Introduction
병원성 미생물이 아닌 급성, 만성 감염 한 선도 생체 바이오 필름을 형성 할 수있다. 바이오 필름 관련 감염은 이물질 (예를 들어, 인공 뼈 대체, 유방 보형물) 또는 기관 튜브 또는 요도 카테터 (2)의 설치의 주입을 포함하는 의료 절차의 심각한 위험 요인이다. 바이오 필름 기반의 감염은 거의 스스로 삭제되지 않습니다 이러한 맥락에서, 항 감염 치료에도 면역 개인에, 거의 항상 필요하다. 황색 포도상 구균이 사용 중에 발생하는 바이오 필름 관련 합병증에 연루 가장 자주 관찰 병원균 중 하나입니다 침습 의료 기기 3.
불행하게도, 보호 장벽 바이오 필름의 본질은 플랑크톤 세포 1,4보다 치료에 더 많은 내성을 만들고, 예측 임상 효능의 평가는 모두 초기의 중요한 부분입니다약물 개발뿐만 아니라 약제 내성 감시. 플랑크톤 배양 집중 실험실 조건이 충실 실제 질환 5 나타내지 수 증가가 확인된다. 상기 문제를 배합 생물막 표현형의 복제가 곤란하고, 기존 생물막 모델 지루한 높은 간 및 검정 내 가변성 6 겪는다. 따라서, 많은 연구자들은 필요성을함으로써 잠재적으로 세균 독성과 질병의 중요한 측면을 무시, 약물 감수성의 플랑크톤 세포 분석에 기본.
여기에서 우리는 특히, 세균을 분석하기위한 S.을 프로토콜을 설명 구균, 96 웰 바이오 필름 기반 시스템을 이용하여 7,8- 미리 성장 생물막있다. biofilm 형성과 도전에 대한 프로토콜은 기본적으로 제조업체의 권장 사항을 따르는 동안, 우리는 biof의 가능성을 정량화하기위한 대안 풍부한 정보 방법론을 제시도전 후 ILM. 간단히, 박테리아 바이오 필름이 접시의 뚜껑에 부착 된 돌출 못에 형성 못 플레이트에서 배양한다. biofilm 형성 한 후, 못 부드럽게 플랑크톤 세포를 제거하는 PBS로 가득 신선한 판의 우물에 담근된다. 페그 뚜껑 부착 생물막으로 분석 될 다양한 농도의 항생제를 함유하는 새로운 도전 판에 전사된다. 제 인큐베이션 후, 뚜껑을 다시 제거하고 세정하고, 그들이 최종 인큐베이션 거쳐 염료, 레사 주린 함유 복구 플레이트에 전달된다. 레사 주린 변환 역학적으로 기록하거나 정의 회복 기간 후 엔드 포인트 판독으로서 수행 될 수있다. 바이오 필름의 가능성을 정량화이 염료 기반 방법은 지루한 CFU (콜로니 형성 단위) 상당히 원래 프로토콜 7에 기재된 계산 기반의 방법론을 다릅니다. 약물 도전 판 및 전환 반응 속도 레사 주린 OD 600 측정 생존 읽기의 역할생물막 생존을위한 빠르고, 신뢰할 수있는, 풍부한 정보와 기술적으로 간단한 분석을 제공하는 각각 플랑크톤과 생물막 세포의 아웃.
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Protocol
1. 바이오 필름 개시
- 영양이 풍부한 매체에 바이오 필름 생산 유기체의 문화를 성장. 글리세롤 재고 뮐러 - 힌튼 매체의 10ml에 황색 포도상 구균 균주 뉴먼을 접종한다. S.의 처리와 관련된 모든 작업을 수행합니다 장갑 및 바이오 안전성 캐비닛 내 구균.
- 회전 진탕 (100 ~ 200 RPM)에 37 ℃에서 16 시간 동안 품어.
- 분광 광도계 및 표준 큐벳 (: 1cm 경로 길이)를 사용하여 배양 OD (600)를 결정한다.
- 수식을 사용하여 chelexed 로즈웰 파크 기념 연구소 매체 (CRPMI) 9 0.1 OD 600 (접종)을 접종 20 ㎖를 준비하는 데 필요한 문화의 부피 (V)를 계산 : [V = 20 ㎖ * 0.1 / OD 600 (문화 )]
참고 : 참조 9 CRPMI 준비에 대한 세부 정보를 제공합니다.- 10,000 × g으로 1 분간 회전시켜 원심 분리기 튜브 및 펠렛 세포 (위)에서 계산 된 문화 볼륨을 추가합니다. 처리장에생물막 접종 재, 20 ㎖ CRPMI의 소비 성장 매체에 resuspend 세포 펠렛을 대기음.
- 25 ml의 저수지로 접종을 따르십시오.
- 조심스럽게 똑바로 잡아 당겨 멸균 96 웰 못 판에서 뚜껑을 제거합니다.
참고 : 관리 아래 뚜껑에서 매달려 못을 오염되지 않도록주의해야합니다. 뚜껑은 바이오 안전성 캐비닛 내에서 깨끗한 표면에 거꾸로 배치 할 수 있습니다. - 200 ㎕를 멀티 채널 피펫을 사용하여 바닥 판의 G 개의 행 (A)의 각 웰에 125 ㎕의 균액을 추가한다.
- 불임 제어와 같은 행 H의 각 웰에 125 ㎕의 멸균 CRPMI 매체를 입력합니다.
- 페그 - 뚜껑을 타고 아래로 향하게 못 함께 접시 바닥 위를 유지. 조심스럽게 각각의 우물과 개별 못 맞 춥니 다. 플레이트와 못 사이의 물리적 접촉을 피하십시오. 정렬되면, 조심스럽게 아래로 뚜껑을 낮 춥니 다. 말뚝 이후에 수행 재조정이 바닥 판은 계속 할 수 만진로 오정렬을 피행 H.에서 aminate 불임 컨트롤
- 단단히 밀봉 밀봉 가능한 플라스틱 백에 증발 장소 않도록 파라핀 필름 접시에 뚜껑을 밀봉. 증발을 최소화하기 위해 가능한 한 낮게 가방 풍량 유지.
- 5 % CO 2 인큐베이터에서 48 시간 동안 37 ° C에서 진탕없이 인큐베이션.
참고 : 성장의 48 시간은 S. 최적왔다 아우 레 우스는하지만, 다를 사용 유기체 기초.
참고 : 정적 배양 좋은 출발점이지만 부드럽게 마이크로 통에 150 rpm으로 진탕, 분석을 최적화하는 것은 일부 S.의 biofilm 형성을 향상시킬 수있는 가능한 변화입니다 구균이 분리합니다.
생물막 도전 플레이트 2. 준비
- 일관되지 않은 결과를 방지하려면 생물막 도전의 날에 신선한 96 웰 플레이트를 가지고 H.에 B를 행의 각 웰에, 실온으로 평형 CRPMI의 100 μl를 추가, 200 μl를 보유 할 수있는 96 웰 플레이트를 이용미디어의 쐐기 내부이며, 생물막 개시 판의 동일 치수 웰 특징 때.
- 단계 270에서, 최종 희석액을 설명하기 위하여, 원하는 최종 농도의 2 배 CRPMI 1.0 ㎖에 별도로 4 시험 화합물까지 희석.
참고 : 좋은 출발점이 플랑크톤 세포의 억제 농도 위의 8 배이다. - A3, 우물 A12에 A10에서 A9에 우물 A7에서 A6에 우물의 A4의 화합물 2, 화합물 3, 화합물 4 웰 A1에서 화합물 1의 200 μl를 추가합니다.
- 직렬 멀티 채널 피펫을 사용하여 시험 화합물을 희석 및 B 로우와 혼합하는 로우 A로부터 100 μl를 옮긴다.
- 이 방식으로, 웰에 웰 100 μL를 전송하는 것을 계속한다. 각 전송 후에 혼합 및 행 F.에서 중지
- 혼합 한 후, 폐기물 용기에 행 F 100 μl를 추방. 행 G와 H.에 액체를 전송하지 마십시오
- 멀티 채널 피펫에를 사용하여 플레이트의 각 웰에 CRPMI의 100 μl를 추가200 μL에 볼륨을 가지고. 최종 플레이트 레이아웃 그림 1을 참조하십시오.
3. 바이오 필름 도전
- 생물막 개시 판의 동일 치수 웰 특징 신선한 멸균 96- 웰 플레이트에 인산염 완충액 (PBS) 200 μL를 추가한다.
- 배양 생물막 개시 판에서 플라스틱 가방 및 파라핀 필름을 제거합니다.
- 똑바로 덮개를 들어 올립니다. 바이오 필름에 손상을 수도로 못 플레이트 바닥 사이의 접촉을 피하십시오. (3.8 참조) 이후 OD (600) 분석을 위해 바닥 부분을 유지합니다.
- (단계 3.1) PBS를 포함하는 판에 페그 - 뚜껑을 배치하여 플랑크톤 세포를 씻어. PBS에서 들어 올려 5 초 동안 못 잠수함, 그리고 잘 측면에 대해 못을 칠 않도록주의하면서, 한 번 더 잠수함.
- 도전 판에 세정 페그 뚜껑을 놓습니다. 생물막은 선도가 손상 될이 같은 구슬과 바닥면 사이의 불필요한 접촉을 피할 것일관성없는 결과.
- 단계 1.10에 설명 된대로 인감 파라핀 필름 판과는 밀봉 비닐 봉지에 넣습니다.
- 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 24 시간 동안 진탕없이 플레이트를 인큐베이션.
- 3.3에서 생물막 개시 판의 바닥을보십시오. 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 박테리아를 재현 탁하고 행 H. 모든 우물하지만 불임 컨트롤에서 발생하는 성장을 확인하기 위해 적절한 마이크로 플레이트 리더로 OD 600을 측정
4. 바이오 필름 결정
- 변환을 레사 주린 검출하기위한 배양 챔버와 운동 형광 판독을 복용 할 수있는 장착 된 플레이트 리더를 사용합니다. 530 nm의 여기 및 590 nm의 방출을 사용하여 24 시간 운동 형광 측정을 설정합니다.
- 37 ° C에 챔버 온도를 설정하고 판 매 20 분을 읽을 수 있습니다. 제조자의 설명서 Printed에 따른 플레이트의 바닥에서 측정하는 플레이트 판독기 설정TIONS.
- 멸균 96 웰 플레이트에 멀티 채널 피펫 PBS 200 μl를 추가하여 세척 접시를 준비합니다.
- 0.8 mg을 400 μL를 첨가하여 생물막 복구 매체를 준비 / 16 μg의 / ㎖ 레사 주린 최종 농도 CRPMI 배지 20 ㎖에 원액 레사 주린 ㎖로.
참고 : 레사 주린 알려진 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 처리하는 동안 실험실 코트, 고글, 장갑을 사용합니다. 생물막 복구 매체로서 CRPMI는 낮은 배경 신호를 제공하기 때문에 사용되었지만 적절한 경우는 뮐러 힌튼 배지로 대체 할 수있다. - 신선한 96- 웰 플레이트의 각 웰에 멀티 채널 피펫 생물막 회복 배지 150 μl를 추가한다.
- 바이오 안전성 캐비닛에 인큐베이터에서 전송 도전 판 조심스럽게 비닐 봉지에 밀봉 필름을 제거합니다.
- 도전 판에서 페그 뚜껑을 제거하고 3.4에 기술 된 바와 같이 PBS에서 플랑크톤 세포를 씻어. 이후 OD 600 아나의 도전 판의 바닥을 유지용해 (4.10 참조).
- 세정 후, 생물막 복구 매체를 포함하는 접시 바닥에 PEG-뚜껑을 놓는다.
- 주변 우물의 바닥을 방해하지 않도록주의, 파라핀 필름 접시의 측면을 감싸. 즉시 판을 배치 한 후, 플레이트 리더에 배치 단계 4.1에서 이전에 운동 프로토콜 레사 주린했다 시작하여 24 시간의 기간 동안 운동 읽기를 시작합니다.
- 또는 도전하는 동안 발생하지 않을 수있다 플랑크톤 세포의 성장을 정량화하기 위해, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 전체 도전 판 하단의 OD (600)를 참조하십시오. 단계 3.8에 주어진 지시 사항을 따르십시오.
주 : 조심 아니라 바이오 필름을 흘림 세포가 웰의 바닥에 덩어리 성장하는 경향이 각각의 내용을 재현 탁. 잘 내의 기포가 강하게 OD 600 판독을 방해하고 피하거나 읽기 전에 제거해야합니다.
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Representative Results
레사 주린 분석은 확실하게 공격 후 약물없는 매체에 복제 할 수있는 거의 가능한 세포를 검출 할 정도로 민감하다. 이 방법에서는 더 레사 주린 변환이 24 시간 내에 보지되는 최저 농도와 최소 농도 생물막 근절을 정의한다. 레사 주린 분석은 분홍색 파란색에서 염료 색상을 변환 대사 활성 세포에서 발견 산화 분자에 의존한다. 염료 변환 따라서 세포 증식의 지표이며, 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 정량화 할 수있다. 본 논문에서는 neocuproine 및 Cu-neocuproine은 (neocuproine 구리와 복합) 바이오 필름 관련 S.으로 자신의 활동에 대해 시험 하였다 아우 레 우스는도 1에 기초한 레이아웃을 적용. 프로토콜의 실행 중에 얻은 데이터는 품질 관리 역할 생물막 개시 플레이트의 OD 판독 (600)이다 (데이터는 도시하지 않음)도전 후 접시 바닥의 OD 600 독서는 (그림 2A) 완료 및 복구 플레이트 (그림 2B)의 그것의 형광 대사 레조 루핀 (resorufin)에 레사 주린 변환의 운동 기록하고있다. 또한, 상기 도전 판의 포인트 이미지는 예는 / 레사 주린 변환에는 평가 실험의 목적을 위해 충분하지 않을 경우 레사 주린 변환 (도 2C)의 육안 검사에 사용될 수있다. 대안 적으로, 운동 기록 기능이 불가능하거나 여러 경우 플레이트가 병렬로 실행되는 형광 단일 엔드 포인트 읽기 24 시간 후에 측정 할 수있다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 도전 판에서 OD 수치는 단독 neocuproine은 플랑크톤 세포의 성장을 억제하지 않는다는 것을 나타낸다; (10) 예상대로하지만, CU-neocuproine는 1.3 μM에서 성장을 억제한다. 유사한 패턴을 나타내는 바이오 필름 판의 레사 주린의 운동에서 관찰만 CU-neocuproine은 대사 활성 생물막 관련 세포 (그림 2B)를 제거 할 수 있습니다.
생물막 박멸 농도를 제공하는 것 이외에, 운동 분석은 생존 균수 나타내는 생물막의 대사 상태에 대한 정보를 제공한다. 처리되지 않은 컨트롤에 농도를 증가에서 겐타 마이신으로 치료 바이오 필름을 비교하면, 레사 주린 전환의 지연 (그림 3)을 볼 수 있습니다. 웰은 미처리 대조군으로 레사 주린 동일한 전환에 도달 할 때까지 2.5 μg의 / ㎖ 젠타 마이신의 경우, 13 시간의 지연이있다. 이 지연은 치료 가능성에 비해 처리 된 생물막에 존재하는 생존 세포의 수가 감소에서 온다.
그림 1. 도전 플레이트 레이아웃. Exampl여섯 별개의 농도 세중 네 화합물의 병렬 테스트를 수용 도전 판의 전자 레이아웃. 치료 및 불임 컨트롤도 포함되어 있습니다. 레이아웃 설계는 멀티 채널 피펫을 사용하여 계열 희석 편리에서 플레이트 제조를 지원한다. 농도는 μM에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 최소 생물막 박멸 농도를 결정. Neocuproine 및 Cu-neocuproine는 생물막 박멸 가능성에 대해 시험 하였다. (A)에 OD 600 생물막 해리 된 세포의 성장을 정량화하기 위해 PEG-뚜껑을 제거한 후, 도전 판으로부터 하였다. (B) 레사 주린 변환은 INDIVI에 역학적으로 모니터링 하였다24 시간에 걸쳐 이중 우물. 개인 minigraphs 시간 (24 시간) 이상 형광 (RFU)를 보여줍니다. 레사 주린 전환의 부족은 생존자의 부재를 나타낸다. 레사 주린 변환 생물막을 발산하고 복구 배지에서 성장하는 생존 세포의 존재를 나타낸다. 키네틱 판독이 다음 간단한 예 / 가능한 세포의 존재에 대한 응답 없음이 핑크, 환원 된 형태의 블루 레사 주린의 색 변환에서 시각적으로 확인할 수 있습니다 필요한 가능 여부가 아닌 경우 (C). 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 3. 운동 레사 주린 분석은 화합물이 완전히 생물막 포함 된 세포를 근절하지 않을 수 있습니다. 생물막에서 세균에 대한 억제 효과를 보여, 여전히를 줄일 수 있습니다적외선 생존. 겐타 마이신의 다양한 농도로 처리 웰 변환 레사 주린의 지연을 비교할 때 알 수있다. 레사 주린 변환 지연이 웰 생존 세포 수의 감소를 나타낸다. 블랙 (전용 미디어), 오렌지 (μg의 0 / ㎖), 녹색 (0.3 μg의 / ㎖), 청 (0.6 μg의 / ㎖), 보라색 (2.5 μg의 / ㎖) 그레이 (5 μg의 / ㎖). ΔT가 대략 절반 최대 형광 값의 치료 및 겐타 마이신 처리 된 샘플 사이의 지수 레사 주린 변환의 시간 차이를 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서는 S. 테스트 억제제의 활성을 결정하기 위해 수정 된 생물막 분석을 설명했다 생물막 관련된 세포의 대사 상태에 초점 구균 생물막. 설명 생물막 시작과 도전 절차 주로 모방 제조업체 권장하지만, 24 시간 억제제 도전을 생존 바이오 필름 관련 세포를 감지하고 정량화하는 염료를 레사 주린의 사용은 크게 세포 (물 목욕 음파를 통해) 복구 및 후속 열거의 권장 절차를 간소화 CFUs의 계산을 통해의 생존 세포. 이 제조업체에서 권장하는 절차를 집중하고 자동화하는 것은 비실용적 적어도 5 추가 조작 단계, 그들 각각이 발생하기 쉬운 오류, 노동을 포함한다. 페그 플레이트 분석의 판독 절차를 간소화의 장점은 높은 처리량 운영 및 응용 프로그램에 대한 매력을 증가시킨다.
단계의 수에 의하여 긴 프로토콜이 procedur 비록전자는 몇 가지 중요한 단계와, 오히려 개념적으로 간단합니다. 가장 결정적 반복적으로 동일한 품질의 바이오 필름을 성장하는 능력이 재생 가능한 결과를 얻기 위해 필수적이다. 제거하거나 페그 뚜껑을 교체 할 때마다 또한, 하나는주의를 기울여야한다. 결과를 기울이기, 생물막을 방해 것 잘의 벽 언제든지 문의하십시오. 더 때문에, 적절한 세척이 중요하다 : 어떤 시점에서 플랑크톤 세포를 제거하는 실패는 바이오 필름 관련 박테리아를 측정 할 수있는 능력을 제거합니다. 반대로하지만, 세척이 너무 엄격하지 않아야합니다; 추가 세척 단계는 일관성없는 결과를 생산, 바이오 필름을 제거 시작할 수 있습니다.
페그 플레이트 방식은 원하는 결과 데이터에 따라 여러 용도를 가지고있다. 상기 분석은 형광 염료 (11)에 대사 레사 주린 변환 풍부한 정보 운동 측정으로 여기에서 설명된다. 이 변환은 분홍색 파란색에서 색상 변화 (그림 2C), additi에서와 연관된양적 형광 읽기에에, 간단하게 변환을 관찰함으로써 쉽게 초기 질적 판독이 가능합니다. 페그 뚜껑을 제거한 후,이 변환도 사용할 수없는 기능을 형광해야 내지 600 nm에서의 흡광도를 읽어 정량화 할 수있다. 형광 결국 (생존자)를 각 웰에 최대 염료 변환에 대지 만, 염료 전환의 개시는 처리되지 않은 대조군 (도 3)로 대사 적으로 활성 서바이버 인구 대하여 추정하는데 사용될 수있다. 우리 손에서는 레사 주린 변환의 시작에서 각 ~ 100 분 지연 직렬 플랑크톤 세포 배양에서 결정된 바와 같이 처리되지 않은 대조군에 개시 접종 상대 (의 대사 적 활성 세포의 수는 약 10 배 감소에 대응하는 것을 발견 생물막 복구 매체를 이용하여 10 배 증분으로 희석) (데이터는 보이지 않음).
운동 판독을 넘어,하지만 수정 된 말뚝 판방법은 원래의 프로토콜보다 높은 처리량 약물 화면 프로젝트에 더 많은 의무가있다. 대신 운동의 종점으로 변환 레사 주린 측정함으로써, 사용자는 화합물의 간단한 활동을 추적하기 위해 샘플들의 이진 분석을 생성 할 수있다 (즉, 염료 변환 / 변환 없음) 형광 플레이트 판독기에서 24 시간의 필요성을 제거하고, 기존의 배양을 허용. 이 방법은 초음파 처리 및 도금하지 않고 농도 박멸 최소 생물막 결정을 허용한다. 운동 판독은 처리 조건 및 억제제 농도에 따라 생물막의 대사 상태를 추적한다. 조작 단계의 수가 감소 증가 재현성 정량적 판독 방법 (각 도금 반대로 잘 개별적 12)은 사용자가 단일 농도 화면 잠재적 일당 화합물 수천 선별 할 수있다. 사실, PEG 스타일 플레이트는 이전에 높은 처리량 DR에 사용 된생물막 분산제 용 UG 스크린 (여기에서 사용되는) 레사 주린 (13)를 이용 독점 루시퍼 라제 시약보다 훨씬 더 경제적 인 선택이더라도.
기존 제조 업체 프로토콜을 통해 일반적인 개선, 여기에 기능 분석은 특정 한계를 가지고 않지만 하나는 명심해야합니다. 본질적으로, 우리는 바이오 필름 관련 세포의 신진 대사 능력을 측정한다. 이 분석은 바이오 필름의 질량을 측정하거나 생물막 구조 또는 무결성을 약화하지 않습니다. 그 효과는 반드시 검출 될 수 없다. 바이오 필름 (14, 15)에 존재하는 것으로 나타났다 세포, persister, 대사 적으로 비활성,하지만 여전히 생존도 들키지됩니다. 또한, 실제로 생물막 잘못 유도 된 상태의 길이에 따라, 같은 잘못된 반응을 나타날 수 있습니다 살균하지 않고 정지를 유도하는 화합물. 생존 지표는 궁극적으로 이러한 유동 세포 계측법 또는 CFU 같은 더 철 입은 측정 방법 대용 있습니다열거하고, 적합한 방법을 결정해야 최종 사용자. 레사 주린 변환이 내생 NADH에 의존 마지막으로, 세포 내 매장의 고갈은 박테리아 유해 할 수 있습니다. 우리는 S.에 대한 해로운 효과를 관찰하지 않은 반면 구균은 다른 세균 종은 다르게 반응 할 수 있습니다. 사용자적인 테스트를 통해 신뢰성과 재현성 주어진 다양한 생물 및 실험실 환경이 프로토콜을 확인해야합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
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