Introduction
Patogena mikrober kan bilda biofilmer in vivo leder till icke-akuta kroniska infektioner 1. Biofilm relaterade infektioner är en allvarlig riskfaktor för medicinska procedurer som involverar implantation av främmande föremål (t.ex. konstgjorda ersättare ben, bröstimplantat) eller installation av luftstrupen rör eller urinkatetrar 2. I dessa sammanhang är behandlingen mot infektionen nästan alltid nödvändigt som biofilm baserade infektioner sällan rensas på egen hand, även i immunkompetenta individer. Staphylococcus aureus är en av de vanligaste observerade patogener inblandade i biofilm relaterade komplikationer som uppstår vid användning av invasiva medicintekniska produkter 3.
Tyvärr gör dem mer motståndskraftiga mot behandling än planktonceller 1,4 själva karaktären av biofilmer som en skyddande barriär, och utvärdering av förutspått klinisk effekt är en viktig del av både inledandeläkemedelsutveckling samt läkemedelsresistens övervakning. Det finns en ökande kvitto på att laboratorieförhållanden, med fokus på plankton kulturer, inte troget representera verkliga sjukdom 5. Ytterligare förvärrar problemet, är replikering av biofilm fenotyper svårt, och befintliga biofilm modeller är tråkiga och lider av högt inter- och intra-assay variation sex. Således, många forskare, genom nödvändighet, som standard planktoncellanalyser av drogkänslighet och därmed potentiellt försumma en viktig aspekt av bakteriell virulens och sjukdom.
Här beskriver vi protokoll för analys av bakterier, särskilt S. aureus, i förut odlade biofilmer som utnyttjar en 96-brunnars baserade biofilm systemet 7,8. Medan protokollet för biofilm formation och utmaning följer i huvudsak tillverkarens rekommendationer, presenterar vi en alternativ informationsrika metod för kvantifiering av livskraft biofilm efter utmaning. Kortfattat, bakterier odlas i tappen plattan, där biofilmer bildas på de utskjutande tapparna är anslutna till plattans lock. Efter biofilm formation, är pinnar försiktigt doppade i brunnarna i en färsk platta fylld med PBS för att avlägsna planktonceller. Den peg-lock, med biofilmer bifogade, överförs till en ny utmaning platta, innehållande olika koncentrationer av antibiotika som skall analyseras. Efter en andra inkubation lock igen avlägsnades, tvättades och överfördes till en återhämtnings platta innehållande resazurin färgämne, där de genomgår en slutlig inkubation. Resazurin konvertering kan registreras kinetiskt eller tas som en slutpunkt läsning efter en viss återhämtningsperiod. Detta färgämne-baserad metod för att kvantifiera livskraften i biofilmer skiljer sig väsentligt från de tråkiga CFU (kolonibildande enheter) räknas baserad metod som beskrivs i det ursprungliga protokollet 7. OD 600 mätningar av läkemedlet utmaningen plattan och resazurin konverterings kinetik fungera som lönsamheten lästaouts av plankton och biofilm celler, respektive, som erbjuder en snabb, pålitlig, informationsrika och tekniskt enkel analys för biofilm överlevnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biofilm Initiation
- Odla en kultur av biofilm producerande organismen i ett näringsrikt medium. Ympa Staphylococcus aureus stam Newman i 10 ml Mueller-Hinton-medium från en glycerol lager. Utför allt arbete med hantering av S. aureus med handskar och inom en biosäkerhet skåp.
- Inkubera i 16 h vid 37 ° C på en roterande skakapparat (100-200 rpm).
- Bestäm OD 600 av kulturen med hjälp av en spektrofotometer och en standard-kyvett (väglängd: 1 cm).
- Beräkna volymen (V) av kultur som krävs för att förbereda 20 ml inoculum med OD 600 (inokulat) på 0,1 i chelexed Roswell Park Memorial Institute media (cRPMI) 9 med hjälp av formeln: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (kultur )]
Obs: Referens 9 innehåller information om cRPMI förberedelse.- Lägga den beräknade odlingsvolymen (från ovan) till ett centrifugrör och pelletceller genom centrifugering under 1 min vid 10000 x g. till prepare biofilm inokulum, aspirera det använda odlingsmedium och resuspendera cellpelleten i 20 ml cRPMI.
- Häll inokulum i en 25 ml reservoar.
- Försiktigt bort locket från en steril 96 brunnar peg plattan genom att dra den rakt upp.
Obs: Man måste vara försiktig att inte förorena pinnarna hänger ned från locket. Locket kan placeras upp och ner på en ren yta i ett biosäkerhet skåp. - Med hjälp av en 200 ul multikanalpipett, lägga till 125 l inokulat till varje brunn rader A till G i bottenplattan.
- Fyll 125 pl sterilt cRPMI medium i varje brunn i rad H som en sterilitetskontroll.
- Ta den peg-locket och håll den ovanför plattan botten med tapparna nedåt. Rikta de enskilda pinnar med sina respektive brunnar. Undvik fysisk kontakt mellan plåten och pinnar. När linje, sänk locket försiktigt ned. Undvika avvikelser som justeringar genomförs efter pinnarna har rört bottenplattan kan fortsaminera sterilitet kontroller i rad H.
- Försegla locket till plattan med paraffinfilm för att förhindra avdunstning och placera i en förslutbar plastpåse, försegling tätt. Hålla luftvolymen i påsen så låg som möjligt för att minimera avdunstning.
- Inkubera utan skakning vid 37 ° C under 48 h i en 5% CO2 inkubator.
Obs: 48 timmar av tillväxten har varit optimal för S. aureus, men kommer att variera baserat på den använda organismen.
Obs! Även om statisk inkubation är en bra utgångspunkt för att optimera analysen försiktigt skakning vid 150 rpm på en mikro shaker är en möjlig variation som kan öka biofilm bildning av några S. aureus-isolat.
2. Framställning av biofilmen Challenge Plate
- På dagen för biofilmen utmaningen ta en ny 96-brunnsplatta och tillsätt 100 | il cRPMI, jämviktade till RT, till varje brunn i raderna B till H. För att undvika inkonsekventa resultat, utnyttja en 96-brunnsplatta som kan hålla 200 filav media när pinnarna är inne, och har brunnar med dimensioner är identiska med dem av biofilmen inledande plattan.
- Späd upp till 4 testföreningarna separat i 1,0 ml cRPMI till 2x den önskade slutkoncentrationen, i syfte att ta hänsyn till en slutlig spädning i steg 2,7.
Notera: En bra utgångspunkt är 8 gånger över den inhiberande koncentrationen av planktonceller. - Tillsätt 200 pl av förening 1 i brunnar A1 till A3, förening 2 i brunnar A4 till A6, förening 3 i brunnar A7 till A9 och förening 4 i brunnar A10 till A12.
- Seriellt späda testföreningarna med hjälp av en flerkanalspipett och överföra 100 ul från rad A till rad B och blanda.
- På detta sätt, fortsätter att överföra 100 ni brunn till brunn. Blanda efter varje överföring och stoppa i rad F.
- Efter blandning utvisa 100 ul från rad F i en avfallsbehållare. Häll inte över någon vätska till rader G och H.
- Tillsätt 100 pl av cRPMI till varje brunn i plattan med hjälp av en flerkanalspipett tillbringa volymen till 200 pl. Se figur 1 för sista platt layout.
3. Biofilm Challenge
- Tillsätt 200 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en färsk steril 96-brunnsplatta som har brunnar med dimensioner som är identiska med de hos biofilmen initiering plattan.
- Ta bort plastpåsen och paraffin film från inkuberade biofilm initiering platta.
- Lyft på locket rakt upp. Undvik kontakt mellan stiften och plattans botten, eftersom det kan skada biofilm. Håll nedre delen för efterföljande OD 600 analys (se 3.8).
- Skölj av planktonceller genom att placera peg-locket på plattan innehållande PBS (från steg 3,1). Sänk pinnar i 5 sekunder, lyft ut PBS, och dränka en gång, försiktigt så att inte träffa pinnar mot såväl sidorna.
- Placera den sköljda peg-lock in i utmaningen plattan. Undvik onödig kontakt mellan pinnar och bottenplattan som detta kommer att skada biofilm som leder tillinkonsekventa resultat.
- Tätningsplattan med paraffin film och placera i en plastpåse som beskrivs i steg 1,10.
- Inkubera plattan utan skakning under 24 h vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Ta botten av biofilm inledande plattan från 3,3. Resuspendera bakterier i varje brunn med en flerkanalspipett och mäta OD 600 med en lämplig mikroläsare för att bekräfta tillväxt förekommer i alla brunnar men sterilitets kontroller i rad H.
