바이오 필름 관련 타겟팅<em> 황색 포도상 구균</em> 사용 레사 주린 기반 약물 감수성 분석
Summary
Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.
Abstract
Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.
Introduction
병원성 미생물이 아닌 급성, 만성 감염 한 선도 생체 바이오 필름을 형성 할 수있다. 바이오 필름 관련 감염은 이물질 (예를 들어, 인공 뼈 대체, 유방 보형물) 또는 기관 튜브 또는 요도 카테터 (2)의 설치의 주입을 포함하는 의료 절차의 심각한 위험 요인이다. 바이오 필름 기반의 감염은 거의 스스로 삭제되지 않습니다 이러한 맥락에서, 항 감염 치료에도 면역 개인에, 거의 항상 필요하다. 황색 포도상 구균이 사용 중에 발생하는 바이오 필름 관련 합병증에 연루 가장 자주 관찰 병원균 중 하나입니다 침습 의료 기기 3.
불행하게도, 보호 장벽 바이오 필름의 본질은 플랑크톤 세포 1,4보다 치료에 더 많은 내성을 만들고, 예측 임상 효능의 평가는 모두 초기의 중요한 부분입니다약물 개발뿐만 아니라 약제 내성 감시. 플랑크톤 배양 집중 실험실 조건이 충실 실제 질환 5 나타내지 수 증가가 확인된다. 상기 문제를 배합 생물막 표현형의 복제가 곤란하고, 기존 생물막 모델 지루한 높은 간 및 검정 내 가변성 6 겪는다. 따라서, 많은 연구자들은 필요성을함으로써 잠재적으로 세균 독성과 질병의 중요한 측면을 무시, 약물 감수성의 플랑크톤 세포 분석에 기본.
여기에서 우리는 특히, 세균을 분석하기위한 S.을 프로토콜을 설명 구균, 96 웰 바이오 필름 기반 시스템을 이용하여 7,8- 미리 성장 생물막있다. biofilm 형성과 도전에 대한 프로토콜은 기본적으로 제조업체의 권장 사항을 따르는 동안, 우리는 biof의 가능성을 정량화하기위한 대안 풍부한 정보 방법론을 제시도전 후 ILM. 간단히, 박테리아 바이오 필름이 접시의 뚜껑에 부착 된 돌출 못에 형성 못 플레이트에서 배양한다. biofilm 형성 한 후, 못 부드럽게 플랑크톤 세포를 제거하는 PBS로 가득 신선한 판의 우물에 담근된다. 페그 뚜껑 부착 생물막으로 분석 될 다양한 농도의 항생제를 함유하는 새로운 도전 판에 전사된다. 제 인큐베이션 후, 뚜껑을 다시 제거하고 세정하고, 그들이 최종 인큐베이션 거쳐 염료, 레사 주린 함유 복구 플레이트에 전달된다. 레사 주린 변환 역학적으로 기록하거나 정의 회복 기간 후 엔드 포인트 판독으로서 수행 될 수있다. 바이오 필름의 가능성을 정량화이 염료 기반 방법은 지루한 CFU (콜로니 형성 단위) 상당히 원래 프로토콜 7에 기재된 계산 기반의 방법론을 다릅니다. 약물 도전 판 및 전환 반응 속도 레사 주린 OD 600 측정 생존 읽기의 역할생물막 생존을위한 빠르고, 신뢰할 수있는, 풍부한 정보와 기술적으로 간단한 분석을 제공하는 각각 플랑크톤과 생물막 세포의 아웃.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 S. 테스트 억제제의 활성을 결정하기 위해 수정 된 생물막 분석을 설명했다 생물막 관련된 세포의 대사 상태에 초점 구균 생물막. 설명 생물막 시작과 도전 절차 주로 모방 제조업체 권장하지만, 24 시간 억제제 도전을 생존 바이오 필름 관련 세포를 감지하고 정량화하는 염료를 레사 주린의 사용은 크게 세포 (물 목욕 음파를 통해) 복구 및 후속 열거의 권장 절차를 간소화 C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Saran Kupul for technical assistance. This work was supported in part by NIH grant R01-AI104952 to FW. Further support was provided by the University of Alabama at Birmingham (UAB) Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI027767) that was made possible by the following NIH Institutes: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Materials
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
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