O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar.
A fim de compreender a organogénese, as alterações espaciais e temporais que ocorrem durante o desenvolvimento de tecidos necessitam de ser gravado. O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento normal e deficiente renal em embriões de peixe-zebra, utilizando um microscópio de fluorescência de dissecação equipado para iluminação estruturada e aquisição de z-stack. Para visualizar nefrogênese, peixes-zebra transgénicos (Tg (wt1b: GFP)) foram utilizadas estruturas renais com fluorescente etiquetado. Defeitos renais foram provocados por injecção de um oligonucleótido anti-sentido morfolino contra o wt1a gene de tumor de Wilms, um factor conhecido por ser crucial para o desenvolvimento do rim.
A vantagem da configuração experimental é a combinação de um microscópio de zoom com estratégias simples para os movimentos de ajuste re-em x, y ou z direção sem equipamento adicional. Para contornar deriva focal que é induzido por variações de temperatura e vibrações mecânicas, Uma estratégia de focagem automática foi aplicado em vez de utilizar uma câmara ambiental normalmente exigido. A fim de voltar a ajustar as mudanças de posição devido a um xy-drift, foram empregados câmaras de imagem com grades de realocação estampado.
Em comparação com configurações mais complexas para a gravação de lapso de tempo com seccionamento óptico, tais como varredura a laser confocal ou microscópios folha de luz, um microscópio zoom é fácil de manusear. Além disso, oferece dissecando benefícios específicos do microscópio, como alta profundidade de campo e uma distância de trabalho estendida.
O método para estudar a organogénese aqui apresentada também pode ser usado com microscópios de fluorescência estéreo não capazes de seccionamento óptico. Embora limitado para high-throughput, esta técnica oferece uma alternativa aos equipamentos mais complexa, que é normalmente utilizado para a gravação de lapso de tempo de tecidos em desenvolvimento e dinâmica de órgãos.
Seguindo a gastrulação, organogênese é o próximo estágio do ciclo de vida de um indivíduo. Trata-se o rearranjo, interacção e, muitas vezes, a migração de células para a produção de tecidos e órgãos. Imprecisão nos processos subjacentes ao desenvolvimento de órgãos, muitas vezes leva a doenças que podem se manifestar imediatamente ou também mais tarde na vida. Assim, a compreensão organogênese tem sido um grande esforço na biologia do desenvolvimento e investigação biomédica. A fim de poder investigar o desenvolvimento de um órgão em particular, tem que ser visível até mesmo através da parede do corpo do embrião. Isto permite a gravação das alterações espaciais e temporais que ocorrem durante o desenvolvimento. Além disso, a fim de analisar a importância de fatores envolvidos na organogênese, ele precisa ser suscetíveis à manipulação.
Um organismo que é extremamente adequado para a investigação de organogênese in vivo é peixe-zebra. sua transparrência durante o desenvolvimento embrionário, em combinação com a utilização de linhas transgénicas fluorescentes permite a observação da localização da proteína de expressão e dinâmica, bem como a visualização dos órgãos internos 1. Isto proporciona uma vantagem única sobre a investigação do desenvolvimento dos órgãos em tempo real, em comparação com modelos de mamíferos cujos órgãos são inacessíveis para análise microscópica. Além disso, diferentes ferramentas estão disponíveis para manipular o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Para além da geração de linhas mutantes, os oligonucleótidos anti-sentido de morfolino (MO) pode ser usada para knockdown da actividade de genes particulares que estão envolvidas no desenvolvimento de certos órgãos. MOs segmentar um local de união ou a translação códon de iniciação (AUG) e, assim, interferir com splicing de pré-mRNA ou a tradução.
O rim de embrião de peixe-zebra, os pronephros, é um modelo anatomicamente simples, mas valiosa para estudar o desenvolvimento renal ea função do genes relacionadas com doenças renais 2. É composto por apenas duas unidades funcionais chamadas néfrons. Cada néfron consiste de um glomérulo, onde filtração do sangue tem lugar 3. Outros componentes são a região pescoço curto, bem como do túbulo segmentada para a secreção e reabsorção dos solutos e a conduta, que termina na cloaca 4. Independentemente da sua composição simples, a organização e os diferentes tipos de células do pronephros de peixe-zebra são muito semelhante a um rim de mamífero 5,6.
Um factor, que é criticamente envolvido no desenvolvimento do rim, é codificada pelo gene supressor do tumor de Wilms WT1 7. Zebrafish possuem dois paralogs chamados wt1a e wt1b ser expresso em um padrão idêntico de sobreposição, mas não durante o desenvolvimento dos pronephros 8. Usando peixes-zebra transgénicos com estruturas pronephros marcado com GFP, foi demonstrado que knock-down completa de wt1a </ em> ou de uma forma de emenda específica leva a malformações graves ou leves de rim embrionário, respectivamente 9,10.
O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de nefrogênese normal e deficiente em embriões de peixe-zebra, empregando um microscópio de fluorescência de dissecação equipado para corte óptico através de iluminação estruturada. secções ópticas em geral permitem a aquisição de imagens que só contêm informações em foco. Fora de foco informação pode ser evitado por várias abordagens, tais como algoritmos matemáticos (eg.) De desconvolução, desenho óptico (por exemplo, de microscopia confocal de varrimento laser) ou uma combinação de ambos (por exemplo, a iluminação estruturada).
Para induzir defeitos no desenvolvimento do rim foi utilizado um anti-sentido contra MO wt1a que foi injectado em uma linha de peixes-zebra transgénicos (Tg (wt1b: GFP)). Esta linha mostra GFP-fluorescência no glomérulo, pescoço e o anteriorparte do túbulo 9,10. Em comparação com configurações mais complexas para as gravações time-lapse com seccionamento óptico, como a digitalização a laser ou microscópios folha de luz, um microscópio zoom é fácil de manusear e menos dispendioso. Além disso, Equipamento de iluminação estruturada pode ser facilmente combinado com equipamento convencional de fluorescência (por exemplo, a fluorescência da lâmpada, filtros) e ofertas de dissecação vantagens específicas do microscópio, como uma distância de trabalho prolongada e grande campo de visão. Problemas com tração foram resolvidos sem o uso de equipamento adicional (câmara ambiental, mesa de anti-vibração) geralmente necessária para obter resultados estáveis. Para corrigir o desvio de foco uma estratégia de foco automático foi estabelecido e câmaras de imagem com grades de realocação impressos foram utilizados para reajustar o posicionamento seguindo um desvio na direção x ou y.
O método apresentado pode também ser aplicado para microscópios ópticos sem opções de seccionamento, tais como fluorescência estéreo microscopes e oferece uma alternativa aos equipamentos mais complexa, que é normalmente utilizado para a gravação de lapso de tempo de tecidos em desenvolvimento e dinâmica de órgãos.
O peixe-zebra tornou-se um organismo modelo popular para estudos de desenvolvimento de vertebrados e modelagem de doenças humanas. Porque os embriões de peixe-zebra continuar a ser transparente, desenvolvimento órgãos como cérebro e do coração podem ser observados usando um microscópio preparação padrão. Aproveitando-se de linhagens transgênicas com fluorescência específica do órgão permite avaliações de organogênese em toda a diferentes estágios de desenvolvimento dentro de embriões vivos por microscopia de fluorescência. Uma limitação para a imagiologia detalhes estruturais de órgãos inteiros com microscopia de epifluorescência padrão é o impacto dos sinais de objectos acima e abaixo do plano focal. Esta luz fora de foco não só resulta em diminuição do contraste e resolução da imagem, ele também pode obscurecer estruturas importantes de interesse 13,14. Várias técnicas como confocal- de varredura a laser, fiação confocal- disco ou microscopia multiphoton foram desenvolvidos para minimizar a informação para fora de foco e, assim increaso contraste da imagem e bem como a resolução axial. Um método alternativo para obtenção de cortes ópticos é a microscopia de iluminação laser e a digitalização sem estruturado, uma grande técnica de iluminação de campo com base que é e simples de implementar em um microscópio comum 15. Os resultados aqui apresentados mostram que seccionamento óptico, alcançado pela iluminação estruturada, implementado em um microscópio de dissecação e combinada com a reconstrução de imagens de foco estendidos, permite a visualização de detalhes estruturais do normal e perturbado desenvolvimento renal no peixe-zebra. Em particular, as células positivas para GFP em morphants wt1a são dispersos em várias profundidades focais, e as imagens de um único plano com desfocagem do foco para fora-de- seria subestimar a complexidade tridimensional do fenótipo.
Para acompanhar a dinâmica do órgão organização, rearranjo ou interrupção, microscopia de lapso de tempo de fluorescência é um poderoso ainda que técnica complexa. Durante time-lapseimagiologia ligeiras vibrações ou oscilações de temperatura menores causar desvios na direção x, y ou z. Isto exige equipamento adicional (câmara ambiental, tabela anti-vibração), de modo a obter resultados estáveis. O método apresentado utiliza a capacidade de um microscópio de dissecação com uma unidade de foco motorizado para gravar imagens de lapso de tempo, sem dispositivos extras. Para manter um foco estável, uma estratégia de focagem automática e foi estabelecida uma grelha de deslocalização impressa na parte inferior da câmara de imagem foi usada para correcção de x, y instabilidade.
incorporação adequada do embrião é um passo crítico no âmbito do protocolo. Alguns prática é necessário para colocar a estrutura de interesse tão próximo quanto possível do fundo de vidro, e em proximidade à rede sem sobreposição com ela.
A principal vantagem do método é que ele é uma ferramenta simples e a preços acessíveis para a observação directa dos processos de desenvolvimento, tais como o crescimento e migração de estar emembriões durante várias horas. Além disso, os benefícios específicos do microscópio de dissecação, como grande campo de visão e distância de trabalho estendida facilitar o exame de amostras maiores, incluindo órgãos inteiros. No entanto, algumas limitações devem ser mantidos em mente. A pausa da experiência para verificar e reajustar o posicionamento faz com que o procedimento demorado e a ausência de um controlo de temperatura robusta altera o tempo de desenvolvimento "standard", o qual é definido como h após a fertilização a 28,5 ° C durante 16 peixes-zebra. Outro problema potencial é restrito a profundidade de processamento de imagem em que o animal, particularmente quando a estrutura de interesse está localizado dentro do embrião ou larvas. Uma tal estrutura é o glomérulo pronephric peixe-zebra, o qual está situado entre as somitos e do saco vitelino. A profundidade limitante para a imagiologia do glomérulo verificou-se ser cerca de 200 um, a uma distância que é atingido após 5 dias de desenvolvimento. Em contraste, as estruturas que são fluorescentes located mais perto da superfície do animal pode ser trabalhada durante mais tempo. Por exemplo células do fígado são acessíveis para geração de imagens, pelo menos, até 9 de dpf. Uma outra limitação é que a imobilização de longo prazo do embrião ou em larvas de agarose e tratamento tricaina induzir atraso do crescimento e do edema cardíaco, respectivamente. Uma vez que esta pode interferir com o desenvolvimento normal, recomenda-se a limitar a duração de gravação de lapso de tempo para um certo período de interesse. Para assegurar que durante a estruturas de imagiologia de interesse desenvolver-se normalmente que é útil para comparar (no final) a aparência geral com a de um animal mantido sob as mesmas condições experimentais, mas sem a incorporação e anestesiados.
Gravação de um z-stack de cortes ópticos a cada 30 minutos durante um período de 5 horas e subsequente cálculo da profundidade de foco imagens estendida fornecida informação espacial e temporal sobre os eventos iniciais do normal e perturbado desenvolvimento rim, que foi induzida bknockdown de wt1a y morfolino-mediada. Morfolino knockdown experimentos realizados previamente já mostraram que Wt1a cumpre um papel precoce e essencial na formação pronephros A hibridação in situ com o marcador renal 17,18 eo emprego do wt1b transgênico:. Linha de GFP para o desenvolvimento pronephros de imagem em tempo fixo aponta 9,10 revelado que os resultados da deficiência wt1a em morfogênese glomerular interrompido e não especificação podócitos. Em contraste com estas abordagens estáticos, gravações de lapso de tempo de visualizar directamente dinâmica nefrogênese precoce nos embriões de controlo e a migração de células positivas para GFP para fora da região em pronephric morphants wt1a. A possibilidade de controlar as células misrouted ao longo do tempo permite uma análise mais detalhada fenótipo.
Em geral, o método que é aqui apresentada fornece um método barato e fácil de usar alternativa para o complexo, e menos acessíveis SEtups normalmente utilizado para geração de imagens de lapso de tempo, como microscópio de varredura a laser (equipado com uma câmara ambiental e mesa de anti-vibração) ou folha de microscópio de luz. A rotina descrita para corrigir problemas de deriva pode também ser aplicado para realizar imagens de lapso de tempo sobre as configurações sem opções de seccionamento ópticos, como microscópios de fluorescência estéreo.
A técnica não só é adequado para investigar o desenvolvimento do rim, mas também pode ser aplicado para monitorizar morfogénese normal e deficiente de outros órgãos tais como o coração ou o fígado. Além disso, o método pode ser usado para observar vários processos mais dinâmicos em organismos embrionário e adulto modelo, tais como a cicatrização de feridas ou de regeneração.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Thomas Bates para a leitura e melhorar o manuscrito de forma crítica. Agradecemos também a Christina Ebert e Sabrina Stötzer para manutenção dos peixes.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |