hals regionen samt den segmente tubuli för utsöndring och återabsorption av lösta ämnen och kanalen, som slutar i kloaken 4. Oavsett sin enkla sammansättning, organisationen och de olika celltyper i zebrafisk pronephros är mycket lik den hos däggdjur njuren 5,6.
En faktor, som är kritiskt involverade i njurutveckling, kodas av Wilms tumör suppressor gen WT1 7. Zebrafisk besitter två paraloger kallas wt1a och wt1b att uttryckas i ett överlappande men inte identiska mönster under utvecklingen av de pronephros 8. Genom att använda transgena zebrafisk med GFP-märkta pronephros strukturer, har det visat sig att fullständig knock-down av wt1a </ em> eller av en viss splitsform leder till svåra eller milda missbildningar av embryonala njure, respektive 9,10.
Den metod som beskrivs här tillåter time-lapse analys av normal och nedsatt nephrogenesis i zebrafisk embryon genom att använda en fluorescens dissekera mikroskop utrustat för optisk sektionering via strukturerad belysning. Optiska sektioner i allmänhet tillåta förvärv av bilder som bara innehåller fokusinformation. Out-of-fokusinformation kan undvikas genom olika metoder såsom matematiska algoritmer (t.ex.. Avfaltning), optisk design (t.ex. konfokala laserskanning mikroskopi) eller en kombination av båda (t.ex. strukturerad belysning).
För att inducera defekter i njure utveckling vi använt en antisens-MO mot wt1a som injicerades i en transgen zebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). Denna linje visar GFP-fluorescens i glomeruli, hals och främredel av tubuli 9,10. I jämförelse med mer komplicerade inställningar för tidsförlopp inspelningar med optisk sektionering såsom laserscanning eller ljusmikroskop ark, är en zoom mikroskop lätt att hantera och billigare. Dessutom kan utrustning för strukturerad belysning enkelt kombineras med konventionell fluorescens utrustning (t.ex. fluorescens lampa, filter) och erbjuder dissektionsmikroskop specifika fördelar såsom en utökad arbetsavstånd och stort synfält. Problem med drift löstes utan att använda extra utrustning (klimatkammare, anti-vibrationsbord) vanligtvis krävs för stabila resultat. För att korrigera för fokal drift en autofokus strategi bildades och avbildnings kammare med präglade omlokalisering galler användes för att åter justera positioneringen efter en drift i x- eller y-led.
Denna metod kan också tillämpas på mikroskop utan optiska sektione alternativ, såsom fluorescensstereo microscopes och erbjuder ett alternativ till mer komplicerad utrustning som normalt används för inspelning med tidsluckor i utvecklings vävnader och dynamik organ.
Zebrafisk har blivit en populär modell organism för studier av ryggradsdjur utveckling och modellering av sjukdomar hos människan. Eftersom zebrafisk embryon förbli öppen, kan observeras utvecklings organ som hjärna och hjärta med en vanlig beredning mikroskop. Med utnyttjande av transgena linjer med organspecifik fluorescens gör bedömningar av organ hela olika utvecklingsstadier i levande embryon genom fluorescensmikroskopi. En begränsning för avbildning av strukturella detaljer av hela organ med standard epifluorescensmikroskopi är effekten av signaler från objekt ovanför och under fokalplanet. Denna out-of-fokus ljus inte bara resulterar i minskad bildkontrast och upplösning, det kan också dölja viktiga strukturer av intresse 13,14. Flera tekniker såsom laserskanning confocal-, spinning disk confocal- eller multifotonmikroskop har utvecklats för att minimera out-of-fokus information och därmed increase bildkontrasten liksom axiell upplösning. En alternativ metod för att erhålla optiska sektioner är laser- och skanning fri strukturerad belysning mikroskopi, ett brett fält baserad belysningsteknik som är och enkel att genomföra på ett vanligt mikroskop 15. Resultaten som presenteras här visar att optisk sektionering, uppnås genom strukturerad belysning, genomförs på ett dissektionsmikroskop och i kombination med återuppbyggnaden av utökade Bilderna oskarpa möjliggör visualisering av strukturella detaljer av normal och störd njure utveckling i zebrafisk. I synnerhet är de GFP-positiva celler i wt1a morphants dispergerades vid olika fokala djup, och bilder av endast ett plan med oskarp oskärpa underskattning av den tredimensionella komplexiteten av fenotypen.