4. Biofilm Bestämning
- Använd en plattläsare utrustad med en inkubationstid kammare och kapabel att ta kinetiska fluorescensavläsningarna för att detektera resazurin omvandling. Inrätta en 24 hr kinetisk fluorescensmätning med hjälp av en 530 nm excitation och 590 nm emission.
- Ställa kammartemperaturen till 37 ° C och med plattan läsa varje 20 min. Ställ in plattläsare för att mäta från botten av plattan enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered Tvätta plattan genom att tillsätta 200 pl PBS med en multikanalpipett till en steril 96 brunnar.
- Förbereda biofilm återställningsmedium genom att tillsätta 400 pl av 0,8 mg / ml resazurin stamlösning till 20 ml cRPMI medium till en slutlig koncentration av 16 | ig / ml resazurin.
Obs: Resazurin är en känd hudirriterande. Använd labbrock, skyddsglasögon och handskar vid hantering. CRPMI som biofilmen media användes eftersom det ger lägsta bakgrundssignalen, men det kan ersättas med Mueller Hinton media vid behov. - Tillsätt 150 pl av biofilm återvinning medium med en multikanalpipett till varje brunn av en ny 96-brunnars platta.
- Transfer utmaning plattan från inkubatorn i en biosäkerhet skåp och försiktigt bort plastpåsen och förslutningsfilm.
- Ta bort peg-locket från utmaningen plattan och skölj av planktonceller i PBS som beskrivs i 3.4. Att bottnen av den utmaning plattan för efterföljande OD 600 analys (se 4.10).
- Efter sköljning, placera peg-lock i plattans botten innehåller biofilmen återställningsmedium.
- Linda sidan av plattan med paraffin film, försiktigt så att inte hindra botten av omkretsen brunnar. Omedelbart efter inslagning plattan, placera den på plattläsare och starta en kinetisk läsning under en 24 timmarsperiod genom att inleda den tidigare gjort resazurin kinetisk protokoll från steg 4,1.
- För att kvantifiera tillväxt av planktonceller som kan eller inte kan inträffa under utmaning, läsa OD 600 av hela utmaningen plattans botten med användning av en mikroplattläsare. Följ instruktionerna i steg 3,8.
Notera: försiktigt återsuspendera innehållet i varje brunn som celler sprider utanför biofilm tenderar att växa i klumpar på botten av brunnen. Eventuella bubblor i brunnen kommer starkt störa OD 600 avläsningar och måste undvikas eller avlägsnas före läsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den resazurin analysen är tillräckligt känslig för att på ett tillförlitligt sätt detektera mycket få livskraftiga celler med förmåga att replikera i drogfritt medium efter utmaning. I denna metod, definierar vi den minimala biofilm utrota koncentration som den lägsta koncentration vid vilken ingen resazurin konvertering ses inom 24 timmar. Den resazurin analysen bygger på oxidativa molekyler som finns i metaboliskt aktiva celler som omvandlar färgämnet färg från blå till rosa. Dye omvandling är sålunda en indikator på celltillväxt, och kan kvantifieras med hjälp av en fluorescerande mikroplattläsare. I detta papper, var neocuproine och Cu-neocuproine (neocuproine komplex med koppar) med avseende på deras aktivitet mot biofilm i samband S. aureus tillämpar en layout som bygger på figur 1. De data som erhållits under exekvering av protokollet är en OD 600 läsning av biofilmen inledande plattan, som fungerar som en kvalitetskontroll (data visas ej), En OD 600 läsning av plattan botten efter utmaningen har slutförts (figur 2A), och en kinetisk inspelning av resazurin omräkningen till dess fluorescerande metabolit resorufin av återhämtningsplattan (Figur 2B). Vidare kan en slutpunkt bild av utmaningen platta användas för visuell inspektion av resazurin konvertering (Figur 2C) om en ja / nej utvärdering av resazurin omvandling är tillräcklig för att syftet med försöket. Alternativt, om kinetiska inspelningsmöjligheter inte är tillgängliga eller flera plattor körs parallellt, kan fluorescens bestämmas efter 24 timmar med en enda slutpunkt läsning. Som framgår av Figur 2A, OD-avläsningar från utmaningen plattan tyder på att enbart neocuproine inte hämmar tillväxten av planktonceller; Men, hämmar Cu-neocuproine tillväxt på 1,3 pm, som väntat 10. Ett liknande mönster kan observeras från resazurin kinetiska av biofilmen plattan, vilket indikeraratt endast Cu-neocuproine kan eliminera metaboliskt aktiva biofilm associerade celler (Figur 2B).
Förutom att ge koncentrationer biofilmutrotning, ger den kinetiska analysinformation på den metaboliska tillståndet hos biofilmen, som är indikativ för antalet livsdugliga bakterier. När man jämför biofilmer som behandlats med gentamicin vid ökande koncentrationer med de obehandlade kontrollerna, kan en fördröjning av resazurin omvandling ses (Figur 3). För 2,5 | j, g / ml gentamicin, finns det en 13 hr fördröjning tills brunnen når samma omvandling av resazurin som den obehandlade kontrollen. Denna eftersläpning sannolikt kommer från ett reducerat antal viabla celler är närvarande i den behandlade biofilm jämfört med den obehandlade.
Figur 1. Challenge plattslayouten. Example layout utmaning plattan tillmötesgående parallell testning av fyra föreningar i tre exemplar på sex olika koncentrationer. Obehandlade och sterilitet kontroller ingår också. Layouten designen stöder bekvämt in-platta beredning av serieutspädningar med användning av en flerkanalig pipett. Koncentrationerna ligger i iM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fastställande koncentration biofilm utrotning minimum. Neocuproine och Cu-neocuproine testades för eventuell biofilm utrotning. (A) OD 600 togs från utmaningen plattan efter avlägsnande av peg-locket för att kvantifiera tillväxten av biofilm dissocierade celler. (B) Resazurin konvertering övervakades kinetiskt i indidubbla brunnar under en 24 timmarsperiod. Enskilda minigraphs visar fluorescens (RFU) över tid (24 tim). Bristen på resazurin omvandling anger frånvaron av överlevande. Resazurin omvandling indikerar närvaron av viabla celler sprider utanför biofilm och växande i återvinningsmediet. (C) Om en kinetisk avläsning inte är möjlig eller inte behövs, då en enkel ja / nej svar på förekomsten av livskraftiga celler kan bestämmas visuellt från färg omvandling av blå resazurin till sin rosa, reducerad form. Klicka här för att en större version av denna siffra.
Figur 3. Kinetic resazurin analys avslöjar hämmande effekt på bakterier i en biofilm. Föreningar kan inte helt utrota biofilm inbäddad celler, men kan fortfarande minskair lönsamhet. Detta kan ses när man jämför fördröjningen av resazurin omvandling av brunnar som behandlats med olika koncentrationer av gentamicin. Brunnar som har en fördröjning i resazurin omvandling ange ett reducerat antal levande celler. Svart (endast medium), Orange (0 | j, g / ml), Green (0,3 | j, g / ml), Blå (0,6 | j, g / ml), Lila (2,5 | j, g / ml), och Gray (5 | j, g / ml). At hänvisar till tidsskillnaden av exponentiell resazurin konvertering mellan obehandlade och gentamicin behandlade proverna vid den ungefärliga halv maximal fluorescensvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit en modifierad biofilm analys för att bestämma aktiviteten hos testade inhibitorer på S. aureus biofilmer med fokus på metabola tillstånd av biofilm associerade celler. Medan den beskrivna biofilm initiering och överprövningsförfaranden mestadels härmade tillverkarens rekommendationer, användning av resazurin färgämnet att detektera och kvantifiera biofilmassocierade celler som överlever en inhibitor utmaning 24 timmar förenklar dramatiskt det rekommenderade förfarandet för cellåtervinning (via vattenbad sonikering) och efterföljande uppräkning av levande celler via räkning av CFU. Denna tillverkare rekommenderade förfarande innebär åtminstone 5 ytterligare manipuleringssteg, vart och ett av dem felbenägen, arbetskrävande och opraktiskt att automatisera. Fördelen att förenkla den utlästa förfarande av den peg plattanalys ökar dess attraktivitet för high throughput operationer och applikationer.
Även om en lång protokollet genom antal steg, denna procedure är ganska konceptuellt enkel, med få kritiska steg. Viktigast är väsentlig för att erhålla reproducerbara resultat förmågan att upprepade gånger växa biofilmer av samma kvalitet. Dessutom måste man vara försiktig när du tar bort eller ersätta den peg-lock. Kontakta vid någon punkt med en brunnens vägg skulle störa biofilmen, missvisande resultat. Mer så, är tillräcklig tvätt avgörande: underlåtenhet att ta bort plankton celler vid någon punkt bort någon förmåga att mäta biofilm-associerade bakterier. Omvänt, men tvätt får inte vara alltför rigorös; ytterligare tvättsteg kan börja ta bort biofilm, producerar inkonsekventa resultat.
Tappen plattan tillvägagångssätt har flera användningsområden, beroende på den önskade resulterande data. Analysen beskrivs här som en informationsrika kinetisk mätning av metabolisk resazurin omvandling till ett fluorescerande färgämne 11. Denna omvandling är associerad med en färgskiftning från blå till rosa (fig 2C), vilket i additipå den kvantitativa fluorescens läsning, gör det lätt initial kvalitativ avläsning helt enkelt genom att observera omvandlingen. Efter avlägsnande av tappen locket, kan denna omvandling också kvantifieras genom avläsning av absorbansen vid 600 nm bör fluorescens kapacitet inte är tillgängliga. Fastän fluorescensen platåer småningom vid maximal färgämne omvandling i varje brunn (med överlevande), kunde uppkomsten av färgämnes omvandlingen användas för att uppskatta den metaboliskt aktiva överlevande populationen relativt den obehandlade kontrollen (Figur 3). I våra händer har vi funnit att varje ~ 100 min fördröjning i början av resazurin konvertering motsvarar ungefär en 10-faldig minskning i antalet metaboliskt aktiva celler i utgångs inokulat i förhållande till den obehandlade kontrollen (som bestäms på plankton cellodling serie utspädd i 10-faldiga steg genom att använda biofilm återvinning medium (data ej visade)).
Bortom kinetiska readouts, fast, den modifierade PEG plattanmetod är mer mottaglig för hög genomströmning drogskärm projekt än det ursprungliga protokollet. Genom att mäta resazurin omvandling som en slutpunkt i stället för en kinetisk, kan en användare skapa en binär analys av proverna för att spåra enkel aktiviteten hos föreningar (dvs färg konvertering / ingen konvertering), vilket eliminerar behovet av 24 timmar i en fluorescensplattläsare , vilket medger konventionella inkubationer. Denna metod gör det möjligt att bestämma den minimala biofilmen utrota koncentration utan behov av sonikering och plätering. Den kinetiska läsning spårar också den metaboliska tillstånd biofilm beroende på behandlingsbetingelse och inhibitorkoncentrationen. Det minskade antalet manipulationssteg, ökad reproducerbarhet och kvantitativ avläsning metod (i motsats till plätering varje brunn individuellt 12) gör det möjligt för användare att screena potentiellt tusentals föreningar per dag i en enda koncentration skärm. I själva verket har peg-stil plattor använts tidigare i hög genomströmning drug skärmar för biofilm dispergeringsmedel, men resazurin (som används här) är en mycket mer ekonomiskt val än proprietära luciferas reagens används 13.
Medan en allmän förbättring jämfört med existerande tillverkare protokollet inte analysen presenteras här har vissa begränsningar måste man hålla i minnet. Naturligt, vi bara mäter metabolisk kapacitet biofilm associerade celler. Denna analys mäter inte biofilm massa eller på annat sätt försvaga biofilmen arkitektur eller integritet. Dessa effekter skulle inte nödvändigtvis upptäckas. Metaboliskt inaktiv, men fortfarande livskraftiga, persister celler, som har visat sig existera i biofilmer 14,15 kommer också att oupptäckt. Vidare, föreningar som inducerar inaktivitet utan att sterilisera en biofilm kan felaktigt visas som falska positiva, beroende på längden av den inducerade tillstånd. Lönsamhet indikatorer är ytterst surrogat för mer järnklädda mätmetoder såsom flödescytometri eller CFUuppräkning, och slutanvändaren måste avgöra vilken metod som är lämplig. Slutligen, eftersom resazurin omvandlingen är beroende av endogena NADH kan utarmning av intracellulära lager vara skadliga för bakterier. Även om vi inte har observerat skadliga effekter mot S. aureus, kan andra bakteriearter reagerar olika. Användarna måste empiriskt testa och validera detta protokoll för tillförlitlighet och reproducerbarhet ges olika organismer och labbmiljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
