השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.
על מנת להבין organogenesis, תיקונים במרחב ובזמן המתרחשות במהלך ההתפתחות של רקמות צריכים להיות מוקלטים. השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח כלייתי תקין ולקויי עוברי דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ לנתח פלואורסצנטי מצויד לתאורת מובנים ורכישת Z- מחסנית. כדי להמחיש nephrogenesis, דג הזברה מהונדס (TG (wt1b: GFP)) עם מבנים כליות שכותרתו fluorescently היו בשימוש. פגמי כליות היו מופעלים על ידי הזרקה של oligonucleotide morpholino antisense נגד wt1a גן הגידול ע"ש ווילם, גורם ידוע להיות חיוני לפיתוח כליות.
היתרון של הגדרת הניסוי הוא שילוב של מיקרוסקופ זום עם אסטרטגיות פשוטות עבור תנועות התאמת מחדש ב x, y או z בכיוון ללא ציוד נוסף. כדי לעקוף מוקדים להיסחף כי הוא מושרה על ידי הפרשי טמפרטורות ותנודות מכני, אסטרטגית פוקוס אוטומטית יושמה במקום ניצול תא סביבתי הנדרש בדרך כלל. כדי להתאים מחדש את השינויים שנרשמו במיקום בשל XY להיסחף, תאי הדמיה עם רשתות רילוקיישן מוטבעות הועסקו.
בהשוואת setups מורכב יותר להקלטת הזמן לשגות עם חתך אופטי כגון סריקת ליזר confocal או מיקרוסקופי גיליון אור, מיקרוסקופ זום קל לטפל. חוץ מזה, היא מציעה לנתח יתרונות ספציפי מיקרוסקופ כגון עומק שדה גדול יותר וכן מרחק עבודה ממושך.
השיטה ללמוד organogenesis המוצגת כאן יכולה לשמש גם עם מיקרוסקופי סטריאו הקרינה לא מסוגלים חתך אופטי. למרות מוגבל עבור תפוקה גבוהה, טכניקה זו מציעה אלטרנטיבת ציוד מורכב יותר כי משמש בדרך כלל עבור הקלטת הזמן לשגות של רקמות בפיתוח ודינמיקת איברים.
בעקבות gastrulation, organogenesis הוא השלב הבא של מחזור החיים של הפרט. היא כוללת את הסידור מחדש, אינטראקציה ולעתים קרובות הגירה של תאים לייצר רקמות ואיברים. חוסר דיוק בתהליכים שבבסיס התפתחות האיברים מוביל לעתים קרובות מחלות שיכולות להתבטא מייד או גם בשלב מאוחר יותר בחיים. לפיכך, הבנת organogenesis כבר מאמץ אדיר בביולוגיה התפתחותית מחקר ביו. על מנת להיות מסוגל לחקור את הפיתוח של איבר מסוים, זה חייב להיות גלוי אפילו דרך קיר הגוף של העובר. זה מאפשר הקלטה של שינויים במרחב ובזמן המתרחשות במהלך הפיתוח. כמו כן על מנת לנתח את החשיבות של הגורמים המעורבים organogenesis, זה צריך להיות רגיש מניפולציה.
אורגניזם אחד כי הוא מתאים מאוד לחקירת organogenesis in vivo הוא דג הזברה. שלה transparency במהלך התפתחות עוברית בשילוב עם השימוש בקווים מהונדסים ניאון מאפשר תצפית של דינמיקת לוקליזציה ביטוי חלבון, כמו גם ההדמיה של האיברים הפנימיים 1. זה מספק יתרון ייחודי בדבר בירור פיתוח איברים בזמן אמת לעומת דגמים יונקים שאיבריהם אינם נגישים עבור ניתוח מיקרוסקופי. יתר על כן, כלים שונים זמינים כדי לתפעל התפתחות עוברית של דג זברה. לצד הדור של קווים מוטנטים, oligonucleotides morpholino antisense (MO) יכול לשמש מציאה הפעילות של גנים מסוימים כי הם מעורבים בהתפתחות איברים מסוימים. MOS למקד אתר שחבור או קודון ההתחלה translational (אוגוסט), ובכך להפריע שחבור של טרום mRNA או תרגום.
