Introduction
سرطان الثدي هو من بين الأورام الخبيثة الأكثر شيوعا التي تؤثر على السكان الإناث في جميع أنحاء العالم. وذكرت أكثر من 1.3 مليون حالة إصابة بسرطان الثدي كل عام في جميع أنحاء العالم 1،2. على الرغم من أن الخلايا السرطانية قد تعتبر تقليديا متجانسة من الناحية البيولوجية والتكاثري للغاية، أصبح من الواضح أن سرطان الثدي هو جينيا وغير متجانسة سريريا. مقاومة للعقاقير المضادة للسرطان انتشارا هي السمة المميزة لسرطان الثدي المتقدمة، مما أدى إلى وفيات في الغالبية العظمى من المرضى من خلال تسهيله من تطور السرطان وبعد ورم خبيث 3.
الرنا الميكروية (miRNAs) هي فئة من جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة حوالي 22 النيوكليوتيدات طويلة أن تنظيم التعبير الجيني عن طريق تثبيط عملية الترجمة مرنا أو التوسط مرنا تدهور 4. وقد تم تحديد أكثر من 2000 miRNAs مختلفة حتى الآن في البشر، التي ترتبط الأمراض التي تصيب الإنسان 5. مجموعة متزايدة من الدراسات هفأظهرت الإلكترونية التي miRNAs يمكن أن تعمل كما المسرطنة والمكثفات الورم وغالبا ما dysregulated في الأورام 6. miRNAs تؤثر بشدة كل من تكون الأورام الأولية عن طريق التحكم في الهيئات التنظيمية الرئيسية للتقدم دورة الخلية، الشيخوخة، موت الخلايا المبرمج والالتهام الذاتي، جنبا إلى جنب مع تلك الحركة الخلايا السرطانية، والغزو والانبثاث 7.
ارتبط التعبير شاذ ميرنا أيضا مع الآثار السريرية مثل المرحلة، والتمايز، والتشخيص والاستجابة إلى العلاج المساعد 8. على وجه الخصوص، وزيادة يرتبط ارتباطا مير 146 التعبير مع سوء أحوال الطقس في مرضى سرطان الرئة 9. وقد أثبتت دراسة أخرى أن فقدت التعبير عن ميرنا let7b مرتبط الظواهر الخبيثة، وبالتالي، وضعف البقاء على قيد الحياة 6. فهم أنواع من الخلايا والهياكل التي تعبر عن miRNAs هو جزء مهم من فهم آليات يمكن من خلالها إحداث تغييرات في ميرنا خلية تأثير التعبير والأنسجة الظواهر 10. يتم أخذ بعض miRNAs وجدت أن يفرز في الخلايا اللحمية في الخلايا الظهارية وتعمل خصيصا على أهدافها. في السياق نفسه، تفرز مير 212 و مير-132 التي سدى وتنظيم التفاعلات الظهارية انسجة اللازمة لنمو الأقنية خلال تطوير الغدة الثديية 11. الهدف العام من هذه الورقة هو شرح بروتوكول مفصلة للكشف عن التعبير ميرنا في أنسجة سرطان الثدي من خلال ميرنا في الموقع التهجين. لقد الأمثل جميع الظروف لفحص مستويات التعبير ميرنا-489 في سرطان الثدي عينات المرضى. تحقيقا لهذه الغاية، استخدمنا DIG المسمى مقفل النووي حمض (LNA) التحقيق في تجربتنا. وكان بعض من النيوكليوتيدات لها لتعديل حالات الغدد، وهذا هو، والجسر الذي يربط بين الميثيلين 2 "ذرة أكسجين و 4" ذرة الكربون في العمود الفقري ريبوز الذي يحدد النوكليوتيدات بحيث يبقى "في مكان مغلق" بعد التهجين. ونتيجة لذلك، هو أكثر صعوبةللمجمع المهجنة لتفسد 12،13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للمستشفى شونام الجامعة الوطنية هواسون وجامعة ولاية كارولينا الجنوبية. وقدمت عينات TMA تتألف من سرطان الثدي ومطابقة الأنسجة الطبيعية للثدي المجاورة من قبل البنك الحيوي من مستشفى شونام الجامعة الوطنية هواسون، وهو عضو في شبكة البنك الحيوي كوريا.
1. الحل تحضير
- إعداد 1 لتر من الدناز وريبونوكلياز المياه مجانا. جعل جميع الحلول الكيماوية التي تستخدم diethylpyrocarbonate (DEPC) المياه المعالجة. علاج 1 لتر من الماء مع 500 ميكرولتر من DEPC واحتضان لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. تعقيم المياه إلى تعطيل DEPC.
تحذير: لا يستنشق DEPC لأنه من المعروف مسرطنة. - إعداد برنامج تلفزيوني 1X من 10X PBS باستخدام المياه DEPC المعالجة.
