Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer-Analyse der Organentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenzmikroskop mit Lage ist, eine optische Schnitte und einfache Strategien der Neueinstellung Sezieren fokale und planaren Drift zu korrigieren.
Um Organogenese, die räumlichen und zeitlichen Veränderungen zu verstehen, die während der Entwicklung von Geweben auftreten müssen aufgezeichnet werden. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer Analyse von normaler und eingeschränkter Nierenentwicklung in Genaktivität durch ein Fluoreszenz Binokular zur strukturierten Beleuchtung und z-Stapelerfassung ausgestattet ist. Mit fluoreszenzmarkierten Nierenstrukturen wurden verwendet: Um Nephrogenese, transgene Zebrabärbling (GFP) Tg (wt1b) zu visualisieren. Renal Defekte wurden durch Injektion eines Antisense – Morpholino – Oligonukleotid gegen das Wilms – Tumor – Gen wt1a ein Faktor bekannt ausgelöst für Nierenentwicklung von entscheidender Bedeutung.
Der Vorteil des experimentellen Aufbaus ist die Kombination eines Zoom-Mikroskop mit einfachen Strategien zur Wiederstellbewegungen in x-, y- oder z-Richtung ohne zusätzliche Ausrüstung. Zur Umgehung Fokusdrift, die durch Temperaturschwankungen und mechanischen Schwingungen induziert wirdWurde eine Autofokus-Strategie statt der Verwendung einer in der Regel erforderlich Umweltkammer angelegt. Eingesetzt, um die Positionsänderungen aufgrund einer xy-Drift, Imaging Kammern mit aufgedrucktem Verlagerung Gitter wurden neu zu justieren.
Im Vergleich zu komplexeren Einstellungen für Zeitrafferaufnahme mit optischen Schneidens wie konfokalen Laser-Scanning oder Lichtbogen-Mikroskope, ist ein Zoom-Mikroskop leicht zu handhaben. Außerdem bietet es Binokular spezifische Vorteile wie hohe Schärfentiefe und einem erweiterten Arbeitsabstand.
Die Methode zum Studium der Organogenese hier präsentiert werden, können auch mit Fluoreszenz-Stereomikroskope nicht in der Lage des optischen Schneidens verwendet werden. Obwohl begrenzt für hohen Durchsatz, bietet diese Technik eine Alternative zu komplexeren Geräten, die normalerweise für Zeitrafferaufnahme der Entwicklung von Geweben und Organ Dynamik verwendet wird.
Nach der Gastrulation ist organogenesis die nächste Stufe der Lebenszyklus eines Individuums. Es beinhaltet die Umlagerung, Interaktion und sehr oft Migration von Zellen Gewebe und Organe zu erzeugen. Unrichtigkeit in den Prozessen zugrunde liegenden führt die Entwicklung von Organen oft zu Krankheiten, die sich manifestieren kann entweder sofort oder auch später im Leben. So wurde in der Entwicklungsbiologie und der biomedizinischen Forschung eine große Anstrengung der Organogenese zu verstehen. Hat, um in der Lage, die Entwicklung eines bestimmten Organs zu untersuchen, ist es auch durch die Körperwand des Embryos sichtbar. Dies ermöglicht die Aufzeichnung der räumlichen und zeitlichen Veränderungen, die während der Entwicklung auftreten. Auch, um die Bedeutung der Faktoren in der Organogenese beteiligt zu analysieren, muss sie manipulierbar sein.
Einen Organismus, der für die Untersuchung der in vivo Organogenese überaus geeignet ist , ist Zebrabärbling. seine durchsichrenz während der Embryonalentwicklung in Kombination mit der Verwendung von Fluoreszenz – transgenen Linien ermöglicht die Beobachtung der Proteinlokalisierung und Expression Dynamik sowie die Visualisierung der inneren Organe 1. Dies bietet einen einzigartigen Vorteil in Bezug auf die Untersuchung der Organentwicklung in Echtzeit im Vergleich zu Säugetieren Modelle, deren Organe sind nicht zugänglich für die mikroskopische Analyse. Darüber hinaus sind verschiedene Werkzeuge Embryonalentwicklung von Zebrabärbling zu manipulieren, zur Verfügung. Neben der Erzeugung von Mutantenlinien, Antisense-Morpholino-Oligonukleotide (MO) kann verwendet werden, um die Aktivität bestimmter Gene Knockdown, die in der Entwicklung bestimmter Organe beteiligt sind. MOs entweder zielen auf eine Spleißstelle oder das Translationsstartcodon (AUG) und dadurch mit Spleißen von prä-mRNA oder Translation stören.