הכליה העוברית דג הזברה, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל פשוט אנטומית אבל יקר ללמוד פיתוח כליות הפונקציה של genes הקשורים למחלות כליה 2. הוא מורכב רק שתי יחידות תפקודיות בשם nephrons. כל נפרון מורכב glomerulus שבו סינון הדם מתבצע 3. מרכיבים נוספים הם באזור הצוואר הקצר והן אבובית המפולחת להפרשה ואת הספיגה של מומס ואת הצינור, המסתיימת הביב 4. לא משנים הרכבו פשוט, הארגון ואת סוגי התאים השונים של כִּליַת רֵאשִׁית דג הזברה דומים מאוד בכליות היונקות 5,6.
גורם אחד, אשר הוא קריטי מעורב בפיתוח כליות, מקודד על ידי הגן המדכא גידולים ע"ש ווילם Wt1 7. דג זברה להחזיק שני paralogs שנקרא wt1a ו wt1b לידי ביטוי בתבנית חופפת אך לא זהה במהלך פיתוח של כִּליַת רֵאשִׁית 8. באמצעות דג הזברה מהונדס עם מבנים כִּליַת רֵאשִׁית GFP שכותרתו, הוכח כי עקום למטה המלא של wt1a </ em> או של צורה אחוי מסוימת מוביל מומים חמורים או מתונים של הכליה העוברית, בהתאמה 9,10.
השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של nephrogenesis נורמלי לקוי עוברי דג הזברה על ידי העסקת מיקרוסקופ לנתח פלואורסצנטי מצויד עבור חתך אופטי באמצעות תאורה מובנית. סעיפים אופטיים בכלל מאפשרים רכישת תמונות שרק מכילות מידע פוקוס. Out-of-מוקד מידע יכול להימנע על ידי גישות שונות כגון אלגוריתמים מתמטיים (למשל. Deconvolution), עיצוב אופטי (מיקרוסקופיית לייזר confocal למשל) או שילוב של שניהם (למשל תאורה מובנה).
כדי להשרות פגמים בפיתוח כליות השתמשנו antisense MO נגד wt1a שהזריקו קו דג הזברה מהונדס (TG (wt1b: GFP)). שורה זו מציגה-GFP קרינה ב glomerulus, הצוואר הקדמיחלק אבובית 9,10. בהשוואת setups מורכב יותר להקלטות זמן לשגות עם חתך אופטי כגון סריקת ליזר או מיקרוסקופי גיליון אור, מיקרוסקופ זום קל לטפל ופחות יקר. יתר על כן, ציוד תאורה מובנה ניתן לשלב בקלות עם ציוד הקרינה קונבנציונאלי (למשל הקרינה מנורה, מסננים) והצעות לנתח יתרונות ספציפיים מיקרוסקופ כגון מרחק עבודה המורחבת שדה גדול של תצוגה. בעיות עם להיסחף נפתרו ללא שימוש בציוד נוסף (בתא סביבתי, שולחן נגד רעידות) בדרך כלל נדרש עבור תוצאות יציבות. כדי לתקן את נדידת מוקדי אסטרטגית פוקוס אוטומטית הוקמה ותאי הדמיה עם רשתות רילוקיישן מוטבעות נוצלו כדי להתאים מחדש את המיצוב בעקבות סחף x או בכיוון y.
השיטה המוצגת יכולה לחול גם על מיקרוסקופים ללא אפשרויות חתך אופטיות, כגון מ 'סטריאו הקרינהicroscopes ומציע אלטרנטיבה ציוד מורכב יותר כי משמשת בדרך כלל עבור ההקלטה זמן לשגות של רקמות בפיתוח ודינמיקה איברים.
דג הזברה הפכה אורגניזם מודל פופולרי ללימודי פיתוח חוליות והכנת דגמים של מחלות אנושיות. בגלל עובר דג זברה לשמור על שקיפות, איברים מתפתחים כמו מוח ולב ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ הכנה סטנדרטית. ניצול קווים מהונדסים עם קרינה ספציפית איבר מאפשר הערכות של organogenesis ברחבי בשלבים שונים של פיתוח בתוך עוברי חיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מגבלה אחת הדמית פרטים מבניים של איברים שלמים עם מיקרוסקופיה epifluorescence הסטנדרטית היא ההשפעה של אותות מעצמים מעל ומתחת מישור המוקד. Out-of-ההתמקדות זו אור לא רק תוצאות בניגוד תמונת ירד ורזולוציה, זה גם עלולה לטשטש מבנים חשובים של עניין 13,14. מספר טכניקות כגון confocal- סריקת לייזר, ספינינג דיסק confocal- או מיקרוסקופיה multiphoton פותחו כדי למזער את המידע מחוץ פוקוס ובכך והעלייהדואר ניגודיות תמונה וכן פתרון צירי. שיטה חלופית להשיג חלקים אופטיים היא מיקרוסקופיה תאורת laser- וסריקה חינם המובנה, טכניקת תאורה רחבה מבוסס בתחום שהוא ופשוט ליישם על מיקרוסקופ רגיל 15. התוצאות המוצגות כאן להמחיש כי חתך אופטי, מושגת על ידי תאורה מובנהית, מיושם על מיקרוסקופ לנתח בשילוב עם שחזור של תמונות מוקד מורחבות, מאפשר הדמיה של פרטים מבניים של נורמה ומוטרדת פיתוח כלית דג זברה. בפרט, תאי GFP-חיובי morphants wt1a מפוזרים בעומקים שונים מוקדים, ותמונות של רק במישור אחד עם טשטוש מוקד out-of-היו לזלזל שלוש מורכבות הממדים של פנוטיפ.
כדי לעקוב אחר הדינמיקה של ארגון איבר, התארגנות או שיבוש, מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות הוא חזק אם כי טכניקה מורכבת. במהלך זמן לשגותתנודות הדמיה קלות או תנודות טמפרטורת קטין לגרום ונסחפו x, בכיוון y או z. זה דורש ציוד נוסף (בתא סביבתי, שולחן נגד רעידות) על מנת להשיג תוצאות יציבות. השיטה המוצגת משתמשת היכולת של מיקרוסקופ לנתח עם כונן מוקד ממונע להקלטת זמן לשגות תמונות ללא התקנים נוספים. כדי לשמור על מיקוד יציב, אסטרטגית פוקוס אוטומטית הוקמה רשת רילוקיישן המוטבעת לתוך החלק התחתון של תא ההדמיה שמשה תיקון של x, חוסר יציבות y-.
הטבעה תקינה של העובר היא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול. חלק באימון יש צורך למקם את המבנה של ריבית קרובה ככל האפשר אל תחתית הזכוכית באזור קרוב לרשת ללא שכיסה עם זה.
