Protocol
لا تعتبر أجنة الطيور الحيوانات الفقارية بموجب لوائح IUCAC.
1. الحصول على أجنة لجراحة
- احتضان 80-90 المخصبة بيض الدجاج Bovan (حادة في نهاية المطاف) في ترطيب (60٪) الروك حاضنة عند 40 درجة مئوية لمدة حوالي 72 ساعة للحصول على الأجنة في هاملتون وهمبرغر (سمو) المرحلة 17. تحديد العدد الدقيق للبيض على أساس تحليل القوة ومعدل البقاء على قيد الحياة من أجنة 17. استخدام أطباق البيض من البلاستيك للحضانة للسماح للدوران الهواء الكافي.
- بمجرد بلوغها هذه المرحلة التنموية المرجوة، صب حوالي 20 مل من الحارة (37 درجة مئوية) عازلة تايرود (تستكمل مع بيكربونات الصوديوم (1 جم / لتر)) إلى 100 ملم × 26 ملم طبق بتري.
- تعقيم قشرة البيضة مع 70٪ من الإيثانول.
- الكراك بلطف وعاء مع مقبض مشرط والافراج بعناية محتوياته في صحن يحتوي عازلة تايرود. تجاهل الأجنة إذا (ط) تظهر بصريا غير طبيعي (ب) هملا في هذه المرحلة التنموية الصحيح (iii) أنهم غير صحيح الموجهة على صفار البيض و / أو (د) يحدث أي نزيف. الاحتفاظ بأي الأجنة لا تخضع لعملية جراحية على الفور بعد أن وضعت البيضة السابقين عند 40 درجة مئوية وذلك لعدم تقديم تنازلات التنمية.
يتم تنفيذ التدريج بناء على هاميلتون وهمبرغر 18: مذكرة. يتم تحديد خلل في افراخ الدجاج بالعين المجردة وتحت نطاق تشريح. تأكد من أن الجنين قد لطي المناسب والانحناء والأوعية الدموية.
2. أفت التطويق
- ينتف من الفردية المواضيع من 1 سم طويلة من خياطة الجراحية 11/0 النايلون واحدة وتشكيل عقدة فضفاضة. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم كل عقدة مسبقة التشكيل.
- تحت المجهر تشريح، بصريا ضمان أن القلب ينبض بمعدل طبيعي (~ 120 نبضة / دقيقة). إذا لم يكن كذلك، تجاهل الجنين.
- قبل الجراحة، وتطبيق 5-6 مل من الحارة (37 درجة مئوية) عازلة تايرود على سطح الجنين باستخدام ماصة نقل.
- تمر نهاية واحدة خالية من عقدة متشكلة في إطار التجارة المشروعة، ضع خياطة في أفت / البطين تقاطع (OVJ) (أو الموقع المطلوب)، وتمرير نهاية خالية في عقدة وبالتالي تضييق على التجارة المشروعة بما في ذلك الأغشية المحيطة القلب.
- بعد الجراحة، والرطب على سطح الصفار مع 5-6 مل من الحارة (37 درجة مئوية) عازلة تايرود باستخدام ماصة نقل.
- الحفاظ على الأجنة السيطرة البيضة السابقين كما الأجنة النطاقات. ولكن لا إخضاعها لعملية جراحية.
- احتضان الأجنة، على المبلغ المطلوب من الوقت، عند 40 درجة مئوية في (60٪) حاضنة مرطب.
- مرة واحدة يتم الوصول إلى نقطة الوقت المطلوب، استئصال الجنين من صفار البيض باستخدام المقص مباشرة. تشريح القلب مع ملقط غرامة واستخدامها في العديد من الدراسات المصب مثل التغييرات في مورفولوجية القلب بسبب ديناميكا الدم تغير 17.
3. التأكيد على أن التدخل التطويق يؤدي إلى تغيير في ديناميكا الدم
ملاحظة: انقباض الجزئي الناجم عن التدخل النطاقات يؤدي إلى زيادة في سرعة تدفق الدم في OVJ. ويتم تقييم هذه المعلمة الدورة الدموية مريح باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية 2D، والتي تتم في نقطة زمنية المرجوة من التجربة.
- منذ إلا جنين واحد يمكن تصويرها في وقت، والحفاظ على جميع الأجنة أخرى من أجل التصوير بالموجات فوق الصوتية في 40 درجة مئوية الحاضنة.
- وضع طبق بتري تحتوي على الجنين يمكن تصوير على وسادة التدفئة وضعت في 40 درجة مئوية.
- ملء الطبق، حتى أسنانها، مع دافئ (37 درجة مئوية) عازلة تايرود. ببطء من أجل حل العازلة في طبق وذلك للحفاظ على صفار سليمة. ولكن، إذا هو خطر على سلامة صفار خلال هذه الخطوة، ونبذ الجنين.
- الشرق الجنين مثل أن المحور المركزي للجنين هو عمودي على مسبار الموجات فوق الصوتية التي علقت من موقف قابل للتعديل.
- مع أوبرا جهاز الموجات فوق الصوتيةتينغ في B-واسطة، والحصول على صورة 2D من قلب ينبض على الشاشة وتحريك مرحلة (لوحة التدفئة) مثل أن التجارة المشروعة، البطين وOVJ واضحة للعيان.
- التبديل إلى الوضع في نابض الموجة (PW)، في وتيرة تكرار النبض المطلوب (على سبيل المثال، 20 كيلو هرتز) والحصول على بيانات سرعة بالضبط في OVJ. يتم الحصول على صورة B-طريقة القلب النابض على الشاشة.
- نقل مرحلة لرؤية مكتب التجارة المشروعة، البطين وOVJ. باستخدام برنامج جهاز الموجات فوق الصوتية، الحصول على قياسات السرعة بالضبط في OVJ.
ملاحظة: إذا كان معدل ضربات القلب للجنين ينخفض أثناء التصوير، لا ينبغي أن تستخدم بيانات السرعة وبالتالي الحصول على لتحليلها. جميع الأجنة المستخدمة لقياس السرعة ويفضل عدم استخدام أية تجارب أخرى بعد التصوير بالموجات فوق الصوتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هو مبين في الشكل 1 ينصح الأدوات اللازمة لالنطاقات التجارة المشروعة. طبق بتري (الشكل 1A) التي تحتوي على جنين البيضة السابقين يجب أن تكون عميقة بما فيه الكفاية حتى لا يدمر الجنين عند تغطيتها مع الغطاء. وينبغي أيضا أطباق بتري عميقة (الشكل 1C) يمكن أن تستخدم للتصوير بالموجات فوق الصوتية للسماح ليتم سكب على حجم كاف من العازلة تايرود فوق صفار البيض.
وtweezed وحيد 1 موضوع سم (الشكل 2A) من من 11/0 النايلون خياطة (الشكل 1A) وتعادل في عقدة فضفاضة (الشكل 1B). والأشعة فوق البنفسجية تعقيم كل عقدة مسبقة التشكيل. ويبين الشكل 3A غرفة الروك ترطيب حيث يتم تحضين بيض الدجاج المخصب حتى المرحلة المطلوبة. ويبين الشكل 3B حاضنة الجنين، حيث تجمعت وتتم المحافظة على الأجنة السيطرة البيضة السابقين
هو مبين في الشكل 4A هو الجنين HH17 على الجزء العلوي من صفار البيضة السابقين. الشكل 4B هو تمثيل تخطيطي يبين موقف خياطة (عصابة) في OVJ من الجنين HH17. الشكل 4C هو صورة ممثل من جنين النطاقات تصوير 48 ساعة بعد الجراحة.
يتم قياس أثر التدخل النطاقات على سرعة تدفق الدم من خلال الموقع انقباض بواسطة التصوير بالموجات فوق الصوتية 2D. كما هو متوقع، والسرعة في OVJ أعلى في جنين النطاقات نسبة إلى التحكم (الشكل 5). لقد قمنا مؤخرا ديناميات الموائع (CFD) التحليل الحسابي على قلوب النطاقات والتحكم في نقطة زمنية 24 ساعة تظهر آثار النطاقات أفت على سرعة تدفق الدم وجدار القص الإجهاد 17.
<الطبقة ص = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 1. الأدوات الجراحية. (A) 11/0 النايلون خياطة. (ب) لوحة بتري تحتوي على عقدة ما قبل تشكيلها. (C) طبق بتري العميق للثقافة جنين البيضة السابقين والتصوير بالموجات فوق الصوتية. (د) نقل ماصة. (E) مشرط التعامل للقضاء على قشرة البيضة. (F) مقص مستقيم لاستئصال جنين للدراسات ما بعد الجراحة. (G) ملقط غرامة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. خياطة لأفت التطويق. (A) tweezed وحيد موضوع 1 سم الخروج من خياطة.
الرقم 3. الحضانة الدوائر. (A) ترطيب حاضنة الروك لالبويضات المخصبة. (ب) غرفة ترطيب لالبيضة السابقين الثقافة من الأجنة النطاقات والسيطرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. أفت التطويق. (أ) الحفاظ على كامل HH17 كتكوت الجنين البيضة السابقين، شريط النطاق = 10 ملم (ب) تمثيل تخطيطي يصور انقباضموقع (أحمر). (C) طوق الجنين تصوير 48 ساعة بعد النطاقات التجارة المشروعة، شريط النطاق = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. الموجات فوق الصوتية مشتقة قياسات سرعة. محات التمثيلية سرعة السيطرة (A) و (B) تجمعت الأجنة التي تم الحصول عليها في نقطة زمنية 1 ساعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الأسلوب هو سريعة وسهلة نسبيا لأداء، تحتاج إلى أن تبقى في الذهن ذلك للحصول على نتائج دقيقة المصب لكن بعض النقاط الرئيسية. ينبغي الحفاظ على الأجنة البيضة السابقين في طبق بتري الذي يحتوي عازلة تايرود لتوفير الإماهة كافية. ومن المهم أيضا لترطيب صفار البيض بعد الجراحة مع العازلة تايرود وللتأكد من رطب غرفة الحضانة بشكل كاف. لا ينبغي أن يؤديها العمليات الجراحية على الجنين إذا أي نزيف غير مرئية أو يتم تقسيم صفار ولو قليلا. وهذا يؤثر على بقاء الجنين، وخاصة بالنسبة للتجارب طويلة الأمد. سبب آخر محتمل من الفتك إلى الأجنة، هو ما إذا كان النطاق في جميع أنحاء أفت ضيقة جدا عند تطبيقها أولا، وبالتالي المساس كبير في وظيفة القلب.
في الوقت الحاضر، ونحن نستخدم الموجات فوق الصوتية كأداة تأكيدية لتحديد التغير في سرعة تدفق الدم على النطاقات التجارة المشروعة. في المستقبل، ونحن نؤكد باستخدام التصوير المقطعي المحسوبة الدقيقة (CT). نحن أيضا بصريا تحديد ضيق النطاق حول التجارة المشروعة في B-وضع الصور 2D. الأهم من ذلك، لوحظ عدم وجود اختلافات في معدل ضربات القلب وتدفق الحجمي (تم حسابها باستخدام CFD) بين الأجنة في مجموعة النطاقات والسيطرة 17. تشير هذه أن علم وظائف الأعضاء من الجهاز القلبي الوعائي لن يتم التهاون في الأجنة النطاقات، وبالتالي زيادة التحقق من صحة تدخل النطاقات.
في نقطة الوقت المطلوب، بعد النطاقات، لا يمكن أن يؤديها عدة تحليلات لفهم تأثير ديناميكا تغيير في العمليات التنموية صمام حرجة. وتشمل هذه، ولكن ليس على سبيل الحصر، تحديد التغيرات في مستويات النص من الجينات التنظيمية الرئيسية المشاركة في تطوير صمام، وتحديد توطين مكونات ECM وتحديد التركيب الدقيق للأفت.
وأخيرا، ويحسن هذا الأسلوب على الطريقة الحالية لالنطاقات التجارة المشروعة في الجنين داخل البيضة إطارات 19. هذا الأسلوب شديدأعاق لاي من عدم القدرة على جمع الأجنة اللازمة للقيام التحليلات الجزيئية المصب. هذه التقنية الجديدة يمكن استخدامها في تجارب الانقاذ كذلك. يسمح هذا التطبيق للالنطاقات أفت لانقاذهم وسمح الجنين للتعافي من الإهانة. لا توجد طريقة الحالي يمكن أن تفعل هذا ولا يزال قادرا على إجراء تحليلات المصب ذات دلالة إحصائية.
ونحن قد استخدمت بنجاح هذه التقنية لتغيير المحفزات الدورة الدموية في القلب من افراخ الدجاج في مرحلة النمو المبكر جدا (HH 16-17). بروتوكول النطاقات قد تمثل تحديا عند إجراء عملية جراحية في مراحل لاحقة من التطور نظرا لخطر الخدش أي من الأوعية الدموية خارج الجنين. أيضا، في المراحل المتأخرة من التنمية، غالبا ما يكون من الصعب للحفاظ على الكيس المحي سليمة عندما يتم نقل محتويات البيض في طبق بتري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