För att följa dynamiken i organ organisation, ombildning eller avbrott, är tidsförlopp fluorescensmikroskopi en kraftfull än komplex teknik. Under time-lapseimaging små vibrationer eller mindre temperaturvariationer orsakar drift i x, y eller z-led. Detta kräver extra utrustning (klimatkammare, anti-vibrationsbord) för att få stabila resultat. Denna metod använder förmågan hos ett dissektionsmikroskop med en motoriserad fokus enhet för inspelning av tidsförlopp bilder utan extra enheter. Att bibehålla en stabil fokus, var en autofokus strategi upprättas och en omlokalisering rutnät imprinted in i botten av avbildningskammaren användes för korrigering av x, y- instabilitet.
Korrekt inbäddning av embryot är ett kritiskt steg i protokollet. Det behövs lite övning för att placera strukturen av intresse så nära som möjligt till glasbotten och i omedelbar närhet till nätet utan att överlagra med det.
Den största fördelen med metoden är att det är ett prisvärt och enkelt verktyg för direkt observation av utvecklingsprocesser såsom tillväxt och migration i vardagsembryon över flera timmar. Dessutom dissektionsmikroskop specifika fördelar såsom stort synfält och utökad arbetsavstånd underlätta undersökning av större prov inklusive hela organ. Emellertid vissa begränsningar måste hållas i åtanke. Pausning av experiment för att kontrollera och justera placeringen gör proceduren tidsödande och frånvaron av en robust temperaturkontroll ändrar "standard" utvecklande tid, som definieras som h efter befruktning vid 28,5 ° C i zebrafisk 16. Ett annat potentiellt problem är det selektiva djupet av avbildning i djuret, i synnerhet när strukturen av intresse ligger på insidan av embryo eller larver. En sådan struktur är den zebrafisk pronephric glomerulus, som är belägen mellan de somiter och gulesäcken. Den begränsande djupet för avbildning glomerulus befanns vara ca 200 ^ m, ett avstånd som uppnås efter 5 dagar av utveckling. I kontrast, fluorescerande strukturer som är located närmare ytan av djuret kan avbildas under en längre tid. Till exempel leverceller är tillgängliga för avbildning åtminstone fram till 9 dpf. En ytterligare begränsning är att långsiktigt immobilisering av embryot eller larver i agaros och Tricaine behandling inducerar tillväxthämning och hjärtödem, respektive. Eftersom detta kan störa normal utveckling, är det rekommenderat att begränsa varaktigheten av inspelning med tidsluckor till en viss ränta. För att säkerställa att under avbildnings strukturer av intresse utvecklas normalt är det bra att jämföra (i slutet) helhetsintrycket med den hos ett djur hålls under samma experimentella betingelser men utan att bädda och bedövning.
Inspelning av ett z-stack av optiska sektioner var 30 minuter under en period av 5 timmar och efterföljande beräkning av utökad djup Bilderna oskarpa tillhandahålls rumsliga och tidsmässiga information om tidiga händelser av normal och störd njure utveckling som framkallades by morfolino-medierad knockdown av wt1a. Tidigare utförda morfolino knockdown försök har redan visat att Wt1a fyller en tidig och viktig roll i pronephros bildning in situ hybridisering med njur markör 17,18 och anställning av transgena wt1b. GFP linje för avbildning pronephros utveckling vid fasta tidpunkter 9,10 avslöjade att wt1a brist resulterar i avbruten glomerulär morfogenes och misslyckades podocyte specifikation. I motsats till dessa statiska metoder, time-lapse inspelningar direkt visualisera dynamiken i början nephrogenesis i embryon kontroll och migration av GFP-positiva celler bort från pronephric regionen wt1a morphants. Möjligheten att spåra misrouted celler över tid tillåter en mer detaljerad fenotyp analys.
I allmänhet ger den metod som presenteras här en billig och lätt att använda alternativ till den komplexa, och mindre tillgängliga och för sigtups som normalt används för time-lapse avbildning såsom laserscanning mikroskop (utrustad med en miljökammare och anti-vibrationsbord) eller ljus ark mikroskop. Den beskrivna rutinen att åtgärda driftproblem kan också användas för att utföra tidsförlopp bilder på uppställningar utan optiska sektione alternativ, såsom fluorescens stereoluppar.
Tekniken är inte bara lämpligt att undersöka njur utveckling, men kan också tillämpas för att övervaka normal och defekt morfogenes av andra organ såsom hjärta eller lever. Vidare kan förfarandet användas för att observera olika mer dynamiska processer i embryonala och vuxna modellorganismer såsom sårläkning eller regenerering.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Thomas Bates för kritiskt läsa och förbättra manuskriptet. Vi vill också tacka Christina Ebert och Sabrina Stötzer för fisk underhåll.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |