Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ развития органа у эмбрионов данио с помощью флуоресценции рассекает микроскопа, способные выполнять оптические секционирования и простые стратегии переналадки для коррекции фокусного и плоскостную дрейф.
Для того, чтобы понять органогенез, пространственные и временные изменения, которые происходят в процессе развития тканей должны быть записаны. Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ нормального и нарушенного развития почек у эмбрионов данио с помощью флуоресцентного рассекает микроскопа, оборудованного для структурированного освещения и приобретения Z-стека. Для визуализации нефрогенеза, трансгенная данио (Tg (wt1b: GFP)) были использованы с флуоресцентно меченных структуры почек. Почечная дефекты были вызваны инъекции антисмысловой морфолино олигонуклеотида против гена опухоли Вильмса, wt1a фактор как известно, имеет решающее значение для развития почек.
Преимущество экспериментальной установки является сочетание зум-микроскопа с помощью простых стратегий Переустановка движений в х, у, г направлении без дополнительного оборудования. Чтобы обойти фокусного дрейф, который индуцируется изменением температуры и механических колебаний, Стратегия автоматической фокусировки была применена вместо того, чтобы с использованием обычно требуется климатическую камеру. Для того, чтобы заново настроить позиционные изменения из-за ху дрейфа, использовались камеры формирования изображений с впечатывается переездом сеток.
По сравнению с более сложных установок для покадровой записи с оптическим секционирования, таких как конфокальной лазерной сканирующей или световыми микроскопами листа, зум микроскоп прост в обращении. Кроме того, он предлагает рассекает микроскопом специфические преимущества, такие как высокая глубина резкости и продолжительного рабочего расстояния.
Метод для изучения органогенеза, представленный здесь, также может быть использован с флуоресцентной стереомикроскопов не способных к оптической секционирования. Несмотря на то, ограничивается для высокой пропускной способностью, этот метод предлагает альтернативу более сложного оборудования, которое обычно используется для покадровой записи развивающихся тканей и органов динамики.
После гаструляции, органогенеза является очередным этапом жизненного цикла человека. Она включает в себя перегруппировки, взаимодействие и очень часто миграцию клеток для производства тканей и органов. Неточности в процессах, лежащих в основе развития органов часто приводит к болезням, которые могут проявляться немедленно или же в более позднем возрасте. Таким образом, понимание органогенез является одним из основных усилий в области биологии развития и медико-биологических исследований. Для того, чтобы иметь возможность исследовать развитие того или иного органа, он должен быть виден даже через стенку тела эмбриона. Это позволяет запись пространственных и временных изменений, которые происходят в процессе развития. Кроме того, чтобы проанализировать важность факторов, участвующих в органогенеза, он должен быть восприимчив к манипулированию.
Один организм , который чрезвычайно подходит для исследования органогенеза в естественных условиях является данио. Его transparобразность во время эмбрионального развития в сочетании с использованием флуоресцирующих трансгенных линий позволяет наблюдать локализации белка и динамики экспрессии, а также визуализацию внутренних органов 1. Это обеспечивает уникальное преимущество, касающееся исследования развития органов в реальном масштабе времени по сравнению с моделями млекопитающих, чьи органы недоступны для микроскопического анализа. Кроме того, различные инструменты доступны для управления эмбрионального развития данио. Кроме генерации мутантных линий, антисмысловой морфолино олигонуклеотиды (MO) могут быть использованы для нокдаун активности определенных генов, которые участвуют в развитии некоторых органов. MOs либо настроить таргетинг на сайт сплайсинга или трансляционный стартовый кодон (AUG), и тем самым мешают сплайсинга пре-мРНК или трансляции.
Данио эмбриональной почки, Предпочка, является анатомически простой, но ценной моделью для изучения развития почек и функции генэс , связанных с заболеваниями почек 2. Он состоит только из двух функциональных блоков, называемых нефронов. Каждый нефрон состоит из клубочка , где фильтрация крови происходит 3. Другими компонентами являются короткой области шеи, а также сегментированные трубочки для секреции и реабсорбции растворенных веществ и каналом, который заканчивается в клоаки 4. Независимо от своей простой композиции, организация и различные типы клеток данио предпочки очень похожи на почки млекопитающих 5,6.