היתרון העיקרי של השיטה היא שהיא כלי זול ופשוט להסתכלות ישירה של תהליכים התפתחותיים כגון צמיחה והגירה בשנתי חייםעובר על פני כמה שעות. יתר על כן, את היתרונות מיקרוסקופ ספציפי לנתיחה כגון שדה גדול של תצוגת מרחק עבודה ממושכת להקל בחינת מדגמים גדולים כולל איברים שלמים. עם זאת, כמה מגבלות צריכות לזכור. ההשהייה של הניסוי כדי לבדוק ולתקן את המיקום שהופכת את ההליך זמן רב והיעדר בקרת טמפרטורה חזקה משנה את הזמן התפתחותי "הרגיל", אשר מוגדר הפרית שעות שלאחר על 28.5 מעלות צלזיוס למשך דג זברה 16. בעיה נוספת היא פוטנציאל העומק המוגבל של הדמיה לתוך החיה, במיוחד כאשר המבנה של העניין ממוקם בתוך העובר או זחלים. מבנה כזה הוא glomerulus pronephric דג הזברה, אשר ממוקם בין somites ואת שק החלמון. עומק הגבלת הדמית glomerulus נמצא כ -200 מיקרומטר, מרחק כי הוא הגיע אחרי 5 ימים של התפתחות. בניגוד לכך, מבנים פלורסנט שאינן located קרוב לפני השטח של החיה ניתן הדמיה למשך זמן ארוך יותר. לדוגמא תאי כבד נגישים הדמיה לפחות עד 9 DPF. מגבלה נוספת היא כי חוסר תנועה לטווח ארוך של העובר או זחלי agarose וטיפול Tricaine לגרום פיגור גדילה בצק לב, בהתאמה. בגלל זה עלול להפריע להתפתחות תקינה, מומלץ להגביל את משך ההקלטה זמן לשגות לתקופה מסוימת של עניין. לוודא שבתקופת מבני הדמיה של עניין להתפתח בצורה תקינה כדאי להשוות (בסוף) המראה הכללי עם זה של חיה כל זמן תחת אותם תנאים ניסיוניים אך ללא הטבעת הרדמה.
קלטת Z- מחסנית של חלקים אופטיים כל 30 דקות במשך תקופה של 5 שעות והחישוב הבא של עומק תמונות מוקד מורחב ספקו מידע במרחב ובזמן על אירועים המוקדמים של נורמה ומוטרדת פיתוח כליה אשר הושר בy morpholino בתיווך מציאה של wt1a. בעבר ניסויים שבוצעו מציאת morpholino כבר הראו כי Wt1a ממלא תפקיד מוקדם והכרחי ביצירת כִּליַת רֵאשִׁית הכלאה באתרו בטוש כליות 17,18 ותעסוקה של wt1b המהונדס. שורת GFP לפיתוח כִּליַת רֵאשִׁית הדמיה בזמן הקצוב מצביעה 9,10 גילו כי תוצאות מחסור wt1a ב morphogenesis גלומרולרי שבש ונכשלו מפרט podocyte. בניגוד לגישות סטטי אלה, הקלטות הזמן לשגות לדמיין דינמיקה ישירות של nephrogenesis מוקדם עובר מלא נדידת תאי GFP חיובי משם מאזור pronephric ב morphants wt1a. האפשרות לעקוב אחר תאים misrouted לאורך זמן מאפשר ניתוח פנוטיפ מפורט יותר.
באופן כללי, השיטה המוצגת כאן מספקת זול וקל לשימוש חלופי למתחם, ופחות נגיש setups המשמש בדרך כלל זמן לשגות הדמיה כגון מיקרוסקופ סורק לייזר (מצויד בתא סביבתי ושולחן נגד רעידות) או מיקרוסקופ גיליון אור. שהגרה תארה לתקן בעיות להיסחף יכולה להיות מיושמת גם לבצע זמן לשגות תמונות על setups ללא אפשרויות חתך אופטיות, כגון מיקרוסקופי סטריאו הקרינה.
הטכניקה היא לא רק מתאים לחקור פיתוח כליות אבל יכולה להיות מיושמת גם כדי לפקח המורפוגנזה נורמלי ופגום של איברים אחרים, כגון לב או כבד. יתר על כן, השיטה יכולה לשמש כדי לבחון תהליכים דינמיים שונים יותר באורגניזמים מודל עוברי המבוגר כגון ריפוי פצעים או התחדשות.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים תומאס בייטס לקריאת האנושות ושיפור כתב היד. אנו מודים גם כריסטינה אברט וסברינה Stötzer לצורך תחזוקת דגים.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |