Introduction
El cáncer de mama es una de las neoplasias más comunes que afectan a la población femenina en todo el mundo. Más de 1,3 millones de casos de cáncer de mama cada año se registran en todo el mundo 1,2. Aunque las células tumorales han sido tradicionalmente considerado como biológicamente homogénea y altamente proliferativas, se ha hecho evidente que el cáncer de mama es genéticamente y clínicamente heterogéneos. La resistencia a medicamentos contra el cáncer prevalentes es una característica de los cánceres de mama avanzados, que conduce a la mortalidad en la mayoría de los pacientes a través de su facilitación de la progresión del cáncer y la metástasis a distancia 3.
MicroARNs (miRNAs) son una clase de moléculas de ARN pequeñas de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que regulan la expresión génica mediante el bloqueo de la traducción del ARNm o la mediación de la degradación del ARNm 4. Más de 2.000 diferentes miRNAs Hasta ahora se han identificado en humanos, que están vinculados a enfermedades humanas 5. Un creciente gama de estudios VHAe demostró que los miRNAs pueden funcionar como oncogenes y supresores tumorales y son a menudo mal regulada en tumores 6. miRNAs afecta fuertemente la totalidad de la tumorigénesis primaria mediante el control de los principales reguladores de la progresión del ciclo celular, la senescencia, la apoptosis y la autofagia, junto con los de la motilidad de células tumorales, invasión y metástasis 7.
La expresión aberrante de los genes miARN se ha asociado también con implicaciones clínicas como la etapa, la diferenciación, el pronóstico y respuesta al tratamiento adyuvante 8. En particular, el aumento de expresión de miR-146 se correlaciona con mal pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón 9. Otro estudio ha demostrado que la expresión perdida de miARN-let7b está vinculada a fenotipos malignos y, en consecuencia, una baja supervivencia 6. La comprensión de los tipos de células y estructuras que expresan miRNAs es una parte importante de la comprensión de los mecanismos a través del cual las alteraciones en la célula de influir en la expresión de los genes miARN ytejido fenotipos 10. Ciertos miRNAs encontrado para ser secretada en las células del estroma se toman en por las células epiteliales y actúan específicamente sobre sus objetivos. En la misma línea, el miR-212 y miR-132 son secretadas por estroma y regulan las interacciones epitelio-estroma necesarios para derivación ductal durante el desarrollo de la glándula mamaria 11. El objetivo general de este trabajo es explicar un protocolo detallado para detectar la expresión de los genes miARN en tejidos de cáncer de mama a través de miRNA hibridación in situ. Hemos optimizado todas las condiciones para someter a ensayo los niveles de expresión de los genes miARN-489 en muestras de pacientes con cáncer de mama. Con este fin, se utilizó una DIG marcado bloqueado sonda de ácido nucleico (LNA) en nuestro experimento. Algunos de sus nucleótidos tenían una modificación LNA, es decir, un puente de metileno que conecta 'átomo de oxígeno y 4' de la 2 átomo de carbono del esqueleto de ribosa que fija el nucleótido de tal manera que permanece "bloqueado en su lugar" después de la hibridación. Como resultado, es mucho más difícilpara el complejo hibridado para desnaturalizar 12,13.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad Nacional de Chonnam Hwasun y la Universidad de Carolina del Sur. TMA muestras compuestas de cáncer de mama y tejidos de mama normales adyacentes emparejados fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Hwasun Chonnam Universidad Nacional, un miembro de la Red de Biobancos Corea.
1. Preparación de la solución
- Preparar 1 l de DNasa y RNasa libre de agua. Realiza todas las soluciones químicas mediante el uso de dietilo (DEPC) de agua tratada. Tratar 1 L de agua con 500 l de DEPC y se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente. Autoclave el agua para inactivar DEPC.
Precaución: No se requieren medidas DEPC ya que es conocido carcinógeno. - Preparar 1x PBS 10x de PBS utilizando agua tratada con DEPC.
- Preparar 20x SSC (disolver 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio en 800 ml de agua, ajustar el pH a 7,0 con unas pocas gota de 14 N solución de HCl y ajustar el volumen a 1 L con water), 4% de paraformaldehído, 95% de etanol, 80% de etanol con agua tratada con DEPC.
- Añadir 8 ml de trietanolamina y 1,05 ml de HCl en 590 ml de agua tratada con DEPC y añadir 1,5 ml de anhídrido acético para la acetilación.
- Preparar 50 g / l de proteinasa K en tampón (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 en DEPC agua tratada).
- Preparar tampón de hibridación compuesto por 500 l de formamida, 250 l de 20x SSC, 100 l de 50x solución de Denhardt, 12,5 l de t-RNA, 2.5 l de ADN de esperma de arenque, 30 l de RVC, 0,02 g de reactivo de bloqueo y 50 l de agua DEPC. Preparar fresco.
2. Las secciones de tejido de mama
- Cortar 5 micras secciones incluidas en parafina fijadas con formalina con microtomo y aplicar la sección 14 para cargar diapositivas.
Nota: El tejido mamario se utiliza aquí se preparó previamente de la Red de Biobancos Corea.
3. Preparación del tejido
- Retire la parafina lado a otrom el tejido mediante la inmersión de diapositivas en 2x jarra Coplin en xileno fresco durante 10 minutos cada uno y rehidratar la sección de tejido por incubaciones de 5 min en concentraciones decrecientes de etanol (100%, 95% y 80%) en ddH 2 O. Realice este paso en una campana de humos.
- Sumergir el tejido en DEPC agua tratada durante 5 min. En este punto completar límites en torno sección de tejido con la pluma barrera hidrofóbica.
- Fijar el tejido con 4% PFA durante 15 min seguido de un lavado con PBS.
- Sumergir el tejido en 0,3% de Triton X-100 / PBS durante 10 min seguido de un lavado con PBS.
- Incubar la muestra con una solución / l de proteinasa K 50 mg durante 15 minutos a 37 ° C. A continuación incubar las secciones de tejido con trietanolamina y anhídrido acético durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de un lavado con PBS. No se requiere un lavado con PBS entre el tratamiento con proteinasa K y / anhídrido acético tratamiento trietanolamina.
4. La hibridación
- Lavar el tejido a fondo y incubate la sección de tejido con tampón de hibridación para 2-3 horas a temperatura ambiente. Típicamente 120 l de tampón de hibridación es suficiente para cubrir la sección de tejido.
- Diluir 5'-DIG sonda marcada LNA a la concentración final de 3 horas, en la solución de hibridación 120 l. A medida que la concentración de reserva por lo general es de 40 ng / l, añadir 3 l de tampón de hibridación de valores para 120 l e incubar la mezcla a 95 ° C durante 5 min.
- Incubar sección de tejido durante la noche con la sonda a 54 ° C (Tm) en una cámara húmeda. Típicamente 120 l es suficiente para cubrir una sección. Crear humedad mediante el uso de dos toallas de papel húmedo. El tamaño ideal de la cámara es de 10 pulgadas por 8 pulgadas.
- Nota: Tm puede ser diferente para diferentes miARN. 54 ° C es la mención de miR-489.
5. rigurosidad de lavado
- Lavar el tejido con 5 x SSC durante 7 minutos (después de la etapa de hibridación, RNasa condiciones libres ya no son necesarios).
- Lavar la sección de tejido ingenioh 1x SSC durante 7 minutos dos veces a 57 ° C.
- Lavar la sección de tejido con 0,2 x SSC durante 7 minutos a 57 ° C.
- Lavar la sección de tejido con 0,2 x SSC durante 7 minutos a temperatura ambiente.
- sección de tejido en PBS en incubación durante 10 min.
6. Bloqueo
- Incubar la sección de tejido con tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hr en una cámara húmeda (Para hacer el amortiguador de bloqueo añadir 2 ml de FBS, 10 l de Tween-20 y 3 l de BSA en 18 m de PBS. Tienda tampón de bloqueo a 4 DO).
7. Anticuerpo primario Incubación y Desarrollo
- Diluir 1: 300 de anticuerpo anti-DIG-AP en tampón de bloqueo y se incuba la sección de tejido con el anticuerpo a 4 ° C durante la noche.
- Se lavan las secciones con tampón de lavado 3 veces, durante 5 minutos cada uno (tampón proporcionado por el kit de desarrollo).
- Desarrollar la sección de tejido con un kit comercial para la fosfatasa alcalina que produce CY-3 luz fluorescente. <li> Lavar la sección con tampón de lavado durante 5 min. sección de la mancha con 100 l de 2,5 ng l de colorante / Hoechst durante 5 min seguido de un lavado de 5 min con tampón de lavado.
- Montar la sección con tampón de montaje de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilice 15 l por sección de tejido y limpie solución de montaje con el tejido excesivo limpie. Sellar la diapositiva con esmalte de uñas transparente para evitar fugas.
- Observar al microscopio fluorescente usando la sección con un aumento de 10X lente de modo total es de 100X.
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Representative Results
Se utilizó el tejido de cáncer de mama humano para determinar la expresión de miRNA-489. Se encontraron conducto de la glándula mamaria y las células epiteliales de expresar significativamente más altos miARN-489 niveles que el tejido adyacente tumor en dos pacientes (Figura 1A y 1B). Esto demuestra claramente que la expresión de miRNA-489 se ha perdido en el tejido tumoral, lo que sugiere una actividad supresora de tumores de miARN-489. Para confirmar aún más estos resultados, el tejido tumoral y el tejido normal adyacente del mismo paciente se compararon. Como se observa en la Figura 2A y 2B, se encontró que el tejido normal de expresar más miRNA-489 que su tejido tumoral adyacente. 10 micras de las imágenes indica la barra de escala. Las imágenes fueron tomadas mediante el uso de lentes de 10X.
Figura 1: La expresión de miR-489 en el tejido mamario normal. Tanto las células tumorales y la estructura de conducción normales se muestran en la misma sección. Los tejidos son de diferentes pacientes de cáncer de mama. Conductos mamarios normales y glándulas mamarias expresan los genes miARN-489, mientras ausente en el tejido tumoral. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. La expresión de miR-489 en el par de Pacientes con Cáncer de mama Un micro matriz de tejido se utilizó para estudiar la expresión de miR-489 en un paciente con cáncer de mama. Un par paciente representativo se muestra aquí. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El objetivo de este estudio fue determinar el nivel de expresión de los genes miARN en los tejidos de cáncer de mama utilizando miARN hibridación in situ. Hay que señalar que en este experimento, todas las condiciones se optimizaron para el tejido de cáncer de mama. Una optimización adicional puede ser necesario para otros tipos de tejidos. Todas las soluciones deben hacerse con agua DEPC y todos los contenedores que se utilicen deben ser enjuagados con agua tratada con DEPC y posteriormente en autoclave. Incluso una ligera contaminación RNasa puede interferir con el resultado final del experimento. Como miARN es una secuencia muy corta, es necesario el uso de una sonda de LNA para facilitar mejor la hibridación con la diana. Además, después de la fijación del tejido, el tratamiento con RNasa libre de la proteinasa K es absolutamente necesario de otro modo las proteínas pueden interferir con la hibridación de la sonda con la endógeno miRNA. Además, antes de la incubación de la sección de tejido con la sonda, esta última debe ser hervida a 95 ° C a desplegarse cualquierestructuras secundarias.
Después de incubar durante la noche, es importante lavar con diferentes concentraciones de SSC a la temperatura mencionada anteriormente en el protocolo para reducir la unión no específica. Para el desarrollo de la fluorescencia, incubar sección de tejido con el sustrato durante al menos 1 hr. Es conveniente observar la sección a lo largo de la incubación de manera que el desarrollo excesivo se puede evitar. Asegúrese de montar la sección con los medios de montaje suministrados con el kit.
Hay un factor limitante que uno debe tomar en consideración. Si el objetivo miARN expresión es menor en el tejido que va a ser difícil de detectar su expresión usando esta técnica. Siempre es recomendable realizar este protocolo con un control positivo como U6 lo que la técnica puede ser confirmada y todos los reactivos se aseguran estar trabajando y que son libres de RNasa.
Es posible utilizar una sonda marcada con biotina en lugar de sonda marcada con DIG en caso de señal débilal con DIG sonda marcada. la amplificación de la señal es posible mediante el uso de sistema de biotina-avidina. La avidina tiene una fuerte afinidad por la biotina. Al tomar ventaja de esta afinidad, es posible etiquetar sonda de biotina con avidina-biotina duplex que es adjuntar con fosfatasa alcalina. Mediante el uso de esta estrategia, es posible amplificar la señal de bajo miRNA abundante también.
El campo de miARN está emergiendo rápidamente, ya que los miRNAs juegan un papel crítico en los procesos celulares fundamentales y están fuertemente vinculados con el desarrollo del cáncer. Además, estos miRNAs también se pueden utilizar como biomarcadores en el diagnóstico de cáncer. Varios estudios han indicado una fuerte correlación entre la expresión de los genes miARN y los parámetros clínicos tales como el estadio del tumor sugiere la posible aplicación de la miARN expresión en el pronóstico del cáncer. Esta técnica también se puede utilizar para el análisis de expresión de los genes miARN en otros tipos de cáncer. Por ejemplo, la expresión de miR-182 y miR-503 se analizó en los tejidos de pacientes con cáncer de colon usando en SIma hibridación de 15.
análisis de expresión génica tradicional puede revelar el nivel de expresión de los genes miARN en el tejido, pero no puede revelar la ubicación desde la que la estructura está siendo expresada miARN. Mediante el uso de esta técnica, se puede encontrar fácilmente el nivel de expresión de los genes miARN, así como la ubicación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
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