Одним из факторов, который критически участвует в развитии почек, кодируется опухолевый супрессор гена Вильмса Wt1 7. Данио обладают двумя паралоги называемые wt1a и wt1b выражается в перекрывающийся , но не идентичной картины в процессе разработки предпочки 8. Используя трансгенного данио с GFP-меченых пронефрос структур, было показано , что полный нокдаун из wt1a </ EM> или определенной формы сплайсинга приводит к тяжелым или мягких пороков развития зародышевого почки соответственно 9,10.
Описанный здесь метод позволяет покадровой анализ нормальной и нарушенной нефрогенеза в данио эмбрионов с использованием флуоресцентного рассекает микроскопа, оборудованного для оптического секционирования с помощью структурированного освещения. Оптические секции в целом позволяют приобретение изображений, которые содержат только в фокусе информации. Из фокуса информации можно избежать с помощью различных подходов , таких как математические алгоритмы (например. Деконволюции), оптической конструкции (например , конфокальной лазерной сканирующей микроскопии) или комбинацией обоих (например , структурированное освещение).
Для того, чтобы вызвать дефекты развития почек мы использовали антисмыслового MO против wt1a , который был введен в трансгенное данио линии (Tg (wt1b: GFP)). Эта линия показывает GFP-флуоресценцию в клубочек, шеи и переднейчасть трубочки 9,10. По сравнению с более сложных установок для покадровой записи с оптическим секционирования, таких как лазерное сканирование или легких листовых микроскопов, зум-микроскоп прост в обращении и дешевле. Кроме того, оборудование для структурированной подсветки легко можно комбинировать с обычным флуоресцентным оборудованием (например , флуоресцентной лампы, фильтры) и предлагает микроскопом рассекает специфические преимущества , такие как расширенное рабочее расстояние и большим полем зрения. Проблемы, связанные с дрейфом были решены без использования дополнительного оборудования (климатическую камеру, настольный антивибрационные), как правило, необходимое для стабильных результатов. Для коррекции фокусного дрейфа была создана стратегия автоматической фокусировки и камеры формирования изображений с отпечатками переездом сетки были использованы для подрегулировать позиционирование следующий дрейф в х или у направлении.
Предложенный метод может быть также применен к микроскопам без оптических вариантов секционирования, таких как флуоресценция стерео мicroscopes и предлагает альтернативу более сложного оборудования, которое обычно используется для покадровой записи развивающихся тканей и органов динамики.
Данио стал популярным модельным организмом для изучения развития позвоночных и моделирования заболеваний человека. Поскольку данио эмбрионов остаются прозрачными, развивающиеся органы, как мозг и сердце можно наблюдать с помощью стандартного препарата микроскопа. Воспользовавшись трансгенных линий с органной специфической флуоресценции позволяет оценки органогенеза на протяжении разных этапах развития внутри живых эмбрионов с помощью флуоресцентной микроскопии. Одно ограничение для визуализации структурных деталей целых органов со стандартной эпифлуоресцентной микроскопии является влияние сигналов от объектов, расположенных выше и ниже фокальной плоскости. Это вне фокуса света не только приводит к снижению контрастности и разрешения изображения, она также может скрывать важные структуры , представляющие интерес 13,14. Некоторые методы, такие как лазерного сканирования confocal-, вращающийся диск confocal- или многофотонной микроскопии были разработаны, чтобы свести к минимуму информацию вне фокуса и тем самым повые контрастность изображения, а также осевое разрешение. Альтернативный метод получения оптических срезов является лазерно и сканирование бесплатно структурированы освещение микроскопии, на основе широкого поля техника освещения , которая является и просто реализовать на регулярной микроскопом 15. Представленные здесь результаты показывают, что оптический секционирования, достигается за счет структурированного освещения, реализованный на рассекает микроскопом и в сочетании с реконструкцией сосредоточенно изображений, позволяет визуализировать структурные детали нормального и нарушения развития почек в данио. В частности, GFP-положительных клеток в wt1a морфантов рассредоточены на различных глубинах фокальных, а также изображения только в одной плоскости с не в фокусе размытый недооценить трехмерную сложность фенотипа.
Для того, чтобы проследить динамику органа организации, перегруппировки или нарушения, замедленная флуоресцентная микроскопия является мощным хотя и сложной техникой. Во время покадровойвизуализации незначительные колебания или незначительные колебания температуры вызывают дрейфует в х, у, г направлении. Это требует дополнительного оборудования (климатическую камеру, антивибрационные таблицу) для получения стабильных результатов. Представленный метод использует способность рассекает микроскоп с моторизованным фокусом привода для записи покадровой изображения без дополнительных устройств. Для поддержания устойчивого фокуса, была создана стратегия автофокусировкой и перемещение сетки отпечатаны в нижней части изображения камеры была использована для коррекции х, y- нестабильности.
Правильное вложение эмбриона является важным шагом в рамках протокола. Некоторые практики необходимо, чтобы поместить интересующую структуру, как можно ближе к стеклянным дном и в непосредственной близости к сетке без накладывания с ним.
Основное преимущество метода заключается в том, что он является доступным и простым инструментом для непосредственного наблюдения процессов развития, таких как рост и миграция в жизниЭмбрионы в течение нескольких часов. Кроме того, рассечение микроскоп специфические преимущества, такие как большое поле зрения и расширенного рабочего расстояния облегчить изучение больших образцов, включая целые органы. Тем не менее, некоторые ограничения должны иметь в виду. Приостановка эксперимента , чтобы проверить и скорректировать позиционирование делает процедуру отнимает много времени и отсутствие надежного контроля температуры изменяет "стандартное" времени развития, который определяется как ч после оплодотворения при 28,5 ° С в течение данио 16. Другой потенциальной проблемой является ограниченная глубина изображения в животное, в частности, когда структура интерес находится внутри зародыша или личинки. Такая структура является данио pronephric клубочек, который расположен между сомитов и желтка. Было установлено, что предельная глубина для получения изображения клубочках составляет около 200 мкм, расстояние, которое достигается через 5 дней развития. В отличие от этого, флуоресцентные структуры, которые являются лocated ближе к поверхности животного могут быть отображены в течение более длительного времени. Например клетки печени не доступны для работы с изображениями, по крайней мере до 9 денье. Еще одним ограничением является то, что длительное обездвиживание эмбриона или личинок в агарозы и лечения Tricaine вызывают замедление роста и сердечный отек, соответственно. Так как это может мешать нормальному развитию, рекомендуется ограничить продолжительность записи в заданный промежуток времени в течение определенного периода, представляющего интерес. Для того, чтобы гарантировать, что во время визуализации структур, представляющих интерес, развиваются нормально, полезно сравнить (в конце) общий вид с этим животного выдерживают при тех же экспериментальных условиях, но без вложения и обезболивание.
Запись Z-стек оптических срезов через каждые 30 минут в течение в течение 5 ч и последующего расчета расширенной глубины резкости изображений при условии, пространственную и временную информацию о ранних событиях нормального и нарушается развитие почек, которое было вызвано бу морфолино-опосредованной нокдаун wt1a. Ранее проведенные морфолино нокдаун эксперименты уже показали , что Wt1a выполняет раннее и существенную роль в формировании Предпочка В гибридизация с маркером почечной 17,18 и занятости трансгенного wt1b:. GFP линия для развития Предпочка изображений в установленное время указывает 9,10 выявили что дефицит приводит к wt1a в нарушенного клубочковой формообразования и неудачные попытки спецификации подоцита. В отличие от этих статических подходов, время покадровой записи непосредственно визуализировать динамику ранней нефрогенеза в контрольных эмбрионов и миграции GFP-позитивных клеток вдали от pronephric области в wt1a морфантов. Возможность отслеживать клетки с ошибочно доставленными с течением времени позволяет более детальный анализ фенотипа.
В общем, метод, который представлен здесь обеспечивает недорогой и простой в использовании альтернативу к сложному, и менее доступными себеtups обычно используется для покадровой обработки изображений, таких как лазерный сканирующий микроскоп (оснащенного камерой и экологической таблицей антивибрационные) или легкого листового микроскопа. Описанная подпрограмма для устранения проблем дрейфа может также применяться для выполнения покадровой изображения на установках без оптических вариантов секционирования, таких как флуоресценция стереомикроскопов.
Метод подходит не только для исследования развития почек, но может быть также применен для контроля нормального и дефектного морфогенеза других органов, таких как сердце или печень. Кроме того, способ может быть использован для наблюдения различные более динамические процессы в эмбриональных и взрослых модельных организмов, таких как заживление ран или регенерации.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Томас Бейтс за критическое чтение и улучшение рукописи. Мы также благодарим Кристина Эберта и Сабрина Stötzer для поддержания рыбы.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |