Metoden er beskrevet her kan time-lapse analyse av organutvikling i sebrafisk embryoer ved hjelp av en fluorescens dissekere mikroskop stand til å utføre optisk seksjonering og enkle strategier for omstilling for å rette fokus og planar drift.
For å forstå organogenese, de romlige og tidsmessige forandringer som oppstår under utvikling av vev trenger å bli tatt opp. Metoden er beskrevet her kan time-lapse analyse av normal og nedsatt nyre utvikling i sebrafisk embryoer ved hjelp av en fluorescens dissekere mikroskop utstyrt for strukturert belysning og z-stack oppkjøpet. For å visualisere nephrogenesis, transgen sebrafisk (Tg (wt1b: GFP)) med fluorescensmerkede nyre strukturer ble brukt. Nyreskader ble utløst ved injeksjon av et antisens oligonukleotid morfolino mot Wilms tumor genet wt1a, en faktor som er kjent for å være avgjørende for utvikling nyre.
Fordelen med den eksperimentelle oppsettet er kombinasjonen av en zoom mikroskop med enkle strategier for re-justering bevegelser i x, y eller z-retningen uten ekstra utstyr. For å omgå fokal avdrift som er indusert av temperaturvariasjoner og mekaniske vibrasjoner, En autofokus strategien ble brukt i stedet for å benytte en vanligvis nødvendig miljøkammeret. For å re-justere posisjonsendringer på grunn av en xy-drift, ble bilde kamre med trykt flytte nett ansatt.
I forhold til mer komplekse oppsett for intervallopptak med optisk seksjonering som confocal laserskanning eller lyse ark mikroskoper, er lett å håndtere en zoom mikroskop. Dessuten tilbyr det dissekere mikroskop-spesifikke fordeler som høy dybdeskarphet og en utvidet arbeidsavstand.
Fremgangsmåten for å studere organogenese presentert her, kan også brukes med fluorescens stereomikroskop ikke er i stand til optisk snitting. Selv om begrenset for høy gjennomstrømning, denne teknikken tilbyr et alternativ til mer komplisert utstyr som vanligvis brukes for intervallopptak for å utvikle vev og organ dynamikk.
Etter gastrulation er organogeneseperioden den neste fasen av et individs livssyklus. Det innebærer den omleiring, samhandling og meget ofte migrasjon av celler til å produsere vev og organer. Unøyaktighet i de prosesser som ligger bak utvikling av organer fører ofte til sykdommer som kan manifestere seg enten umiddelbart eller også senere i livet. Dermed forstå organogeneseperioden har vært en stor innsats i utviklingsbiologi og biomedisinsk forskning. For å være i stand til å undersøke utviklingen av et spesielt organ, må den være synlig selv gjennom kroppsveggen av embryoet. Dette muliggjør opptak av de romlige og tidsmessige forandringer som oppstår under utvikling. Også for å analysere betydningen av faktorer involvert i organogenese, må den være utsatt for manipulering.
En organisme som er svært egnet for undersøkelse av in vivo organogenesen er sebrafisk. dens gjennoency under embryonal utvikling i kombinasjon med bruk av fluorescerende transgene linjer tillater observasjon av protein lokalisering og uttrykk dynamikk, så vel som den visualiseringen av de indre organer 1. Dette gir en unik fordel om etterforskningen av organutvikling i sanntid i forhold til pattedyr modeller som organer er utilgjengelige for mikroskopisk analyse. Videre ulike verktøy er tilgjengelige for å manipulere embryonal utvikling av sebrafisk. Ved genereringen av mutante linjer, kan antisense-oligonukleotider morfolino (MO) anvendes for å knockdown aktiviteten av visse gener som er involvert i utviklingen av enkelte organer. Mos enten målrette en spleisesete eller translasjonsstartkodonet (august), og dermed forstyrre skjøting av pre-mRNA eller oversettelse.
Sebrafisk embryonale nyre, de pronephros, er en anatomisk enkelt, men verdifull modell for å studere nyre utvikling og funksjon av genes knyttet til nyresykdommer 2. Den består av bare to funksjonelle enheter kalt nephrons. Hver nephron består av en glomerulus hvor blodfiltrering foregår tre. Ytterligere komponenter er den korte halsområde, så vel som den segmenterte tubulære for sekresjon og reabsorpsjon av oppløste stoffer og den kanal, som ender i cloaca 4. Uavhengig av dens enkle sammensetning, organisering og de forskjellige celletyper av sebrafisk pronephros er svært lik pattedyrnyre 5,6.
