Introduction
O cancro da mama é um dos tumores malignos mais comuns que afetam a população feminina em todo o mundo. Mais de 1,3 milhões de casos de câncer de mama são notificados a cada ano no mundo 1,2. Embora as células tumorais têm sido tradicionalmente considerados como biologicamente homogênea e altamente proliferativa, tornou-se evidente que o câncer de mama é geneticamente e clinicamente heterogênea. A resistência aos fármacos anticancerígenos prevalentes é uma característica de cancros da mama avançado, conduzindo à mortalidade na maioria dos pacientes através da sua promoção da progressão do cancro e metástases à distância 3.
MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenas moléculas de RNA de aproximadamente 22 nucleótidos de comprimento que regulam a expressão do gene através do bloqueio da tradução do mRNA ou mediar a degradação de ARNm 4. Mais de 2.000 miRNAs diferentes foram até agora identificados em humanos, que estão ligadas a doenças humanas 5. Uma crescente variedade de estudos have demonstraram que miARN pode funcionar como oncogenes e supressores tumorais e são frequentemente desreguladas em tumores 6. miARNs impacto fortemente toda a tumorigénese principal, controlando as principais reguladores da progressão do ciclo celular, senescência, apoptose e autofagia, juntamente com os da motilidade de células tumorais, invasão e metástase 7.
Expressão aberrante miRNA foi também associada a implicações clínicas, tais como estágio, diferenciação, prognóstico e resposta ao adjuvante terapia 8. Em particular, o aumento da expressão de miR-146 está correlacionada com mau prognóstico em pacientes com câncer de pulmão 9. Outro estudo demonstrou que a expressão perdida de miRNA-let7b está ligada a fenótipos malignas e, consequentemente, pior sobrevida 6. Compreender os tipos de células e estruturas que expressam miRNAs é uma parte importante de compreender os mecanismos através dos quais alterações nas células de expressão influência miRNA etecido fenótipos 10. Certos miARNs encontrado para ser segregado em células do estroma são tomadas por células epiteliais e, especificamente, agir sobre os seus objectivos. Na mesma linha, o miR-212 e miR-132 que são segregadas por estroma e regular as interacções epiteliais-estromal requeridas para crescimento ductal durante 11 desenvolvimento da glândula mamária. O objetivo geral deste trabalho é explicar um protocolo detalhado para detectar a expressão de miRNA em tecidos de cancro da mama através de miRNA hibridização in situ. Temos todas as condições optimizadas para ensaiar os níveis de expressão de miARN-489 em amostras de pacientes de cancro da mama. Para este fim, foi utilizado um DIG marcado bloqueado ácido sonda (LNA) nucleico em nosso experimento. Alguns dos seus nucleótidos tinha uma modificação LNA, que é, uma ponte metileno que liga 'átomo de oxigénio e 4' a 2 átomos de carbono do esqueleto ribose que fixa as sequências de nucleótidos de tal modo que ele fica "bloqueado no lugar" após a hibridização. Como resultado, é muito mais difícilpara o complexo hibridado para desnaturar 12,13.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital Chonnam National University Hwasun e University of South Carolina. amostras TMA compostas de câncer de mama e tecidos mamários normais adjacentes combinados foram fornecidos pelo Biobank de Chonnam National Hwasun Hospital Universitário, um membro da Coreia do Biobank rede.
1. Preparação de Soluções
- Prepare 1 litro de DNase e RNase água livre. Faça todas as soluções químicas usando dietilpirocarbonato (DEPC) água tratada. Tratar 1 L de água com 500 ul de DEPC e incubar durante 3 horas a temperatura ambiente. Autoclave a água para inactivar DEPC.
Cuidado: Não inalar DEPC, uma vez que é conhecido agente cancerígeno. - Prepare 1x PBS a partir de 10x PBS usando DEPC água tratada.
- Prepare 20x SSC (dissolver 175,3 g de NaCl e 88,2 g de citrato de sódio em 800 ml de água, ajustar o pH a 7,0 com algumas gota de 14 N solução de HCl e ajustar o volume a 1 litro com water), paraformaldeído a 4%, etanol a 95%, etanol a 80% usando água tratada com DEPC.
- Adicionar 8 mL de trietanolamina e 1,05 mL de HCl em 590 ml de água tratada com DEPC e adicionar 1,5 ml de anidrido acético para acetilação.
- Preparar 50 ug / mL de proteinase K em tampão (Tris-HCl a 50, pH 8,0 em água tratada com DEPC).
- Preparar tampão de hibridação constituída por 500 mL de formamida, 250 pL de 20x SSC, 100 ul de solução 50x de Denhardt, 12,5 ul de t-RNA, 2,5 ul de ADN de esperma de arenque, 30 ul de RVC, 0,02 g de reagente de bloqueio e 50 ul de água DEPC. Prepare fresco.
2. Os pontos tecido mamário
- Corte de 5 mm secções embebidas em parafina fixadas em formalina com micrótomo e aplicar a secção de cobrar slide 14.
Nota: O tecido da mama usada aqui foi previamente preparado a partir da Coreia do Biobank rede.
3. Preparação do Tecido
- Remova a parafina from o tecido por imersão em lâminas 2x frasco Coplin em xileno fresco durante 10 minutos cada e re-hidratar a secção de tecido por 5 min em incubações concentrações decrescentes de etanol (100%, 95% e 80%) em ddH 2 O. Execute esta etapa em um exaustor.
- Mergulha-se o tecido em água tratada com DEPC, durante 5 min. Nesta altura, levar limites em torno secção de tecido com a pena barreira hidrofóbica.
- Corrigir o tecido com PFA a 4% durante 15 min, seguido por uma lavagem com PBS.
- Mergulha-se o tecido em 0,3% de Triton X-100 / PBS durante 10 minutos seguido por uma lavagem com PBS.
- Incubar amostra com uma solução de / ul de proteinase K 50 ^ g durante 15 min a 37 ° C. Em seguida, incubar as secções de tecido com trietanolamina e anidrido acético durante 5 min à temperatura ambiente, seguido por uma lavagem com PBS. Sem lavagem com PBS é necessária entre o tratamento com proteinase K e / tratamento anidrido acético trietanolamina.
4. Hibridização
- Lavar o tecido completamente e incuBATE a secção de tecido com tampão de hibridação durante 2 a 3 horas à temperatura ambiente. Tipicamente 120 ul de tampão de hibridação é suficiente para cobrir a secção de tecido.
- Diluir 5'-DIG marcado com sonda LNA a concentração final de 3:00 em 120 ul de solução de hibridação. À medida que a concentração de estoque geralmente é de 40 ng / ul, adicionar 3 ul de estoque de tampão de hibridação de 120 ul e incubar mistura a 95 ° C durante 5 min.
- Incubar secção de tecido com pernoite sonda a 54 ° C (Tm) em câmara úmida. Normalmente 120 mL é suficiente para cobrir uma seção. Criar umidade usando duas toalhas de papel molhado. O tamanho ideal da câmara é de 10 polegadas por 8 polegadas.
- Nota: Tm pode ser diferente para diferentes miRNA. 54 ° C é de mencionar para miR-489.
5. lavagem rigorosa
- Lave o tecido com 5x SSC para 7 min (após o passo de hibridação, RNase condições livres não são mais necessários).
- Lave a sagacidade secção de tecidoh 1x SSC durante 7 min, duas vezes a 57 ° C.
- Lava-se a secção de tecido com SSC 0,2x durante 7 minutos a 57 ° C.
- Lava-se a secção de tecido com SSC 0,2x durante 7 min à temperatura ambiente.
- Incubar secção de tecido em PBS durante 10 min.
6. Bloqueio
- Incubar a secção de tecido com tampão de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 hora numa câmara húmida (Para fazer um tampão de bloqueio e juntar 2 ml de FBS, 10 ul de Tween-20 e 3 pi de BSA em 18 m de PBS. Loja tampão de bloqueio a 4 ° C).
7. Anticorpo primário Incubação e Desenvolvimento
- Diluir 1: anticorpo anti-DIG-AP 300 em tampão de bloqueio e incubar a secção de tecido com o anticorpo, a 4 ° C durante a noite.
- Lavar as seções com tampão de lavagem 3 vezes, durante 5 minutos cada (tampão fornecido pelo kit de desenvolvimento).
- Desenvolver a secção de tecido com um kit comercial para fosfatase alcalina que produz CY-3 luz fluorescente. <li> Lava-se a secção com tampão de lavagem durante 5 minutos. secção mancha com 100 ul de 2,5 ng / mL de corante Hoechst, durante 5 minutos, seguido de uma lavagem de 5 min com tampão de lavagem.
- Montar o tampão com secção de montagem de acordo com o protocolo do fabricante. Use 15 ul por secção de tecido e limpe solução de montagem excessiva com lenço de papel. Selar o slide com unhas polonês claro para evitar vazamentos.
- Observe o microscópio fluorescente seção usando com ampliação de 10x lente de modo total é de 100X.
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Representative Results
tecido do cancro da mama humano foi utilizado para determinar a expressão de miARN-489. Ducto da glândula mamaria e células epiteliais foram encontrados para expressar significativamente mais elevados de miARN-489 níveis que o tecido adjacente do tumor em dois pacientes (Figura 1A e 1B). Isto demonstra claramente que a expressão de miARN-489 foi perdido no tecido tumoral, sugerindo que a actividade supressora do tumor de miARN-489. Para confirmar ainda mais estes resultados, o tecido tumoral e tecido normal adjacente a partir do mesmo paciente foram comparados. Como pode ser observado na Figura 2A e 2B, o tecido normal foi encontrado para expressar mais de miARN-489 do que o seu tecido tumoral adjacente. 10 mm nas imagens indica barra de escala. As imagens foram tiradas usando lente de 10X.
Figura 1: Expressão de miR-489 no tecido mamário normal. Tanto as células tumorais estrutura adesiva e normais são exibidos na mesma secção. Os tecidos são de pacientes com câncer de mama diferentes. ducto mamário normal e glândula mamária expressar miRNA-489 estando ausente no tecido tumoral. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Expressão de miR-489 em paciente par o cancro da mama Uma micro matriz de tecido foi usado para estudar a expressão de miR-489 em um paciente com cancro da mama. Um paciente par representativo é mostrado aqui. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo deste estudo foi determinar o nível de expressão miRNA em tecidos de câncer de mama utilizando miRNA hibridização in situ. Deve ser notado que nesta experiência, todas as condições foram optimizadas para o tecido do cancro da mama. Optimização adicional pode ser necessário para outros tipos de tecidos. Todas as soluções deve ser feita com água com DEPC e todos os recipientes a ser usado deve ser lavado com água tratada com DEPC e subsequentemente autoclavadas. Mesmo fraca contaminação RNase pode interferir com o resultado final do experimento. Como miARN é uma sequência muito curto, é necessário o uso de uma sonda de LNA para facilitar uma melhor hibridação com o alvo. Além disso, após a fixação do tecido, o tratamento com RNase A proteinase K é absolutamente necessário caso contrário as proteínas podem interferir com a hibridação da sonda com o miARN endógeno. Além disso, antes da incubação da secção de tecido com a sonda, esta última deve ser fervida para 95 ° C para se desdobrar qualquerestruturas secundárias.
Após incubação durante a noite, é importante lavar com concentrações variáveis de SSC à temperatura acima mencionada no protocolo para reduzir a ligação não específica. Para o desenvolvimento de fluorescência, incubar secção de tecido com substrato durante pelo menos 1 h. É aconselhável para observar a secção ao longo da incubação desenvolvimento excessivo de modo a que possa ser evitada. Certifique-se de montar a seção com os meios de comunicação de montagem fornecidos com o kit.
Há um fator limitante que deve-se levar em consideração. Se a expressão miRNA-alvo é menor no tecido que vai ser difícil de detectar a sua expressão usando esta técnica. É sempre aconselhável realizar este protocolo com um controlo positivo, como U6 assim que a técnica pode ser confirmada e todos os reagentes são assegurados por estar trabalhando e eles são RNase livre.
É possível a utilização de uma sonda marcada, em vez de biotina DIG sonda marcada, em caso de sinal fracoal com DIG sonda marcada. amplificação do sinal é possível usando o sistema biotina-avidina. Avidina tem forte afinidade para a biotina. Ao aproveitar essa afinidade, é possível marcar sonda de biotina com duplex avidina-biotina que é anexar com fosfatase alcalina. Ao utilizar esta estratégia, é possível amplificar o sinal para baixo miRNA abundante também.
O campo de miRNA está emergindo rapidamente, uma vez que miRNAs desempenham papéis críticos em processos celulares importantes e estão fortemente ligados ao desenvolvimento do câncer. Além disso, estes miARNs também pode ser utilizado como biomarcador no diagnóstico do cancro. Vários estudos têm indicado uma forte correlação entre a expressão de miRNA e parâmetros clínicos tais como o estágio do tumor sugerindo a possibilidade de aplicação de expressão miRNA no prognóstico do câncer. Esta técnica também pode ser utilizada para análise de expressão de miARN em outros tipos de cancro. Por exemplo, a expressão de miR-182 e miR-503 foram analisadas em tecidos de pacientes com cancro do cólon usando em Sihibridação tu 15.
análise de expressão gênica tradicional pode revelar nível de expressão miRNA em tecidos mas não pode revelar a localização a partir do qual a estrutura miRNA está sendo expresso. Usando esta técnica, pode-se facilmente encontrar o nível de expressão de miRNA, bem como localização.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
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