Introduction
Microbes pathogènes peuvent former des biofilms in vivo conduisant à des infections chroniques non actifs 1. L' infection par le biofilm associé est un facteur de risque grave de procédures médicales qui impliquent l' implantation d'objets étrangers (par exemple, le remplacement des os artificiels, des implants mammaires) ou l'installation des tubes trachéaux ou cathéters urinaires 2. Dans ces contextes, le traitement anti-infectieux est presque toujours nécessaire que les infections à base de biofilm sont rarement effacés sur leur propre, même chez les personnes immunocompétentes. Staphylococcus aureus est l' un des agents pathogènes les plus fréquemment observés impliqués dans les complications liées à biofilm qui se produisent lors de l'utilisation de dispositifs médicaux invasifs 3.
Malheureusement, la nature même de biofilms comme une barrière protectrice qui les rend plus résistantes au traitement que les cellules planctoniques 1,4, et l' évaluation de l' efficacité clinique prédit est un élément essentiel à la fois initialele développement de médicaments, ainsi que la surveillance de la résistance aux médicaments. Il est de plus en plus reconnu que les conditions de laboratoire, axées sur les cultures planctoniques, peuvent ne pas représenter fidèlement la maladie dans le monde réel 5. Aggravant encore le problème, la réplication des phénotypes biofilm est difficile, et les modèles de biofilm existants sont fastidieux et souffrent de haute inter et intra-essai variabilité 6. Ainsi, de nombreux chercheurs, par nécessité, par défaut aux dosages cellulaires planctoniques de sensibilité aux médicaments, ce qui pourrait négliger un aspect important de la virulence bactérienne et la maladie.
Nous décrivons ici le protocole de dosage de bactéries, en particulier S. aureus, dans les biofilms pré-cultivés en utilisant une base de 7,8 à 96 puits de système de biofilm. Bien que le protocole pour la formation de biofilm et de défi suit essentiellement la recommandation du fabricant, nous présentons une méthodologie riche en information alternative pour quantifier la viabilité du bioFilm après la provocation. En bref, les bactéries sont mises en culture dans la plaque de cheville, où les biofilms se forment sur les pions en saillie fixés au couvercle de la plaque. Après la formation du biofilm, les ergots sont légèrement trempées dans le puits d'une plaque fraîche rempli avec du PBS pour éliminer les cellules planctoniques. Le peg-couvercle, avec biofilms attachés, est transféré à une nouvelle plaque de défi, contenant diverses concentrations d'antibiotiques à doser. Après une seconde incubation, les couvercles sont de nouveau retirées, lavées et transférées à une plaque de recouvrement contenant un colorant résazurine, où ils sont soumis à une incubation finale. la conversion résazurine peut être enregistré cinétiquement ou pris comme une lecture du point final après une période de récupération définie. Cette méthode de quantification de la viabilité des biofilms à base de colorant diffère considérablement des UFC (unités formant colonies) fastidieuses méthodologie basée-count décrit dans le protocole original 7. OD 600 mesures de la plaque de défi de la drogue et la résazurine cinétique de conversion servent de viabilité de lectureouts de planctoniques et biofilm cellules, respectivement, offrant une information riche et techniquement simple test rapide, fiable, pour la survie de biofilm.
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Protocol
1. biofilm Initiation
- Cultiver une culture de biofilm organisme produisant dans un milieu riche en nutriments. Inoculer Staphylococcus aureus souche Newman dans 10 ml de milieu Mueller-Hinton à partir d' un stock de glycérol. Effectuer tous les travaux impliquant la manipulation de S. aureus avec des gants et dans une enceinte de biosécurité.
- Incuber pendant 16 heures à 37 ° C sur un agitateur rotatif (100-200 rpm).
- Déterminer la DO 600 de la culture en utilisant un spectrophotomètre et d' une cuvette standard (longueur de trajet: 1 cm).
- Calculer le volume (V) de la culture nécessaire pour préparer 20 ml d'inoculum avec OD 600 (inoculum) de 0,1 à chelexed médias Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) 9 en utilisant la formule: [V = 20 ml * 0,1 / OD 600 (culture )]
Remarque: La référence 9 fournit des détails sur la préparation cRPMI.- Ajouter le volume calculé de culture (ci-dessus) dans un tube de centrifugeuse et un culot de cellules par centrifugation pendant 1 min à 10 000 x g. Pour prepare biofilm inoculum, aspirer le milieu de culture et remettre en suspension le culot cellulaire dans 20 ml passé cRPMI.
- Verser inoculum dans un réservoir de 25 ml.
- Retirez délicatement le couvercle d'une plaque de cheville 96 puits stérile en le tirant vers le haut.
Remarque: Il faut prendre soin de ne pas contaminer les chevilles qui pendent du couvercle. Le couvercle peut être placé à l'envers sur une surface propre au sein d'une enceinte de sécurité biologique. - En utilisant une pipette multi-canal de 200 pi, ajouter 125 inoculum ul à chaque puits de lignes A à G de la plaque inférieure.
- Remplissez moyen cRPMI 125 ul stérile dans chaque puits de la rangée H comme un contrôle de stérilité.
- Prenez le peg-couvercle et le maintenir au-dessus du fond de la plaque avec les chevilles vers le bas. Alignez soigneusement les piquets individuels avec leurs puits respectifs. Éviter tout contact physique entre la plaque et les chevilles. Une fois aligné, abaissez soigneusement le couvercle vers le bas. Évitez les désalignements comme réajustements effectués après les chevilles ont touché la plaque de fond peut contcontrôles de stérilité aminer dans la rangée H.
- Sceller le couvercle à la plaque avec un film de paraffine pour éviter l'évaporation et le placer dans un sac en plastique refermable, scellant hermétiquement. Gardez le volume d'air dans le sac aussi bas que possible pour minimiser l'évaporation.
- Incuber sans agitation à 37 ° C pendant 48 heures dans un incubateur à CO 2 de 5%.
Note: 48 h de croissance a été optimale pour S. aureus, mais varieront en fonction de l'organisme utilisé.
Remarque: Bien que l' incubation statique est un bon point de départ pour optimiser le dosage, en secouant doucement à 150 rpm sur un agitateur de microplaques est une variante possible qui peut améliorer la formation de biofilm de certains S. aureus.
2. Préparation de la plaque biofilm Défi
- Le jour du défi de biofilm prendre une plaque de 96 puits fraîche et ajouter 100 pi de cRPMI, équilibrées à la température ambiante, à chaque puits de lignes B à H. Pour éviter des résultats incohérents, utiliser une plaque de 96 puits qui peut contenir 200 pides supports lorsque les pions sont à l'intérieur, et comporte des puits ayant des dimensions identiques à celles de la plaque biofilm d'initiation.
- Diluer jusqu'à 4 composés testés séparément dans 1,0 ml de cRPMI à 2 x la concentration finale désirée, afin de tenir compte de la dilution finale dans l'étape 2.7.
Note: Un bon point de départ est 8 fois supérieure à la concentration inhibitrice des cellules planctoniques. - Ajouter 200 pi de composé 1 dans le puits A1 à A3, le composé 2 dans les puits A4 à A6, composé 3 dans les puits A7 à A9 et composé 4 dans les puits A10 à A12.
- En série diluer les composés d'essai à l'aide d'une pipette multicanaux et transférer 100 pi de la ligne A à la ligne B et mélanger.
- De cette manière, continuer à transférer 100 ul puits à puits. Mélanger après chaque transfert et arrêter la ligne F.
- Après le mélange, expulser 100 pi de la ligne F dans un conteneur de déchets. Ne pas transférer tout liquide aux lignes G et H.
- Ajouter 100 ul de cRPMI à chaque puits de la plaque à l'aide d'une pipette multicanaux pouramener le volume à 200 ul. Voir la Figure 1 pour mise en page finale de la plaque.
3. biofilm Défi
- Ajouter 200 pi de tampon phosphate salin (PBS) à une plaque de 96 puits stérile fraîche qui comporte des puits ayant des dimensions identiques à celles de la plaque biofilm d'initiation.
- Retirez le sac en plastique et un film de paraffine de incubé plaque biofilm d'initiation.
- Soulevez le couvercle vers le haut. Éviter tout contact entre les piquets et le fond de la plaque, car cela pourrait endommager le biofilm. Gardez partie inférieure pour la suite OD 600 analyse (voir 3.8).
- Rincez les cellules planctoniques en plaçant le peg-couvercle sur la plaque contenant du PBS (de l'étape 3.1). Immerger chevilles pendant 5 secondes, sortir de la PBS, et submergez une fois de plus, en faisant attention de ne pas frapper les chevilles contre les côtés du puits.
- Placez le peg-couvercle rincés dans la plaque de défi. Évitez tout contact inutile entre les piquets et plaque de fond, car cela endommagerait le biofilm conduisant àdes résultats incohérents.
- plaque d'étanchéité avec un film de paraffine et placer dans un sac en plastique refermable comme décrit à l'étape 1.10.
- Incuber la plaque sans agitation pendant 24 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%.
- Prendre en bas de la plaque biofilm d'initiation de 3,3. Resuspendre les bactéries dans chaque puits à l' aide d' une pipette multicanaux et mesurer la DO 600 avec un lecteur de microplaque approprié pour confirmer la croissance se produisant dans tous les puits , mais les contrôles de stérilité dans la rangée H.
4. biofilm Détermination
- Utiliser un lecteur de plaque muni d'une chambre d'incubation et capable d'effectuer des mesures de fluorescence pour détecter la cinétique de conversion résazurine. Mettre en place une cinétique mesure de fluorescence 24 heures en utilisant une excitation de 530 nm et 590 nm émission.
- Réglez la température de la chambre à 37 ° C et la plaque ont lu toutes les 20 min. Configurer le lecteur de plaque à mesurer à partir du fond de la plaque selon le constructeur instructions.
- Préparer la plaque de lavage en ajoutant 200 pi de PBS avec une pipette multicanaux à une plaque de 96 puits stérile.
- Préparer le milieu de récupération de biofilm par addition de 400 ul de 0,8 mg / ml de résazurine solution mère à 20 ml de milieu cRPMI à une concentration finale de 16 pg / ml de résazurine.
Note: résazurine est un irritant connu de la peau. Utilisez un sarrau de laboratoire, des lunettes de protection et des gants lors de la manipulation. CRPMI que les médias de récupération de biofilm a été utilisé car il fournit le signal de fond le plus bas, mais il peut être remplacé par les médias Mueller Hinton, le cas échéant. - Ajouter 150 ul de milieu de récupération de biofilm avec une pipette multicanaux à chaque puits d'une plaque à 96 puits fraîche.
- Transfert de plaque de défi de l'incubateur dans une enceinte de sécurité biologique et retirez soigneusement le sac en plastique et le film d'étanchéité.
- Retirez le peg-couvercle de la plaque de défi et rincer les cellules planctoniques dans du PBS comme décrit dans 3.4. Gardez le fond de la plaque de défi pour OD ultérieure 600 analyse (voir 4.10).
- Après rinçage, placer la cheville couvercle dans la partie inférieure de la plaque contenant le milieu de récupération du biofilm.
- Envelopper le côté de la plaque avec un film de paraffine, en faisant attention à ne pas obstruer le fond des puits de périmètre. Immédiatement après avoir enveloppé la plaque, placez-le sur le lecteur de plaque et de commencer une lecture cinétique sur une période de 24 heures en lançant précédemment fait résazurine protocole cinétique de l'étape 4.1.
- Pour quantifier la croissance des cellules planctoniques qui peuvent ou peuvent ne pas se produire pendant défi, lisez la DO 600 de l'ensemble du fond de la plaque de défi en utilisant un lecteur de plaque micro. Suivez les instructions données à l'étape 3.8.
Remarque: mélanger soigneusement le contenu de chaque puits comme cellules excrétion hors du biofilm ont tendance à croître dans les touffes au fond du puits. Les bulles dans le puits vont fortement interférer avec OD 600 lectures et doivent être évités ou supprimés avant la lecture.
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Representative Results
Le dosage de la résazurine est suffisamment sensible pour détecter de manière fiable très peu de cellules viables capables de se répliquer dans un milieu exempt de drogue après la provocation. Dans cette méthodologie, nous définissons le biofilm l'éradication de concentration minimale que la plus faible concentration à laquelle aucune conversion de résazurine est vu dans les 24 heures. Le dosage de la résazurine repose sur des molécules oxydantes présentes dans des cellules métaboliquement actives qui convertissent la couleur du colorant du bleu au rose. conversion de colorant est donc un indicateur de la croissance cellulaire, et peut être quantifiée à l'aide d'un micro lecteur de plaque fluorescente. Dans cet article, Neocuproine et Cu-Neocuproine (Neocuproine complexée avec du cuivre) ont été testés pour leur activité vers biofilm associé S. aureus applique une mise en page qui est basée sur la figure 1. Les données obtenues lors de l' exécution du protocole sont une lecture OD 600 de la plaque biofilm d'initiation, qui sert de contrôle de la qualité (données non présentées)Une lecture de la DO 600 de la partie inférieure de la plaque après la provocation a été réalisée (figure 2A), et un enregistrement cinétique de la conversion de la résazurine en son métabolite fluorescent résorufine de la plaque de recouvrement (figure 2B). En outre, une image de point d'extrémité de la plaque de défi peut être utilisé pour l' inspection visuelle de la conversion de résazurine (figure 2C) si un oui / non l' évaluation de la conversion résazurine est suffisante pour le but de l'expérience. Par ailleurs, si des capacités d'enregistrement cinétiques ne sont pas disponibles ou multiple plaques sont exécutés en parallèle, la fluorescence peut être déterminée après 24 h par une seule lecture du point final. Comme on le voit sur la figure 2A, les lectures de DO de la plaque de provocation indiquent que néocuproïne seul ne pas inhiber la croissance des cellules planctoniques; cependant, Cu-Neocuproine inhibe la croissance à 1,3 uM, comme prévu 10. Une tendance similaire est observée à partir de la cinétique de résazurine de la plaque de biofilm, ce qui indiqueque seul Cu néocuproïne est capable d'éliminer les cellules associées à un biofilm métaboliquement actives (figure 2B).
En plus de fournir des concentrations d'éradication de biofilm, l'analyse cinétique fournit des informations sur l'état métabolique du biofilm, qui est indicative du nombre de bactéries viables. Lorsque l'on compare les biofilms traités par la gentamicine à des concentrations croissantes des témoins non traités, un décalage de conversion résazurine peut être vu (Figure 3). Pour 2,5 pg / ml de gentamicine, il y a un délai de 13 heures jusqu'à ce que le puits atteint la même conversion de résazurine comme témoin non traité. Ce décalage provient probablement d'un nombre réduit de cellules viables présentes dans le biofilm traité par rapport au non traité.
Figure 1. Défi plaque mise en page. Example mise en page de la plaque de défi pouvant accueillir des essais parallèles de quatre composés en triple exemplaire, à six concentrations distinctes. des témoins non traités et de stérilité sont également inclus. La conception de la mise en page prend en charge pratique de préparation en plaque de dilutions en série à l'aide d'une pipette multicanaux. Les concentrations sont en uM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Détermination de la concentration d'éradication de biofilm minimum. Neocuproine et Cu-Neocuproine ont été testés pour le potentiel d'éradication de biofilm. (A) La DO 600 a été prise à partir de la plaque d'épreuve après l' enlèvement de la cheville de couvercle pour quantifier la croissance des cellules dissociées biofilm. Conversion (B) résazurine a été contrôlée cinétiquement dans individeux puits sur une période de 24 heures. minigraphs individuels montrent une fluorescence (RFU) au fil du temps (24 h). L'absence de conversion résazurine indique l'absence de survivants. conversion résazurine indique la présence de cellules viables excrétion de biofilm et de plus en plus dans le milieu de récupération. (C) Si une lecture cinétique est impossible ou nécessaire, puis un simple oui / pas de réponse à la présence de cellules viables peuvent être déterminées visuellement à partir de la conversion de couleur de la résazurine bleue à sa rose, forme réduite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. dosage de résazurine Kinetic révèle des effets inhibiteurs sur les bactéries dans un biofilm. Les composés peuvent ne pas éradiquer complètement les cellules de biofilm intégré, mais peut encore réduire leir viabilité. Ceci peut être vu lorsque l'on compare le retard de la résazurine conversion des puits traités avec différentes concentrations de gentamicine. Les puits qui ont un retard dans la conversion résazurine indiquent une diminution du nombre de cellules viables. Noir (seul support), Orange (0 pg / ml), Vert (0,3 pg / ml), Bleu (0,6 pg / ml), Violet (2,5 pg / ml) et gris (5 ug / ml). At fait référence à la différence de temps de conversion de résazurine exponentielle entre les échantillons non traités et gentamicine traités à la moitié de la valeur maximale approximative de fluorescence. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons décrit un dosage de biofilm modifié pour déterminer l' activité d'inhibiteurs testés sur S. biofilms aureus mettant l' accent sur l'état métabolique des cellules de biofilm associé. Alors que l'initiation de biofilm décrit et procédures de contestation des recommandations du fabricant principalement simulées, l'utilisation de résazurine colorant pour détecter et quantifier les cellules associées à un biofilm qui survivent un défi inhibiteur 24 h simplifie considérablement la procédure recommandée de récupération des cellules (via un bain d'eau sonification) et l'énumération suivante de cellules viables par comptage des CFU. Cette procédure recommandée par le fabricant implique au moins 5 étapes de manipulation supplémentaires, chacun d'entre eux d'erreurs, de main-d'œuvre, et peu pratique à automatiser. L'avantage de simplifier la procédure de lecture de l'essai de la plaque de cheville augmente son attractivité pour les opérations à haut débit et des applications.
Même si un long protocole en plusieurs étapes, ce procedure est plutôt conceptuellement simple, avec quelques étapes critiques. Mais surtout, la capacité de croître de façon répétée les biofilms de la même qualité est indispensable pour obtenir des résultats reproductibles. En outre, il faut faire preuve de prudence à chaque fois que la suppression ou le remplacement du peg-couvercle. Contactez en tout point avec le mur d'un puits perturberait le biofilm, ce qui fausse les résultats. Plus encore, le lavage adéquat est crucial: l'échec pour éliminer les cellules planctoniques à un point quelconque supprime toute possibilité de mesurer les bactéries associées à un biofilm. A l'inverse, cependant, le lavage ne doit pas être trop rigoureux; étapes de lavage supplémentaires peuvent commencer à éliminer biofilm, produisant des résultats incohérents.
L'approche de la plaque de cheville a de multiples usages, en fonction des données résultant désiré. L'essai est décrit ici comme une mesure cinétique riche en informations de conversion de résazurine métabolique en un colorant fluorescent 11. Cette conversion est associée à un changement de couleur du bleu au rose (figure 2C), qui, en additià la fluorescence de lecture quantitative, permet une lecture qualitative initiale facile simplement en observant la conversion. Après avoir retiré le couvercle de la cheville, cette conversion peut également être quantifié par lecture de l'absorbance à 600 nm la fluorescence devrait capacités ne sont pas disponibles. Bien que la fluorescence éventuellement plafonne lors de la conversion maximale du colorant dans chaque puits (avec des survivants), le début de la conversion de colorant pourrait être utilisé pour estimer la population survivante métaboliquement active par rapport au témoin non traité (Figure 3). Dans nos mains, nous avons constaté que chaque ~ 100 min retard dans l'apparition de la conversion de la résazurine correspond à une diminution d'environ 10 fois le nombre de cellules métaboliquement actives dans l'inoculum de départ par rapport au témoin non traité (tel que déterminé sur une culture de cellules planctoniques en série dilué par incréments de 10 fois en utilisant un milieu de récupération de biofilm (données non présentées)).
Au-delà des lectures cinétiques, cependant, la plaque de cheville modifiéeméthode est plus favorable à haut débit des projets d'écran de drogue que le protocole original. En mesurant la résazurine conversion comme un point final au lieu d'une cinétique, un utilisateur peut générer une analyse binaire des échantillons à suivre simple activité de composés ( par exemple, la conversion de colorant / pas de conversion), ce qui élimine le besoin de 24 heures dans un lecteur de plaque de fluorescence , ce qui permet incubations classiques. Cette méthode permet de déterminer la concentration de l'éradication de biofilm minimale sans qu'il soit nécessaire de sonication et le placage. La lecture cinétique surveille également l'état métabolique du biofilm en fonction de la condition de traitement et la concentration en inhibiteur. Le nombre réduit d'étapes de manipulation, l' augmentation de la reproductibilité et la méthode de lecture quantitative (par opposition à plaquer chaque puits individuellement 12) permet aux utilisateurs d'écran potentiellement des milliers de composés par jour dans un écran de concentration unique. En fait, les plaques peg de style ont déjà été utilisés en haut débit drécrans ug pour les dispersants de biofilm, si la résazurine (tel qu'il est utilisé ici) est un choix beaucoup plus économique que le réactif de luciférase exclusif 13 utilisé.
Alors qu'une amélioration générale sur le protocole du fabricant existant, le test présenté ici ne possède certaines limites, il faut garder à l'esprit. Intrinsèquement, nous ne mesurons la capacité métabolique des cellules associées à un biofilm. Ce test ne permet pas de mesurer la masse de biofilm ou autrement affaiblir l'architecture ou de l'intégrité biofilm. Ces effets ne seraient pas nécessairement détectés. Métaboliquement inactive, mais encore viable, persister cellules, qui ont été montrés à exister dans les biofilms 14,15 seront également détectés. En outre, des composés qui induisent quiescence sans réellement la stérilisation d'un biofilm peut apparaître à tort comme des faux positifs, selon la durée de l'état induit. Les indicateurs de viabilité sont des substituts en fin de compte pour plus de méthodes de mesure blindées telles que la cytométrie de flux ou CFUénumération, et l'utilisateur final doit déterminer la méthode appropriée. Enfin, comme la conversion de résazurine repose sur NADH endogène, l'épuisement des réserves intracellulaires pourrait être préjudiciable pour les bactéries. Bien que nous n'avons observé des effets délétères contre S. aureus, d' autres espèces bactériennes pourrait réagir différemment. Les utilisateurs doivent tester empiriquement et valider ce protocole pour divers organismes de fiabilité et de reproductibilité donnée et les environnements de laboratoire.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
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