En faktor som er kritisk involvert i nyre utvikling, er kodet av Wilms tumor suppressor-gen WT1 7. Sebrafisk har to paraloger kalt wt1a og wt1b blir uttrykt i et overlappende, men ikke identisk mønster under utviklingen av pronephros 8. Ved å bruke transgene sebrafisk med GFP-merket pronephros strukturer, har det vist seg at fullstendig knock-down av wt1a </ em> eller av en bestemt spleise skjema fører til alvorlige eller mild misdannelser i embryonale nyre, henholdsvis 9,10.
Metoden er beskrevet her kan time-lapse analyse av normal og nedsatt nephrogenesis i sebrafisk embryoer ved å ansette en fluorescens dissekere mikroskop utstyrt for optisk seksjonering via strukturert belysning. Optiske seksjoner generelt tillate oppkjøpet av bilder som bare inneholder i fokus informasjon. Out-of-fokus informasjonen kan unngås ved ulike tilnærminger som for eksempel matematiske algoritmer (f.eks. Dekonvolvering), optisk design (f.eks konfokal laser scanning mikroskopi) eller en kombinasjon av begge (f.eks strukturert belysning).
For å indusere defekter i nyre utvikling vi brukte et anti MO mot wt1a som ble injisert i en transgen sebrafisk linje (Tg (wt1b: GFP)). Denne linjen viser GFP-fluorescens i glomerulus, nakke og fremredel av rørelementet 9,10. I forhold til mer komplekse oppsett for intervallopptak med optisk snitting eksempel laserskanning eller lyse ark mikroskoper, er enkel å håndtere og billigere en zoom mikroskop. Videre kan utstyr for strukturert belysning enkelt kombineres med konvensjonell fluorescens utstyr (f.eks fluorescens lampe, filtre) og tilbud dissekere mikroskop-spesifikke fordeler som en utvidet arbeidsavstand og stort synsfelt. Problemer med drift ble løst uten bruk av ekstra utstyr (miljøkammer, anti-vibrasjon tabell) vanligvis nødvendig for stabile resultater. For å korrigere for fokus drift en autofokus strategien ble etablert og bilde kamre med trykt flytte rutenett ble utnyttet til å re-justere plasseringen etter en drift i x- eller y-retningen.
Den presenterte metoden kan også brukes på mikroskoper uten optiske snitt alternativer, for eksempel fluorescens stereo microscopes og tilbyr et alternativ til mer komplisert utstyr som vanligvis brukes for intervallopptak for å utvikle vev og organ dynamikk.
Sebrafisk har blitt et populært modellorganisme for studier av virveldyr utvikling og modellering av menneskelige sykdommer. Fordi sebrafisk embryoer forbli gjennomsiktig, kan utvikle organer som hjerne og hjerte holdes ved hjelp av en standard forberedelse mikroskop. Benytte seg av transgene linjer med organspesifikk fluorescens gjør vurderinger av organogeneseperioden gjennom ulike stadier av utviklingen innen levende embryoer ved fluorescens mikroskopi. En begrensning for avbildning av konstruksjonsdetaljer av hele organer med standard epifluorescens mikroskopi er virkningen av signaler fra gjenstander over og under midtplanet. Dette ut-av-fokus lys ikke bare resulterer i redusert bilde kontrast og oppløsning, det også kan tilsløre viktige strukturer av interesse 13,14. Flere teknikker som laser scanning confocal-, spinning disk confocal- eller multiphoton mikroskopi er utviklet for å minimere ut-av-fokus informasjon og dermed increase kontrasten i bildet, så vel som aksial oppløsning. En alternativ metode for å skaffe optiske seksjoner er laser- og skanning fri strukturert belysning mikroskopi, et bredt felt basert belysning teknikk som er og enkel å implementere på et vanlig mikroskop 15. Resultatene som presenteres her viser at optisk snitting oppnås ved strukturert belysning, implementert på en dissekere mikroskop og kombinert med rekonstruksjon av utvidet fokus bilder, muliggjør visualisering av strukturelle detaljer om normal og forstyrret nyre utvikling i sebrafisk. Spesielt er de GFP-positive celler i wt1a morphants dispergert ved forskjellige fokal dybder, og bilder av bare ett plan med ut-av-fokus uskarphet, vil undervurdere den tredimensjonale kompleksiteten av fenotype.
Å følge dynamikken i organ organisasjon, omorganisering eller avbrudd, er time-lapse fluorescens mikros en kraftig riktignok komplisert teknikk. Under time-lapsebildebehandling små vibrasjoner eller mindre temperatursvingninger føre fonner i x, y eller z-retningen. Dette krever ekstra utstyr (miljøkammer, anti-vibrasjonsbord) for å oppnå stabile resultater. Den presenterte metoden bruker evnen til en dissekere mikroskop med en motorisert fokus stasjon for opptakstid-lapse bilder uten ekstra enheter. For å opprettholde en stabil fokus, ble en autofokus strategi etablert og en flytting gitter trykt inn i bunnen av avbildningskammeret ble brukt for korrigering av x, y-ustabilitet.
Riktig innebygging av embryoet er et kritisk punkt i protokollen. Litt øvelse er nødvendig for å plassere strukturen av interesse så nær som mulig til glassbunn og i umiddelbar nærhet til nettet uten å overliggende med den.
Den største fordel ved fremgangsmåten er at det er en rimelig og enkelt verktøy for direkte observasjon av utviklingsmessige prosesser som vekst og migrasjon i levendeembryoer over flere timer. Videre disseksjon mikroskop-spesifikke fordeler som stort synsfelt og utvidet arbeidsavstand lette undersøkelse av større prøver, inkludert hele organer. Men noen begrensninger må holdes i tankene. Midlertidig stopping av forsøket for å kontrollere og justere posisjoneringen gjør prosedyren tidkrevende og fraværet av en robust temperaturkontroll forandrer "standard" utviklings tid, som er definert som timer etter befruktning ved 28,5 ° C i 16 sebrafisk. Et annet potensielt problem er begrenset dybden av bildebehandling i dyret, spesielt når strukturen av interesse ligger inne embryo eller larver. En slik struktur er sebrafisk pronephric glomerulus, som ligger mellom somites og plommesekken. Den begrensende dybde for å avbilde glomerulus ble funnet å være omtrent 200 um, en avstand som er nådd etter 5 dagers utvikling. I motsetning til dette, fluorescerende strukturer som er located nærmere overflaten av dyret kan avbildes for en lengre tid. For eksempel leverceller er tilgjengelige for avbildning i hvert fall inntil 9 dpf. En ytterligere begrensning er at langvarig immobilisering av embryoet eller larver i agarose og Tricaine behandling indusere veksthemming og hjerteødem, respektivt. Fordi dette kan forstyrre normal utvikling, er det anbefalt å begrense varigheten av intervallopptak til en viss interesse. For å sikre at under bilde strukturer av interesse utvikle seg normalt er det nyttig å sammenligne (på slutten) helhetsinntrykket med at av et dyr holdes under samme eksperimentelle forhold, men uten innebygging og bedøvelsen.
Spille inn en z-stack av optiske deler hvert 30. minutt i løpet av en periode på fem timer og påfølgende beregning av utvidet dybde av fokus bilder gitt romlig og tidsmessig informasjon om tidlige hendelsene i normal og forstyrret nyre utvikling som ble indusert by morfolino-mediert knockdown av wt1a. Tidligere utførte morfolino knockdown forsøk har allerede vist at Wt1a oppfyller en tidlig og viktig rolle i pronephros formasjon In situ hybridisering med nyre markør 17,18 og ansettelse av transgene wt1b. GFP linje for bildebehandling pronephros utvikling på fast tid peker 9,10 avslørt at wt1a mangel fører til forstyrret glomerulær morphogenesis og mislyktes podocyte spesifikasjonen. I motsetning til disse statiske metoder, time-lapse opptak direkte visualisere dynamikk tidlig nephrogenesis i kontrollembryoer og migrering av GFP-positive celler fra pronephric region i wt1a morphants. Muligheten for å spore sendt feil celler over tid muliggjør en mer detaljert analyse fenotype.
Generelt er fremgangsmåten som er presentert her gir en billig og enkel å bruke alternativ til de komplekse, og mindre tilgjengelig for segtups normalt brukes for time-lapse bildebehandling som for eksempel laser scanning mikroskop (utstyrt med et miljøkammer og anti-vibrasjon bord) eller lys ark mikroskop. Det beskrevne rutine å fikse driftproblemer kan også brukes til å utføre intervall bilder på oppsett uten optiske snitt alternativer, for eksempel fluorescens stereomikroskop.
Teknikken er ikke bare egnet for å undersøke nyrene utvikling, men kan også anvendes for å overvåke normal og defekte morfogenese av andre organer slik som hjerte og lever. Videre kan fremgangsmåten brukes til å observere forskjellige flere dynamiske prosesser i embryonisk og voksen modellorganismer så som sårheling og regenerering.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Thomas Bates for kritisk lesing og forbedre manuskriptet. Vi takker også Christina Ebert og Sabrina Stötzer for fisk vedlikehold.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |