Introduction
致病微生物可在体内形成生物膜导致非急性慢性感染1。生物膜相关的感染是涉及异物（ 例如，人造骨替换，乳房植入物）或气管导管或导尿管2的安装植入医疗过程的严重危险因素。在这些情况下，抗感染治疗几乎总是必要的，因为基于生物膜的感染很少自行清除，甚至在免疫的个体。 金黄色葡萄球菌是在生物膜相关并发症牵连的最常观察到的病原体的使用期间发生的1微创医疗器械3。
不幸的是，生物膜的性质作为保护屏障，使他们对治疗比浮游细胞1,4-更耐磨，并预测临床疗效的评价是两个初始的关键部分药物开发以及耐药性监测。有越来越多的承认，实验室条件下，专注于浮游文化，可能无法忠实地代表现实世界的疾病5。进一步使问题复杂化，生物膜表型的复制是困难的，现有的生物膜模型繁琐和高之间和内部检测变异6受苦。因此，许多研究人员，通过必要性，默认为药物敏感性的浮游细胞的测定，从而潜在地忽略细菌毒力和疾病的一个重要方面。
在这里，我们描述了协议用 于测定细菌，特别是S.金黄色葡萄球菌 ，在利用96孔基于生物膜系统-7,8-预生长的生物膜。而对生物膜形成和挑战的协议基本上遵循制造商的建议，我们提出一种替代信息丰富的方法用于量化biof的可行性攻击后ILM。简要地说，细菌是在栓板，其中生物膜上附着在板的盖的突出栓形成中培养。经过生物膜形成，钉在一个新的盘子装满PBS去除浮游细胞的井轻轻蘸。栓柱盖，具有附着生物膜，被转移到一个新的挑战板，含有不同浓度的抗生素进行检测。第二次温育后，盖子被再次除去，洗净，并转移至含有刃天青染料，这里它们经受一个最终温育恢复板。刃天青转化动力学上能够记录或作为一个定义的恢复期后端点读数。此染料型定量生物膜的可行性的方法从繁琐CFU（菌落形成单位）有很大不同的原始协议7所述计数基于方法学。药物的挑战板和刃天青转化动力学OD 600测量结果作为可行性读浮游和生物膜细胞，分别出局，提供快速，可靠，且技术上简单的信息丰富的生物膜存活试验。
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Protocol
1.启动生物膜
- 成长生物膜的产生菌的培养在营养丰富的培养基。接种金黄色葡萄球菌菌株Newman中从一个甘油10毫升的Mueller-Hinton培养基的。执行涉及处理S.各项工作金黄色葡萄球菌手套和生物安全柜中。
- 在37℃下孵育16小时，在旋转摇动器（100-200转）。
- 决定使用分光光度计和标准比色皿（路径长度：1厘米）的文化的OD 600。
- 计算使用下面的公式中chelexed罗斯韦尔园区纪念研究所介质（CRPMI）9来制备20种菌的溶液具有0.1的OD 600（接种物）所需的培养的体积（V）：[V = 20毫升* 0.1 / OD 600（培养）]
注：参考9 CRPMI准备提供详细信息。- 通过在10,000×g下旋转1分钟加入计算培养物体积（从上方）到离心管中，并沉淀细胞。为了准备工作重新生物膜接种物，吸在20ml CRPMI所述废生长培养基和悬浮细胞沉淀。
- 倾接种到25ml的贮存器。
- 小心地向外径直从无菌96孔挂钩板取下盖子。
注意：必须小心不要污染栓挂从盖向下。盖子可以倒放在干净的表面上的生物安全柜中。 - 用200μl多通道移液器，加入125微升接种物到A行底板的G各孔中。
- 填写排H的每个以及无菌控制125微升无菌CRPMI网上平台。
- 取栓盖并保持其上的板底部朝下钉。小心地将各自的水井个人挂钩。避免在板和钉之间的物理接触。一旦对准，降低盖子仔细了。避免错位的钉后进行调整已经触及底板可续行H.氨化无菌控制
- 密封盖子平板用石蜡膜，防止蒸发发生在一个密封的塑料袋，封口严密。保持在袋尽可能低以减少蒸发的空气量。
- 孵育没有在一个5％CO 2培养箱中于37℃振荡48小时。
注：48小时增长已经最佳为S.金黄色葡萄球菌 ，但会发生变化根据所使用的生物体。
注意：虽然静态孵化是一个很好的起点，以优化测定法，以150rpm在微孔板摇床轻轻摇晃是一个可能的变化，可能会提高一些S.生物膜的形成金黄色葡萄球菌菌株。
2.生物膜挑战板的制作
- 上生物膜挑战的天采取一个新的96孔板中并加入100微升CRPMI的，平衡至室温，以行的每个孔B至H.为了避免不一致的结果，利用96孔的板，其可容纳200μl的媒体当钉在里面，并设有尺寸完全相同生物膜启动板的孔中。
- 稀释最多4试验化合物分别于1.0ml CRPMI的2倍的所需最终浓度，以占步骤2.7的最终稀释度。
注意：一个好的起点是8折浮游细胞的抑菌浓度以上。 - 井A1加入200μl化合物1至A3，化合物2井A4至A6，化合物3井A7至A9和化合物4井A10至A12。
- 通过使用多道移液器连续稀释测试化合物，并从A行转移100微升排B和混合。
- 以这种方式，继续传输100微升很好很好。每次传输后混匀，停止行F.
- 混合后，从排出F行100微升到废物容器中。不要任何液体转移到行G和H
- 添加100微升CRPMI向板的每个孔用多道移液器向使体积为200微升。 图1所示为最终的板布局。
3.生物膜挑战
- 加入200μl的磷酸缓冲盐水（PBS）的到设有尺寸完全相同生物膜起始板的孔中新鲜无菌96孔板中。
- 取下培养生物膜启动盘的塑料袋和石蜡膜。
- 掀开锅盖直线上升。避免这些桩和板底部，因为这之间的接触可能会损坏生物膜。保持底部为后续OD 600分析（见3.8）。
- 通过将钉盖到含PBS（步骤3.1）的平板冲洗掉浮游细胞。淹没钉5秒，吊出PBS，并淹没一次，小心不要撞到以及两侧的挂钩。
- 放置冲洗钉盖成挑战板。避免钉和底板，因为这之间的不必要的接触会损伤生物膜导致不一致的结果。
- 密封板用石蜡膜并放置到密封的塑料袋中步骤1.10中描述。
- 孵育所述板没有在5％ 的 CO 2培养箱中于37℃振荡24小时。
- 以生物膜启动盘底3.3。重悬在每个细菌用多道移液器井并测量OD 600与适宜酶标仪确认生长在所有孔中，但在排H的无菌控制发生
4.确定生物膜
- 使用配有孵育室和能够采取动力学荧光读数酶标仪检测刃天青转换。使用530nm的激发和590 nm发射设立了24小时动能荧光测量。
- 设置腔室温度至37℃，并有板阅读每20分钟。设置板器根据制造商的instruc到从板的底部测量系统蒸发散。
- 通过加入200微升的PBS用多道移液器到无菌的96孔板中制备洗涤板。
- 通过加入400微升的0.8毫克制备生物膜回收介质/ ml的刃天青原液至20ml CRPMI培养基至16微克/毫升刃天青的终浓度。
注：刃天青是一种已知的皮肤刺激。在处理使用白大褂，防护眼镜和手套。 CRPMI作为生物膜回收培养基使用，因为它提供了最低的背景信号，但它可以通过的Mueller Hinton培养基如果适当被取代。 - 添加150微升生物膜回收培养基用多道移液器到一个新的96孔板的每个孔中。
- 转移的挑战，从板块到孵化一个生物安全柜，小心地取出塑料袋，封口膜。
- 从挑战板拆下钉盖和3.4中描述的冲洗掉浮游细胞在PBS。保持挑战板的底部后续OD 600 ANA裂解（见4.10）。
- 冲洗后，将钉盖到含有生物膜回收介质板底部。
- 包装用石蜡膜板的一侧，小心不要妨碍周边井的底部。立即包裹后盘，将其放置在酶标仪，并通过启动从步骤4.1以前刃天青动能协议作出重新开始进行24小时的动力读。
- 量化浮游细胞的生长可能会或可能不会挑战过程中发生的是，读取用微型板读数器在整个挑战板底部的OD 600。按照步骤3.8的指示。
注意：仔细悬浮每个的内容以及细胞脱落掉的生物膜倾向于在井的底部中团块生长。阱内的任何气泡会强烈的OD 600读数干扰，必须避免或之前读除去。
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Representative Results
刃天青试验是非常灵敏可靠地检测能力攻击后复制的药物培养基很少活细胞。在这种方法中，我们定义的最小生物膜根除浓度在哪些没有刃天青转化24小时内看到的最低浓度。刃天青检测依赖于它转换染料的颜色由蓝色变为粉红色代谢活跃的细胞中发现的氧化分子。染料转换是这样的细胞生长的一个指标，并且可以使用荧光微板读数器来量化。在本文中，亚铜灵和Cu-亚铜灵（铜亚铜灵络合）为他们的活动进行了测试对生物膜有关S.金黄色葡萄球菌施加是基于图1的布局。该协议的执行过程中获得的数据的OD 600读数生物膜起始板的，它作为一种质量控制（数据未示出）中，板底部的挑战后的OD 600读数已经完成（ 图2A），和刃天青变换的动能记录到回收板（ 图2B）的其荧光代谢物试卤灵。进一步的挑战板的终点图像可以用于刃天青转换（ 图2C）的目视检查，如果有/无刃天青转换评价足够用于实验的目的。另外，如果动能录制功能不可用或多个板被并行运行，荧光可以之后通过单个端点读取24小时来确定。如在图2A中看到的那样，从挑战板的OD读数表明，单独亚铜灵不抑制浮游细胞的生长;然而，铜亚铜灵以1.3μM抑制生长，如预期10。一个类似的模式被从生物膜板的刃天青动力学观察到的，指示只有铜亚铜灵能够消除代谢活性生物膜相关的细胞（ 图2B）。
除了提供生物膜根除浓度，动力学测定法提供了在其上指示的活菌数的生物膜的代谢状态的信息。当比较用庆大霉素的浓度增加对未处理的对照处理的生物膜，刃天青变换的滞后可以看出（ 图3）。为2.5微克/毫升庆大霉素，有一个13小时的延迟，直到井达到刃天青的相同的转换作为未处理的对照。这种滞后可能来自存在于处理生物膜与未处理的活细胞的数目减少。
图1.挑战板布局。为例挑战板电子布局在六个不同浓度的容纳一式三份四种化合物并行测试。未处理的和不育对照也包括在内。布局设计支持方便板准备使用多管移液器连续稀释液。浓度是μM。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.确定最小生物膜根除浓度。新铜试剂和Cu-亚铜灵被消灭生物膜电位测试。 （A）中的OD 600从挑战板采取除去钉盖的后量化生物膜脱落的细胞的生长。 （B）刃天青转化率在INDIVI动力学监测双口井在24小时的时间内。个人minigraphs显示一段时间（24小时）荧光（RFU）。缺乏刃天青转化表示没有幸存者。刃天青转换表示存活细胞脱落掉的生物膜和在回收培养基中生长的存在。 （3）如果动能读出是不可能或不需要，那么一个简单的是/否的答案活细胞的存在，可以直观地从蓝色刃天青到粉色，简化形式的颜色转换决定。 请点击这里查看该图的放大版本。
图3.动力学测定刃天青揭示生物膜对细菌有抑制作用。化合物可能无法完全根除生物膜嵌入细胞，但仍可以减少IR可行性。这可以比较刃天青用不同浓度的庆大霉素处理的孔的转化延迟时可以看到。具有在刃天青转换延迟井表示存活细胞的数量减少。黑色（仅媒体），橙（0微克/毫升），绿（0.3微克/毫升），蓝（0.6微克/毫升），紫（2.5微克/毫升），和灰色（5微克/毫升）。 ΔT是指在大致一半最大荧光值未处理和庆大霉素处理的样品呈指数刃天青转换的时间差。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里，我们已经描述了修饰的生物膜测定为S上确定测试抑制剂活性葡萄球菌生物膜注重生物膜有关的细胞的代谢状态。尽管所述生物膜起始和挑战的程序大多模仿制造商的建议，使用刃天青染料来检测和量化存活24小时抑制剂挑战生物膜相关的细胞显着地简化细胞回收（通过水浴超声处理），并随后列举的建议的过程通过的CFU计数的活细胞。该制造商推荐的程序涉及至少5个额外的操作步骤，他们每个人容易出错，劳动强度大，而且不切实际的自动化。简化了栓板测定的读出过程的优点增加了其对于高吞吐量操作和应用的吸引力。
虽然通过的步数冗长协议，该再修改的e是相当简单的概念，很少关键步骤。最关键的是，反复种植同样质量的生物膜的能力是获得可重复的结果至关重要。此外，必须拆卸或更换钉盖时小心。在一个良好的墙上任意点的联系会破坏生物膜，倾斜的结果。更何况，充足的洗濯是至关重要的：失败在任何时候以去除浮游细胞移除任何测量生物膜相关细菌的能力。相反，尽管，洗涤不能太严格;额外的洗涤步骤可以开始删除生物膜，产生不一致的结果。
栓柱板方法具有多种用途，这取决于所期望的结果数据。该法在这里描述为代谢刃天青转化的一个信息丰富的动能测量到的荧光染料11。这种转换是用从蓝色到粉红色的色移（ 图2C），其中，在additi相关到定量荧光读，可以容易初始质读出简单地通过观察转换。除去塞销盖后，这种转换也可以通过读取在600nm的吸光度应该荧光能力不可用定量。虽然荧光最终在每个时最大染料转化高原以及（幸存者），染料转化的发作可以使用相对于未处理的对照（ 图3）的代谢活性幸存者人口来估计。在我们手中，我们已发现，每个〜100分钟的延迟在刃天青转换的开始对应于开始相对于未处理的对照的接种（作为测定浮游细胞培养串联在代谢活性细胞的数量约10倍的降低在使用生物膜恢复介质10倍递增稀释（数据未显示））。
超越动力学读数，虽然，改性栓板方法更适合于高通量药物筛选项目比原始协议。通过测量刃天青的转换作为一个端点代替动力学，用户可以产生样品的二元分析来跟踪化合物简单的活动（ 即，染料转换/不转换），这消除了荧光板读数器的需要24小时，允许传统的孵化。这种方法允许确定的最小生物膜根除浓度无需声处理和电镀。动力学读还跟踪根据处理条件和抑制剂浓度生物膜的代谢状态。数目减少的操纵步骤，增加的再现性，定量读出方法（相对于电镀各孔单独地12），用户可以潜在地筛选数以千计每天化合物在单一浓度屏幕。事实上，栓式板先前已在高通量博士使用微克屏幕生物膜分散剂，虽然刃天青（如这里使用的）是一个更经济的选择比利用13专有的荧光素酶试剂。
而在现有的制造商协议的普遍改善，这里的特色化验确实有一定的局限性必须牢记。本质上，我们只衡量生物膜相关细胞的代谢能力。此法不测量生物膜质量或以其他方式削弱生物膜结构和完整性。这些影响不一定被检测到。代谢不活跃，但仍存活，持留细胞，这已被证明在生物膜14,15存在也将被检测到。进一步，诱导静止而不实际灭菌生物膜可能错误地显示为误报，取决于诱导状态下的长度的化合物。可行性指标是最终替代物更铁一般的测量方法，如流式细胞仪或CFU枚举，并且最终用户必须确定哪些方法是合适的。最后，由于刃天青转换依赖于内源NADH，细胞内贮存的耗竭可能是有害的细菌。虽然我们还没有看到对S.有害影响金黄色葡萄球菌 ，其他细菌物种可能会作出不同的反应。用户必须经验测试和验证此协议的可靠性和重复性给予不同的生物体和实验室环境。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Follow recommendations of manufacturer |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 medium chelexed for 1 hr with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Resin | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-plates | Innovotech | 19111 | |
| Resazurin Sodium Salt | Sigma | R7017 | 800 µg/ml in DI water Filter sterile |
| Micro Plate Shaking Platform | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Plate Reader | Biotek | ||
| Gen5 software | Biotek | Recording and analysis of resazurin conversion | |
| Neocuproine | Sigma | N1501 | prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80 ºC |
| Copper sulfate | Acros Organics | 7758-99-8 | prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4 ºC |
| Cu-Neocuproine | Self-Made | Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration. | |
| Gentamicin | Sigma | G3632-1G |
References
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19 (2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18 (2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854 (2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53 (2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