Der Zebrabärbling embryonale Niere, die pronephros, ist ein anatomisch einfache, aber wertvolle Modell der Nierenentwicklung und die Funktion der Gen zu studierenes im Zusammenhang mit Nierenerkrankungen 2. Es besteht aus nur zwei Funktionseinheiten genannt Nephronen. Jedes Nephron besteht aus einem Glomerulus , wo die Blutfiltration stattfindet 3. Weitere Komponenten sind die Kurzhalsbereich sowie das segmentierte Tubulus für die Sekretion und Resorption von gelösten Stoffen und der Leitung, die 4 in der Kloake endet. Unabhängig von seiner einfachen Zusammensetzung, die Organisation und die verschiedenen Zelltypen der Zebrabärbling pronephros sind sehr ähnlich zu der Säugetierniere 5,6.
Ein Faktor, der in der Nierenentwicklung kritisch beteiligt ist, kodiert durch das Wilms Tumor – Suppressor – Gen Wt1 7. Zebrabärbling besitzen zwei Paraloge genannt wt1a und wt1b in einer überlappenden , aber nicht identischen Muster bei der Entwicklung der pronephros 8 ausgedrückt werden. Durch die Verwendung von transgenen Zebrafisch mit GFP-markierten pronephros Strukturen, es hat sich gezeigt , dass komplette Knock-down von wt1a gezeigt </ em> oder eines bestimmten Splice Form führt zu schweren oder leichten Fehlbildungen der embryonalen Nieren bzw. 9,10.
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht Zeitraffer Analyse normaler und gestörter Nephrogenese in Genaktivität durch eine Fluoreszenz unter Verwendung von Binokular über strukturierte Beleuchtung für optische Schnitte ausgestattet. Optische Schnitte in der Regel möglich, den Erwerb von Bildern, die nur im Fokus befindlichen Informationen enthalten. Out-of-focus Informationen kann durch verschiedene Ansätze wie mathematischer Algorithmen (zB. Dekonvolution), optische Gestaltung (zB konfokalen Laser – Scanning – Mikroskopie) oder eine Kombination von beiden (zB strukturierte Beleuchtung) vermieden werden.
Um induzieren Defekte in der Nierenentwicklung verwendeten wir ein Antisense – MO gegen wt1a, die in einer transgenen Zebrabärbling Linie (Tg (wt1b: GFP)) injiziert wurde. Diese Linie zeigt GFP-Fluoreszenz in den Glomeruli, Hals und der vorderenTeil des Röhrchens 9,10. Im Vergleich zu komplexeren Einstellungen für Zeitrafferaufnahmen mit optischen Schneidens wie Laser-Scanning oder Lichtbogen-Mikroskope, ist ein Zoom-Mikroskop leicht zu handhaben und kostengünstiger. Darüber hinaus leicht für strukturierte Beleuchtungseinrichtung mit herkömmlichen Fluoreszenzausrüstung kombiniert werden (zB Fluoreszenzlampe, Filter) und bietet Mikroskop spezifische Vorteile , wie beispielsweise einen erweiterten Arbeitsabstand und großes Sehfeld sezieren. Probleme mit Drift wurden ohne Verwendung zusätzlicher Ausrüstung (Klimakammer, Anti-Vibrationstisch) erfordert in der Regel stabile Ergebnisse gelöst. Zur Korrektur wurde für Fokusdrift eine Autofokus-Strategie festgelegt und Imaging-Kammern mit aufgedruckten Verlagerung Gitter wurden verwendet, um neu zu justieren die Positionierung nach einer Drift in x oder y-Richtung.
Das vorgestellte Verfahren kann auch auf Mikroskope ohne optische Sektionierung Optionen angewendet werden, wie Fluoreszenz-Stereo microscopes und bietet eine Alternative zu komplexeren Geräten, die normalerweise für Zeitrafferaufnahme der Entwicklung von Geweben und Organ Dynamik verwendet wird.
Der Zebrabärbling hat für die Untersuchung der Entwicklung von Wirbeltieren und Modellierung menschlicher Krankheiten ein beliebter Modellorganismus geworden. Da Genaktivität transparent bleiben, die Entwicklung von Organen wie Gehirn und Herz kann mit einem Standardpräparat Mikroskop beobachtet werden. Unter Ausnutzung der transgenen Linien mit organspezifischen Fluoreszenz ermöglicht Einschätzungen der Organogenese in ganz unterschiedlichen Stadien der Entwicklung in lebenden Embryonen, die durch Fluoreszenzmikroskopie. Eine Einschränkung für die Abbildung strukturellen Details ganzer Organe mit Standard-Epifluoreszenzmikroskopie ist die Auswirkung von Signalen von Objekten oberhalb und unterhalb der Brennebene. Diese Out-of-Fokus Licht nicht nur zu einer verminderten Bildkontrast und die Auflösung kann es auch wichtig , die Strukturen von Interessen 13,14 verschleiern. Verschiedene Techniken, wie beispielsweise Laser-Scanning Konfokal- wurden Spinnscheibe Konfokal- oder Multiphotonenmikroskopie entwickelt, um die out-of-focus Informationen zu minimieren und dadurch increase Bildkontrast sowie axiale Auflösung. Ein alternatives Verfahren , optische Schnitte zu erhalten , ist die laser- und Scannen frei strukturierten Beleuchtung Mikroskopie, ein weites Feld basierte Beleuchtungstechnik , die ist und einfach auf einem normalen Mikroskop 15 zu implementieren. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass optische Schnitte durch strukturierte Beleuchtung erreicht, auf einem Binokular umgesetzt und mit dem Wiederaufbau der erweiterten Fokus Bilder kombiniert, Visualisierung von strukturellen Details der normalen ermöglicht und gestörte Nierenentwicklung in Zebrabärbling. Insbesondere werden die GFP-positiven Zellen in wt1a morphants bei verschiedenen Fokustiefen dispergiert und Bilder von nur einer Ebene mit Out-of – Fokus verwischen würde unterschätzen die dreidimensionale Komplexität des Phänotyps.
Um die Dynamik von Organ Organisation, Umlagerung oder Störung, Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie ist ein leistungsfähiges, wenn auch komplexe Technik folgen. Während im ZeitrafferBildgebung leichte Vibrationen oder geringfügige Temperaturschwankungen verursachen Drifts in x, y oder z-Richtung. Dies erfordert zusätzliche Ausrüstung (Klimakammer, Anti-Vibrations-Tabelle), um stabile Ergebnisse zu erzielen. Die vorgestellte Methode nutzt die Fähigkeit eines Binokular mit einem motorisierten Fokustrieb für Zeitraffer-Bilder ohne zusätzliche Geräte aufnehmen. Um einen stabilen Fokus halten, wurde eine Autofokus-Strategie festgelegt und eine Verlagerung Gitter in den Boden der Abbildungskammer eingeprägt wurde zur Korrektur der x, y- Instabilität verwendet.
Proper Einbettung des Embryos ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Einige der Praxis ist notwendig, um das Netz der Struktur von Interesse so nah wie möglich an den Glasboden und in unmittelbarer Nähe zu platzieren, ohne mit ihm überlagert.
Der wesentliche Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass es eine kostengünstige und einfaches Werkzeug für die direkte Beobachtung von Entwicklungsprozessen wie Wachstum und Migration in Lebens istEmbryonen über mehrere Stunden. Darüber hinaus erleichtern die Präpariermikroskop spezifische Vorteile wie große Sichtfeld und erweiterten Arbeitsabstand Prüfung von größeren Proben einschließlich ganzer Organe. Allerdings haben einige Einschränkungen im Auge behalten werden. Pausieren des Experiments zu überprüfen und die Positionierung nachstellen macht das Verfahren zeitaufwendig und das Fehlen einer robusten Temperaturregelung ändert sich die "Standard" Entwicklungszeit, die als h nach der Befruchtung bei 28,5 ° C für Zebrabärbling 16 definiert ist. Ein weiteres mögliches Problem ist die beschränkte Tiefe der Bildgebung in das Tier, insbesondere wenn der interessierende Struktur innerhalb des Embryos oder Larven entfernt. Eine solche Struktur ist der Zebrabärbling pronephric Glomerulus, die zwischen den Somiten und des Dottersacks befindet. Die Grenztiefe Glomerulus zur Bebilderung wurde mit etwa 200 um, eine Entfernung zu sein, die nach 5 Tagen der Entwicklung erreicht ist. Im Gegensatz dazu fluoreszierende Strukturen, die located an der Oberfläche des Tieres näher kann für eine längere Zeit abgebildet werden. Zum Beispiel sind Leberzellen für die Abbildung mindestens bis 9 dpf zugänglich. Eine weitere Einschränkung ist, dass langfristige Immobilisierung des Embryos oder Larven in Agarose und Tricaine Behandlung Wachstumsverzögerung und kardialen Ödemen induzieren, beziehungsweise. Da dies mit der normalen Entwicklung beeinträchtigen können, wird empfohlen, die Dauer der Zeitrafferaufnahme auf einen bestimmten Zeitraum von Interesse zu beschränken. Um das zu entwickeln, während der Bildgebung Strukturen von Interesse sicherzustellen, normalerweise ist es hilfreich zu vergleichen (am Ende) das Gesamtbild mit der eines Tieres unter gleichen Versuchsbedingungen gehalten, aber ohne Einbettung und anesthetization.
Aufnahme eines z-Stapel von optischen Schnitten alle 30 Minuten über einen Zeitraum von 5 Stunden und die anschließende Berechnung der erweiterten Tiefenschärfe Bilder räumliche und zeitliche Informationen über die frühen Ereignisse der normalen zur Verfügung gestellt und gestörte Nierenentwicklung, die b induziert wurdey morpholino-vermittelten Knockdown von wt1a. Zuvor durchgeführt Morpholino Knockdown Versuche haben bereits gezeigt , dass Wt1a eine frühe und wichtige Rolle bei der Bildung pronephros erfüllt In – situ – Hybridisierung mit Nieren Marker 17,18 und Beschäftigung des transgenen wt1b. GFP Linie für die Bildgebung pronephros Entwicklung zu festen Zeitpunkten 9,10 ergab , dass wt1a Mangel führt zu einer gestörten glomerulären Morphogenese und gescheiterte podocyte Spezifikation. Im Gegensatz zu diesen statischen Ansätze, Zeitraffer-Aufnahmen direkt Dynamik der frühen Nephrogenese Kontrolle Embryonen zu visualisieren und die Migration von GFP-positiven Zellen entfernt von der pronephric Region wt1a morphants. Die Möglichkeit misrouted Zellen im Laufe der Zeit zu verfolgen, ermöglicht eine detailliertere Analyse Phänotyp.
Im Allgemeinen, dass das hier vorgestellte Verfahren wird ermöglicht eine preiswerte und einfache Alternative zu dem Komplex zu verwenden, und weniger zugänglich setups normalerweise für Zeitraffer-Bildgebung wie Laser-Scanning-Mikroskop (ausgestattet mit einer Klimakammer und Anti-Vibrationstisch) oder Lichtblatt-Mikroskop verwendet. Die beschriebene Routine Driftprobleme zu beheben, kann auch angewendet werden Zeitraffer-Bilder auf Setups ohne optische Schnitte Optionen, wie Fluoreszenz-Stereomikroskope auszuführen.
Die Technik eignet sich nicht nur Nierenentwicklung zu untersuchen, sondern auch normale und defekte Morphogenese von anderen Organen wie Herz oder Leber zur Überwachung angewendet werden. verschiedene dynamischer Prozesse in embryonalen und adulten Modellorganismen zu beobachten, wie der Wundheilung oder der Regeneration Des Weiteren kann das Verfahren verwendet werden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Thomas Bates für kritisch zu lesen und das Manuskript zu verbessern. Wir danken auch Christina Ebert und Sabrina Stötzer für Fische Wartung.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |