Introduction
病原性微生物は、非急性慢性感染1に導くインビボでバイオフィルムを形成することができます。バイオフィルム関連感染は、異物（ 例えば、人工骨置換、乳房インプラント）、または気管チューブまたは尿道カテーテル2のインストールの注入を伴う医療処置の重大な危険因子です。バイオフィルムベースの感染はめったに自分でクリアされないように、これらの状況では、抗感染療法も免疫応答性個体では、ほとんど常に必要である。 黄色ブドウ球菌は、の使用中に発生するバイオフィルム関連の合併症に関与し、最も頻繁に観察された病原体の一つであります侵襲性医療機器3。
残念ながら、保護バリアとしてのバイオフィルムの本質は、浮遊細胞1,4より治療に対してより耐性になり、予測臨床的有効性の評価は、両方の初期の重要な部分です医薬品開発だけでなく、薬剤耐性サーベイランス。プランクトンの文化に焦点を当てた実験室条件は、忠実に実世界の疾病5を表していない可能性があること増加肯定応答があります。さらに問題を配合、バイオフィルムの表現型の複製は困難であり、既存のバイオフィルムモデルは面倒であり、高間およびアッセイ内変動6苦しみます。このように、多くの研究者は、必要を通じて、それによって潜在的に細菌毒性および疾患の重要な側面を無視し、薬剤感受性の浮遊性細胞アッセイをデフォルトに。
ここでは、具体的には、S、細菌をアッセイするためのプロトコルを記述します96ウェルベースのバイオフィルムシステム7,8を利用して事前に成長したバイオフィルム中の黄色ブドウ球菌 、。バイオフィルム形成と挑戦のためのプロトコルは、本質的に製造業者の勧告に従っているが、我々はbioF遺伝子の生存率を定量化するための代替情報が豊富な方法論を提示しますチャレンジ後ILM。簡単に説明すると、細菌がバイオフィルムは、プレートの蓋に取り付けられた突出ペグに形成ペグプレートで培養されます。バイオフィルム形成後、ペグは穏やかに浮遊細胞を除去するためにPBSで満たされた新鮮なプレートのウェル中に浸漬されています。ペグ蓋は、添付のバイオフィルムで、アッセイされる抗生物質の種々の濃度を含む、新規のチャレンジプレートに移します。第二のインキュベーションの後、蓋を再び取り出し、洗浄し、そしてそれらが最終インキュベーションを受けるレサズリン色素を含有する回収プレートに移します。レサズリン変換を動力学的に記録された、または定義された回復期間の後、エンドポイントの読み取りとすることができます。独自プロトコル7に記載され、このバイオフィルムの生存率を定量化するの染料ベースの方法は退屈CFU（コロニー形成単位）かなり異なるカウントベースの方法論。 OD薬物挑戦板とレサズリン変換速度の600の測定値は、生存率のリードとして働きますそれぞれプランクトンとバイオフィルム細胞のアウト、バイオフィルムの生存のための高速で信頼性の高い、情報が豊富で技術的に簡単な分析を提供しています。
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Protocol
1.バイオフィルム開始
- 栄養豊富な培地中でバイオフィルム産生生物の文化を育てます。グリセロールストックからミューラーヒントン培地10mlに黄色ブドウ球菌株ニューマンを接種します。 S.の取り扱いに関わるすべての作業を実行します手袋と安全キャビネット内球菌 。
- ロータリーシェーカー（100〜200回転）に37℃で16時間インキュベートします。
- 分光光度計と標準キュベット（：1センチメートル経路長）を用いて培養のOD 600を決定します 。
- 式を使用してchelexedロズウェルパーク記念研究所培地（cRPMI中）9で0.1のOD 600（接種材料）で接種物の20ミリリットルを準備するために必要な培養液量（V）を計算します。[V = 20ミリリットル* 0.1 / OD 600（文化）]
注：リファレンス9のcRPMIの準備の詳細を提供します。- 万×gで1分間回転させることによって遠心分離管、ペレット細胞に（上から）計算培養容量を加えます。 prepaへバイオフィルム接種再、20ミリリットルのcRPMIで過ごした成長培地を再懸濁細胞ペレットを吸引。
- 25ミリリットルのリザーバーに接種材料を注ぎます。
- 慎重にそれをまっすぐに引き上げて、滅菌96ウェルペグプレートからふたを外します。
注意：注意は、蓋から垂下ペグを汚染しないように注意する必要があります。蓋は安全キャビネット内の清浄表面上に逆さまに配置することができます。 - 200μlのマルチチャンネルピペットを用いて、底板のGへの行の各ウェルに125μlの接種材料を追加します。
- 無菌性制御などの行Hの各ウェル中の125μlの無菌のcRPMI培地を記入してください。
- ペグ蓋を取り、下に向けペグ付きプレート底部の上にそれを保持します。慎重に、それぞれのウェルを有する個々のペグの位置を合わせます。プレートとペグの間の物理的接触を避けてください。整列した後、慎重にダウン蓋を下げます。ペグの後に行われる再調整が底板は続きがあり触れてきたようにミスアライメントを避けます行Hのアミ無菌コントロール
- しっかりとシール、密封可能なビニール袋に蒸発し、場所を防止するために、パラフィンフィルムでプレートに蓋をシール。蒸発を最小限に抑えるために、できるだけ低くバッグ内の空気量を保ちます。
- 5％CO 2インキュベーター中で48時間37℃で振盪せずにインキュベートします。
注：成長の48時間は、Sのために最適となっています黄色ブドウ球菌が、使用する生物に基づいて異なります。
注：静的なインキュベーションは、アッセイを最適化するための良い出発点ですが、静かにマイクロプレートシェーカー上で150 rpmで振とうすると、一部のS.のバイオフィルムの形成を促進する可能性のある変動であります黄色ブドウ球菌が分離します。
バイオフィルムチャレンジプレートの調製
- バイオフィルムチャレンジの日に新鮮な96ウェルプレートを取ると、一貫性のない結果を回避するために、行の各ウェルBにHに、RTに平衡化のcRPMIの100μLを、追加、200μLを保持することができ、96ウェルプレートを利用メディアのペグが内側であり、バイオフィルム開始プレートのものと同一の寸法でウェルを備えていたとき。
- ステップ2.7での最終希釈を考慮するために、所望の最終濃度を2倍のcRPMI中の1.0ミリリットルで別々に4試験化合物まで希釈します。
注：良い出発点は、浮遊細胞の阻害濃度以上の8倍です。 - A3、ウェルA12にA10のA9にウェルA7におけるA6にウェルA4中の化合物2、化合物3および化合物4に、ウェルA1に化合物1の200μLを加えます。
- シリアルマルチチャンネルピペットを用いて、試験化合物を希釈し、B行と混合するためにA列から100μlのを転送します。
- そのようにして、ウェルによく100μlのを転送し続けます。各転送後に混合し、行Fに停止
- 混合した後、廃棄物容器に行Fから100μLを追放します。行GとHに液体を転送しないでください
- にマルチチャンネルピペットを用いてプレートの各ウェルにcRPMI中の100μlのを追加します。200μlにボリュームをもたらします。最終的なプレートレイアウトについては、 図1を参照してください。
3.バイオフィルムチャレンジ
- バイオフィルム開始プレートのものと同一の寸法を有するウェルを備え、新鮮な滅菌96ウェルプレートにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の200μlのを追加します。
- インキュベートバイオフィルム開始プレートからプラスチックの袋とパラフィン膜を除去。
- まっすぐふたを持ち上げます。バイオフィルムを損傷する恐れがあり、このようペグとプレート底部との接触を避けてください。 （3.8を参照）、その後のOD 600の分析のために底部を保管してください。
- （ステップ3.1から）PBSを含むプレート上にペグ蓋を配置することにより、浮遊細胞を洗い流します。 PBSの外に持ち上げ、5秒間ペグ水没し、ウェル側面に対するペグをヒットしないように注意して、もう一度水没。
- チャレンジプレートにすすぎペグ蓋を置きます。これはにつながるバイオフィルムにダメージを与えますようにペグと底板との間に不必要な接触を避けます一貫性のない結果。
- シールパラフィンフィルムでプレートし、ステップ1.10で説明したように密封可能なビニール袋に入れます。
- 5％CO 2インキュベーター内で37℃で24時間振盪せずにプレートをインキュベートします。
- 3.3からバイオフィルム開始プレートの底を取ります。各ウェルにマルチチャンネルピ ペットを使用して細菌を再懸濁し、全てのウェルに生じる成長を確認するために、適切なマイクロプレートリーダーでOD 600を測定するが、行Hの無菌コントロール
4.バイオフィルムの決意
- インキュベーションチャンバーとレサズリン変換を検出するための運動蛍光測定値をとることができる装備プレートリーダーを使用してください。 530nmの励起および590nmの発光を用いて24時間の運動蛍光測定を設定します。
- 37℃に室内温度を設定し、プレートを20分ごとを読んでいます。メーカーのinstrucに係るプレートの底から測定するために、プレートリーダーを設定します。ション。
- 滅菌96ウェルプレートにマルチチャンネルピペットを用いて200μlのPBSを添加することにより、洗浄プレートを準備します。
- 0.8ミリグラムの400μLを添加することによって、バイオフィルムの回復培地を調製/ 16 / mlのレザズリンの最終濃度までのcRPMI培地20mlのストック溶液をレサズリンmLです。
注：レサズリンは、既知の皮膚刺激性です。処理中に白衣、スプラッシュゴーグル、手袋を使用してください。バイオフィルムの回復メディアとしてのcRPMIは、最低のバックグラウンド信号を提供するために使用したが、適切な場合には、ミューラーヒントン培地に置き換えることができます。 - 新鮮な96ウェルプレートの各ウェルにマルチチャンネルピペットを用いてバイオフィルムの回復培地150μlを添加します。
- 安全キャビネットに移すインキュベーターからチャレンジプレートと慎重にビニール袋を取り外し、封止膜。
- チャレンジプレートからペグ蓋を外し、3.4で説明したようにPBSに浮遊細胞を洗い流してください。その後のOD 600 ANAための挑戦プレートの底を保ちます溶解（4.10を参照）。
- すすいだ後、バイオフィルムの回復培地を含むプレート底部にペグ蓋を置きます。
- 周囲のウェルの底を妨げないように注意しながら、パラフィンフィルムでプレートの側面を包みます。すぐにプレートをラップした後、プレートリーダーの上に置き、ステップ4.1から以前に運動プロトコルリザズリン製を開始することにより、24時間の期間にわたって運動の読み取りを開始します。
- または挑戦中に発生してもしなくてもよい浮遊細胞の成長を定量化するために、マイクロプレートリーダーを使用して、全体チャレンジプレート底部のOD 600を読み取ります。ステップ3.8で与えられた指示に従ってください。
注：バイオフィルムをオフに流して細胞がウェルの底に塊に成長する傾向があるとして慎重に各ウェルの内容を再懸濁します。ウェル内の気泡を強くOD 600の読みを妨害する、回避または読み取りの前に除去されなければなりません。
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Representative Results
レサズリンアッセイは確実に挑戦した後、薬剤を含まない培地中で複製することができる非常に少数の生存可能な細胞を検出するのに十分な感度です。この方法論では、我々は何のレサズリン変換は24時間以内に見られない最低の濃度として最小のバイオフィルム根絶濃度を定義します。レサズリンアッセイは、青からピンクへの染料の色を変換する代謝的に活性な細胞に見られる酸化的分子に依存しています。染料の変換は、このように、細胞増殖の指標であり、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて定量することができます。本論文では、ネオクプロインとCu-ネオクプロイン（銅と複合体を形成ネオクプロイン）はS.関連するバイオフィルムに向かってそれらの活性について試験しました黄色ブドウ球菌は、 図1に基づいてレイアウトを適用する。プロトコルの実行中に得られたデータは、品質管理として機能するバイオフィルムの開始プレートのOD 600読み取りである（データは示していません）プレート底部の、OD 600読書課題は、完了した後（ 図2A）、及び回収プレート（ 図2B）、その蛍光代謝産物レゾルフィンへのレサズリン変換の運動記録。はい/レサズリン変換のない評価は、実験の目的のために十分でない場合、さらに、チャレンジプレートのエンドポイント・イメージはレサズリン変換（ 図2C）の目視検査のために使用することができる。あるいは、運動記録機能が利用できないか、複数ある場合プレートは、並列に実行され、蛍光は、単一のエンドポイント読み取りにより24時間後に決定することができます。 図2Aに見られるように、チャレンジ・プレートからのOD読み取り値は、単独で、ネオクプロインは浮遊細胞の増殖を阻害しないことを示しています。 10ただし、期待どおりのCu-ネオクプロインは、1.3μMでの成長を阻害します。同様のパターンを示し、バイオフィルムプレートのレサズリン運動から観察されますその唯一のCu-ネオクプロインは、代謝的に活性なバイオフィルム関連細胞（ 図2B）を除去することができます。
バイオフィルム根絶濃度を提供することに加えて、動力学的アッセイは、生菌数の指標であるバイオフィルムの代謝状態に関する情報を提供します。未処理の対照の濃度を増加させることをゲンタマイシンで処理されたバイオフィルムを比較すると、レサズリン変換の遅れが（ 図3）を見ることができます。ウェルは未処理対照としてレサズリンの同じ変換に達するまでは2.5μg/ mlのゲンタマイシンの場合、13時間の遅延があります。この遅れはおそらく、未処理と比較して、処理されたバイオフィルム中に存在する生細胞の数の減少から来ます。
図1.チャレンジプレートレイアウト。Exampl6つの異なる濃度で、三重の4つの化合物の並列試験を収容チャレンジプレートの電子レイアウト。未処理および無菌対照も含まれています。レイアウト設計は、マルチチャンネルピペットを用いて連続希釈液の便利でプレートの準備をサポートしています。濃度はμMである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.最小バイオフィルム根絶濃度を決定する。ネオクプロインとCu-ネオクプロインは、バイオフィルムの根絶の可能性について試験しました。 （A）OD 600がバイオフィルム解離細胞の増殖を定量するためにペグ蓋を除去した後にチャレンジプレートから採取しました。 （B）レサズリン変換はINDIVIに動力学的にモニターしました24時間の期間にわたってデュアル井戸。個々のminigraphsは時間（24時間）以上の蛍光（RFU）を示しています。レサズリン変換の欠如は、生存者が存在しないことを示しています。レサズリン変換は、バイオフィルムをオフ脱落し、回復培地で増殖する生細胞の存在を示します。 （C）運動読み出しが不可能であるか、必要ではない、単純なイエス/生存細胞の存在のための答えはそのピンク、還元型に青レサズリンの色変換から視覚的に決定することができない場合。 にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
図3.キネティックレサズリンアッセイは、バイオフィルム中の細菌に対する抑制効果を明らかにした。化合物は完全にバイオフィルム埋め込 まれた細胞を根絶ないかもしれないが、それでも減らすことができますIRの生存率。ゲンタマイシンの異なる濃度で処理したウェルのレサズリン変換の遅延を比較した場合に見られます。レサズリン変換の遅延を持つウェルズは、生存細胞数の減少を示しています。ブラック（メディアのみ）、オレンジ（0 / mlの）、グリーン（0.3 / mlの）、ブルー（0.6 / mlの）、パープル（2.5 / mlの）、およびグレー（5μg/ mlの）。 Δtはおおよそ半分の最大蛍光値で未処理およびゲンタマイシン処理サンプル間の指数レサズリン変換の時間差を指す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、Sでテストした阻害剤の活性を測定するために修飾バイオフィルムアッセイを記載していますバイオフィルム関連する細胞の代謝状態に焦点を当て球菌バイオフィルム。記載のバイオフィルムの開始とチャレンジ手順主に模倣メーカーの推奨事項が、24時間の阻害剤の挑戦を生き残るバイオフィルム関連細胞を検出し、定量化するための色素をレサズリンの使用は劇的に細胞（水浴の超音波処理を介して）回復とそれに続く列挙の推奨手順を簡素化CFUの計数を経由しての生細胞。このメーカー推奨の手順は、それらの各エラーを起こしやすい、労働集約、および自動化することは非現実的に少なくとも5つの追加操作ステップを伴います。ペグプレートアッセイの読み出し手順を簡素化することの利点は、高スループット動作及びアプリケーションのための魅力を増加させます。
ステップ数によって長いプロトコル、このprocedurけれどもeは、いくつかの重要なステップで、かなり概念的には簡単です。最も決定的に、繰り返し同じ品質のバイオフィルムを増殖する能力は、再現性のある結果を得るために必須です。ペグ蓋を取り外しまたは交換するたびにまた、1は注意を払わなければなりません。よくの壁との任意の点での接触は、結果をゆがめる、バイオフィルムを崩壊させることになります。より多くのように、十分な洗浄が重要である：任意の時点で浮遊細胞を除去するための障害はバイオフィルム関連細菌を測定するための任意の機能を削除します。逆に、しかし、洗浄があまりにも厳格にすることはできません。追加の洗浄ステップは、一貫性のない結果を生成する、バイオフィルムの除去を開始することができます。
ペグプレートのアプローチは、所望の結果得られたデータに応じて、複数の用途があります。アッセイは、蛍光色素11への代謝レサズリン変換の情報が豊富な運動測定としてここに記載されています。この変換は、青からピンクへの色変化（ 図2C）、additiで関連付けられています定量的蛍光読み取り上に、単に変換を観察することで簡単に初期の質的読み出しを可能にします。ペグ蓋を除去した後、この変換はまた、機能が利用できない蛍光べきで600 nmの吸光度を読み取ることによって定量することができます。蛍光は、最終的に（生存者）を各ウェルに最大色素変換時にプラトーが、染料の変換の開始は、未処理の対照（ 図3）に代謝的に活性な生存者人口の相対を推定するために使用することができます。私たちの手では、レサズリン変換の発症における各〜100分の遅延が直列に浮遊性細胞培養で決定されるように、未処理の対照に開始接種相対（内代謝活性細胞の数の約10倍の減少に対応することを発見しましたバイオフィルムの回復培地を用いて10倍ずつ希釈した）（データは示さず）。
運動の読み出しを超えて、しかし、修正されたペグプレートこの方法は、元のプロトコルよりも、ハイスループット薬物スクリーニングプロジェクトに、より適しています。代わりに、運動の終点としてレサズリン変換を測定することにより、ユーザは、蛍光プレートリーダーで24時間の必要性を除去する化合物の単純な活性（ すなわち、染料変換/無変換）を追跡するためにサンプルのバイナリ分析を生成することができます従来のインキュベーションを可能にします。この方法は、超音波処理及びめっきを必要とせずに濃度を根絶最小バイオフィルムを決定することを可能にします。運動の読み取りは、治療条件および阻害剤濃度に応じてバイオフィルムの代謝状態を追跡します。操作工程数の減少、増加再現性、定量的な読み出し方法は、（個別ウェル12を各メッキではなく）ユーザーが単一濃度画面で、潜在的に一日あたり数千の化合物をスクリーニングすることができます。実際には、ペグ風板は、以前に、ハイスループットDRに使用されてきましたレサズリンしかし、バイオフィルムの分散のためのUG画面は、（ここで使用されるような）13を利用した独自のルシフェラーゼ試薬よりもはるかに経済的な選択肢です。
既存の製造業者のプロトコル上での一般的な改善は、ここで取り上げアッセイは、一定の制限を持っていないが1は、心に留めておく必要があります。本質的に、我々は唯一のバイオフィルム関連細胞の代謝能力を測定しています。このアッセイは、バイオフィルムの質量を測定するか、そうでなければバイオフィルムのアーキテクチャや完全性を弱めていません。これらの効果は、必ずしも検出されません。バイオフィルム14,15内に存在することが示されている細胞、存続、代謝的に不活性、まだ実行可能なも検出されないことになります。また、実際にバイオフィルムを殺菌せずに静止状態を誘導する化合物は、誤って誘導された状態の長さに応じて、偽陽性として表示される場合があります。生存率の指標は、最終的に、このようなフローサイトメトリーまたはCFUなど、より鉄壁の測定方法のために代理であり、列挙、およびエンドユーザーは、どちらの方法が適切かを決定しなければなりません。レサズリン変換は、内因性のNADHに依存しているように最後に、細胞内貯蔵の枯渇は、細菌にとって有害である可能性があります。我々はS.に対して有害な効果を認められなかったが黄色ブドウ球菌は 、他の細菌種は異なって反応することがあります。ユーザーがテストを経験的に、信頼性と再現性与えられた様々な生物やラボ環境のためにこのプロトコルを検証する必要があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
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