- إعداد 20x ومحكمة أمن الدولة (حل 175.3 غرام من كلوريد الصوديوم و 88.2 غرام من سترات الصوديوم في 800 مل من الماء، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع انخفاض قليل في 14 N حل حمض الهيدروكلوريك وضبط مستوى الصوت إلى 1 لتر مع واتإيه)، و 4٪ لامتصاص العرق، و 95٪ من الإيثانول و 80٪ من الإيثانول باستخدام المياه DEPC المعالجة.
- إضافة 8 مل من ثلاثي إيثانول أمين و 1.05 مل من حمض الهيدروكلوريك في 590 مل من المياه المعالجة DEPC وإضافة 1.5 مل من أنهيدريد الخل لأستلة.
- تجهيز 50 ميكروغرام / ميكرولتر بروتين كاف في المخزن (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 في DEPC المياه المعالجة).
- إعداد العازلة التهجين يتألف من 500 ميكرولتر من الفورماميد، 250 ميكرولتر من 20X SSC، 100 ميكرولتر من 50X حل دينهارت لو 12.5 ميكرولتر من تي RNA، 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي الرنجة الحيوانات المنوية، 30 ميكرولتر من RVC، 0.02 غرام من عرقلة كاشف و 50 ميكرولتر من الماء DEPC. إعداد الطازجة.
2. أقسام نسيج الثدي
- قطع 5 ميكرون أقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين مع مشراح وتطبيق قسم لشحن شريحة 14.
ملاحظة: وقد أعد أنسجة الثدي المستخدمة هنا في وقت سابق من شبكة البنك الحيوي كوريا.
3. الأنسجة التحضير
- إزالة البارافين جيئة وذهابام الأنسجة عن طريق غمر الشرائح في 2X جرة Coplin في زيلين الطازجة لمدة 10 دقيقة لكل منهما وترطيب قسم الأنسجة بنسبة 5 حضانات دقيقة في خفض تركيزات الإيثانول (100٪، 95٪ و 80٪) في [ده 2 O. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان.
- تزج الأنسجة في DEPC المياه المعالجة لمدة 5 دقائق. في هذه المرحلة جعل الحدود حول قسم الأنسجة مع قلم حاجز مسعور.
- إصلاح الأنسجة مع PFA 4٪ لمدة 15 دقيقة تليها يغسل مع برنامج تلفزيوني.
- تزج الأنسجة في 0.3٪ تريتون X-100 / برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة تليها يغسل مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان العينة مع 50 ميكروغرام حل / ميكرولتر بروتين كاف لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم احتضان أقسام الأنسجة مع ثلاثي إيثانول أمين وأنهيدريد الخل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها يغسل مع برنامج تلفزيوني. لا يلزم غسل برنامج تلفزيوني بين العلاج بروتين كاف وثلاثي إيثانول أمين / العلاج أنهيدريد الخليك.
4. التهجين
- غسل الأنسجة بدقة وincuباتي قسم الأنسجة مع العازلة التهجين لمدة 2 إلى 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. عادة 120 العازلة التهجين ميكرولتر ما يكفي لتغطية قسم الأنسجة.
- تمييع 5'-DIG المسمى LNA التحقيق لتركيز النهائي من 3:00 في 120 حل التهجين ميكرولتر. كما أن تركيز الأسهم عادة ما يكون 40 نانوغرام / ميكرولتر، إضافة 3 ميكرولتر من الأسهم لعازلة تهجين 120 ميكرولتر واحتضان الخليط في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- احتضان قسم الأنسجة مع التحقيق بين عشية وضحاها في 54 درجة مئوية (تيم) في غرفة رطبة. عادة 120 ميكرولتر كافية لتغطية مقطع واحد. إنشاء الرطوبة باستخدام اثنين من مناشف ورقية مبللة. الحجم المثالي للغرفة هو 10 بوصة 8 بوصة.
- ملاحظة: تيم قد تكون مختلفة لمختلف ميرنا. 54 درجة مئوية هو ذكر لمير 489.
5. صرامة غسل
- غسل الأنسجة مع 5X SSC لمدة 7 دقائق (بعد خطوة التهجين، ريبونوكلياز ظروف خالية لم تعد المطلوبة).
- غسل قسم الأنسجة خفة دمح 1X SSC لمدة 7 دقائق مرتين في 57 درجة مئوية.
- غسل قسم الأنسجة مع SSC 0.2x لمدة 7 دقائق عند 57 درجة مئوية.
- غسل قسم الأنسجة مع SSC 0.2x لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان قسم الأنسجة في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
6. حجب
- احتضان قسم الأنسجة مع عازلة تمنع في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في غرفة رطبة (لجعل عازلة تمنع إضافة 2 مل FBS، 10 ميكرولتر من توين-20 و 3 ميكرولتر من جيش صرب البوسنة في 18 م من برنامج تلفزيوني تخزين عازلة تمنع في 4 ° C).
7. الابتدائية الأجسام المضادة الحضانة والتنمية
- تمييع 1: 300 المضادة للDIG-AP الأجسام المضادة في عرقلة العازلة واحتضان قسم الأنسجة مع الأجسام المضادة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- غسل المقاطع مع غسل العازلة 3 مرات، لمدة 5 دقائق لكل منهما (العازلة التي تقدمها مجموعة تطوير).
- تطوير قسم الأنسجة مع مجموعة تجارية لالفوسفاتيز القلوية التي تنتج CY-3 ضوء الفلورسنت. <لى> غسل القسم مع غسل العازلة لمدة 5 دقائق. قسم صمة عار مع 100 ميكرولتر من 2.5 نانوغرام / ميكرولتر صبغة هويشت لمدة 5 دقائق تليها غسل 5 دقائق مع غسل العازلة.
- جبل القسم مع تصاعد عازلة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام 15 ميكرولتر في قسم الأنسجة والقضاء حل تصاعد المفرط مع أنسجة مسح. ختم الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة لمنع تسرب.
- مراقبة المجهر قسم الفلورسنت باستخدام مع 10X عدسة الكلي حتى التكبير هو 100X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام أنسجة الأورام السرطانية الثديية البشرية لتحديد التعبير ميرنا-489. تم العثور على الثديية قناة الغدة والخلايا الظهارية للتعبير عن أعلى بكثير ميرنا-489 مستويات من الأنسجة المجاورة ورم في اثنين من المرضى (الشكل 1A و 1B). يدل هذا بوضوح أن ميرنا-489 التعبير قد ضاع في أنسجة الورم، مما يشير إلى ورم النشاط القمعية من ميرنا-489. لمزيد من تأكيد هذه النتائج، نسيج الورم والأنسجة الطبيعية المجاورة من نفس المريض وتمت مقارنة. كما لوحظ في الشكل 2A و 2B، تم العثور على الأنسجة الطبيعية للتعبير عن المزيد من ميرنا-489 من نسيجه الورم المجاورة. 10 ميكرون في الصور يشير شريط النطاق. أخذت الصور باستخدام عدسة 10X.
الشكل 1: التعبير عن مير 489 في الأنسجة الطبيعية للثدييتم عرضها. كل خلايا هيكل لاصق والأورام العادية في نفس القسم. الأنسجة هي من مختلف مرضى سرطان الثدي. القناة الثديية طبيعي والغدة الثديية التعبير ميرنا-489 في حين تغيب في نسيج الورم. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعبير عن مير 489 في رعاية سرطان الثدي الزوج المريض واستخدمت مجموعة صغيرة الأنسجة لدراسة التعبير مير 489 في المريض بسرطان الثدي. يظهر زوج واحد مريض تمثيل لنا هنا. شريط النطاق = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد مستوى التعبير ميرنا في أنسجة سرطان الثدي باستخدام ميرنا في الموقع التهجين. وتجدر الإشارة إلى أنه في هذه التجربة، وتحسين كل الظروف لأنسجة سرطان الثدي. قد تكون هناك حاجة مزيد من التحسين لأنواع الأنسجة الأخرى. ويجب بذل كل الحلول مع الماء DEPC ويجب أن تشطف بالماء DEPC المعالجة وتعقيمها بعد كل حاويات لاستخدامها. تلوث ريبونوكلياز طفيف حتى يمكن أن تتداخل مع النتيجة النهائية للتجربة. كما ميرنا هي سلسلة قصيرة جدا، فمن الضروري استخدام مسبار LNA لتسهيل التهجين أفضل مع الهدف. وعلاوة على ذلك، بعد تثبيت الأنسجة، والمعاملة مع ريبونوكلياز خالية من بروتين كاف أمر ضروري للغاية خلاف ذلك البروتينات قد تتداخل مع التهجين لجنة التحقيق مع ميرنا الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، قبل احتضان قسم الأنسجة مع لجنة التحقيق، يجب أن يغلى هذا الأخير إلى 95 ° C تتكشف أيالهياكل الثانوية.
بعد تفرخ بين عشية وضحاها، من المهم أن تغسل مع تركيزات SSC متفاوتة في درجة الحرارة المذكورة أعلاه في بروتوكول للحد ملزمة انوعي. لتطوير مضان، واحتضان قسم الأنسجة مع الركيزة لا يقل عن 1 ساعة. فإنه من المستحسن لمراقبة قسم أنحاء الحضانة حتى يمكن تجنب أن يتهدد. تأكد من تركيب الباب مع وسائل الإعلام تصاعد المتوفرة مع الطقم.
هناك عامل واحد الحد الذي ينبغي لأحد أن يأخذ في الاعتبار. إذا كان الهدف ميرنا التعبير هو أقل من ذلك في الأنسجة فإنه سوف يكون من الصعب الكشف عن التعبير عنها باستخدام هذه التقنية. ومن المستحسن دائما لتنفيذ هذا البروتوكول مع تحكم إيجابية مثل U6 حتى يمكن التأكد من هذه التقنية، وضمان جميع الكواشف للعمل وهم ريبونوكلياز مجانا.
ومن الممكن استخدام البيوتين المسمى التحقيق بدلا من DIG المسبار المسمى في حالة إشارة ضعيفةآل مع DIG المسمى التحقيق. إشارة التضخيم هو ممكن باستخدام نظام البيوتين أفيدين. أفيدين لديها قابلية قوية للالبيوتين. من خلال الاستفادة من هذا التقارب، فمن الممكن لوضع علامة البيوتين التحقيق مع الوجهين أفيدين البيوتين وهو يرفق مع الفوسفاتيز القلوية. باستخدام هذه الاستراتيجية، فمن الممكن لتضخيم إشارة لميرنا وفرة منخفضة أيضا.
مجال ميرنا في الظهور بسرعة، منذ miRNAs تلعب أدوارا حاسمة في العمليات الخلوية الأساسية وترتبط بقوة مع تطور مرض السرطان. وعلاوة على ذلك، فإن هذه miRNAs ويمكن أيضا أن تستخدم العلامات البيولوجية في تشخيص السرطان. وقد أشارت العديد من الدراسات وجود علاقة قوية بين التعبير ميرنا والمعلمات السريرية مثل مرحلة الورم مما يشير إلى إمكانية تطبيق التعبير ميرنا في تشخيص السرطان. هذه التقنية يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل التعبير ميرنا في أنواع السرطان الأخرى. على سبيل المثال، تم تحليل التعبير عن مير 182 ومير-503 في أنسجة المريض بسرطان القولون باستخدام في الاشتراكيةتو التهجين 15.
التقليدي تحليل التعبير الجيني يمكن أن تكشف عن مستوى التعبير ميرنا في الأنسجة ولكن لا يمكن أن تكشف عن الموقع الذي هيكل يجري أعرب ميرنا. باستخدام هذه التقنية، يمكن للمرء أن يجد بسهولة مستوى التعبير ميرنا وكذلك الموقع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
- Shah, N. R., Chen, H. MicroRNAs in pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis and treatment. World J Clin Oncol. 5, 48-60 (2014).
- Tang, H., et al. miR-185 suppresses tumor proliferation by directly targeting E2F6 and DNMT1 and indirectly upregulating BRCA1 in triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 13, 3185-3197 (2014).
- Ye, X. M., et al. Epigenetic silencing of miR-375 induces trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer by targeting IGF1R. BMC Cancer. 14, 134 (2014).
- Oneyama, C., et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene. 30, 3489-3501 (2011).
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer Metastasis Rev. 34, 145-155 (2015).
- Quesne, J. L., et al. Biological and prognostic associations of miR-205 and let-7b in breast cancer revealed by in situ hybridization analysis of micro-RNA expression in arrays of archival tumour tissue. J Pathol. 227, 306-314 (2012).
- Fernandez, S., et al. miR-340 inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis by targeting multiple negative regulators of p27 in non-small cell lung cancer. Oncogene. 34, 3240-3250 (2015).
- Yu, L., Zhang, J., Guo, X., Li, Z., Zhang, P. MicroRNA-224 upregulation and AKT activation synergistically predict poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. 38, 408-413 (2014).
- Li, J., et al. microRNA-146 up-regulation predicts the prognosis of non-small cell lung cancer by miRNA in situ hybridization. Exp Mol Pathol. 96, 195-199 (2014).
- Kriegel, A. J., Liang, M. MicroRNA in situ hybridization for formalin fixed kidney tissues. J Vis Exp. , e50785 (2013).
- Ucar, A., et al. miR-212 and miR-132 are required for epithelial stromal interactions necessary for mouse mammary gland development. Nat Genet. 42, 1101-1108 (2010).
- Nuovo, G. J. In situ detection of microRNAs in paraffin embedded, formalin fixed tissues and the co-localization of their putative targets. Methods. 52, 307-315 (2010).
- Kierzek, E., et al. The influence of locked nucleic acid residues on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 33, 5082-5093 (2005).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Li, L., et al. Sequential expression of miR-182 and miR-503 cooperatively targets FBXW7, contributing to the malignant transformation of colon adenoma to adenocarcinoma. J Pathol. 234, 488-501 (2014).
