Protocol
Avian embryoner betragtes ikke hvirveldyr under IUCAC forordninger.
1. Indhentning Embryoner til Kirurgi
- Inkuber 80 - 90 befrugtede Bovan hønseæg (stump ende op) i en befugtet (60%) rocker inkubator ved 40 ° C i ca. 72 timer for at opnå embryoner på Hamilton og Hamburger (HH) stadie 17. Bestem nøjagtige antal æg baseret på power analyse og overlevelse af embryoner 17. Brug plast æggebakker til inkubation for at tillade tilstrækkelig luftcirkulation.
- Når dette ønskede udviklingstrin er nået, påfyldes ca. 20 ml varm (37 ° C) Tyrodes puffer (suppleret med natriumbicarbonat (1 g / l)) i en 100 mm x 26 mm petriskål.
- Sterilisere en æggeskal med 70% ethanol.
- crack forsigtigt skallen med en skalpel håndtag og slip omhyggeligt dens indhold i skålen indeholdende Tyrodes puffer. Kassér embryoner hvis (i) de visuelt synes unormale (ii) deikke på det rigtige udviklingsstadiet (iii) de er forkert orienteret om blommen og / eller (iv) enhver blødning. Behold eventuelle embryoner, der ikke udsættes for kirurgi umiddelbart efter placeret ex ovo ved 40 ° C for at ikke gå på kompromis udvikling.
Bemærk: Iscenesættelse udføres baseret på Hamilton og Hamburger 18. Abnormitet i kyllingeembryoner er bestemt af det blotte øje og under dissektion anvendelsesområde. Sørg for, at fosteret har passende foldning og bøjning og kar.
2. OFT Banding
- Tweeze individuelle 1 cm lange tråde fra en enkelt 11/0 nylon kirurgisk sutur og danne en løs knude. UV sterilisere alle foruddannede knob.
- Under en dissektion mikroskop, visuelt sikre, at hjertet slår på en normal sats (~ 120 slag / min). Hvis ikke, kasseres embryoet.
- Lige før operation, anvende 5 - 6 ml varmt (37 ° C) Tyrodes puffer til embryo overfladen med en overførsel pipette.
- Pass ene frie ende af den i forvejen dannede knude under OFT, placere sutur på OFT / ventrikel krydset (OVJ) (eller ønskede placering), og videregive den frie ende ind i knuden derved snærende OFT herunder membraner, der omgiver hjertet.
- Efter operationen, befugte overfladen af æggeblomme med 5 - 6 ml varmt (37 ° C) Tyrodes puffer under anvendelse af en overførsel pipette.
- Bevare kontrollen embryoner ex ovo som stribede embryoner; dog ikke underkaste dem den kirurgiske procedure.
- Inkubér embryonerne, for den ønskede mængde af tid, ved 40 ° C i en fugtig (60%) inkubator.
- Når den ønskede tid er nået, udskære embryonet fra blommen hjælp lige saks. Skær hjertet med fine pincet og bruge flere downstream undersøgelser såsom ændringer i hjerte-morfologi på grund af ændret hæmodynamik 17.
3. Bekræftelse at Banding Intervention medfører en ændring i Hæmodynamik
Bemærk: Den delvise konstriktion forårsaget af banding indgriben fører til en stigning i blodets strømningshastighed på OVJ. Denne hæmodynamiske parameter er bekvemt bedømmes ved hjælp af 2D ultralydbilleddannelse, som udføres på det ønskede tidspunkt af eksperimentet.
- Eftersom kun en enkelt embryon kan afbildes på et tidspunkt, vedligeholde alle andre embryoner udpeget til ultralydbilleddannelse i en 40 ° C inkubator.
- Anbring petriskål indeholdende embryonet, der skal afbildes på en varmepude til 40 ° C.
- Fyld skålen, indtil det øverste, med varmt (37 ° C) Tyrodes puffer. Hæld langsomt pufferopløsningen i skålen for at holde æggeblommen intakt. Men hvis integriteten af blommen kompromitteres under dette trin, kasseres embryoet.
- Orient embryonet, således at den centrale akse af embryoet er vinkelret på ultralydsonden som er ophængt fra en justerbar stativ.
- Med ultralyd maskine operaTing i B-tilstand, få et 2D-billede af det bankende hjerte på skærmen, og flyt den fase (varmepude), således at OFT, ventrikel og OVJ er klart synlige.
- Skift til det pulserende-Wave (PW) mode, ved den ønskede pulsrepetitionsfrekvens (f.eks 20 kHz) og få hastighedsdata præcis på OVJ. En B-mode foto af det bankende hjerte opnås på skærmen.
- Flyt scenen for at se OFT, ventrikel og OVJ. Brug af ultralyd maskine software, få hastighedsmålinger nøjagtigt ved OVJ.
Bemærk: Hvis pulsen af et embryo falder under billeddannelse, bør således opnåede hastighedsdata ikke anvendes til analyse. Alle embryoner til hastighedsmålinger skal helst ikke bruges til andre eksperimenter efter ultralydsscanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vist i figur 1 anbefales nødvendige instrumenter for OFT banding. Petriskålen (figur 1A) indeholdende embryonet ex ovo bør være dyb nok til at ikke ødelægge embryonet når dækket med låget. Dybe petriskåle (figur 1C), bør også anvendes til ultralydbilleddannelse for at tillade en tilstrækkelig mængde af Tyrodes puffer, der skal hældes på toppen af blommen.
En enkelt 1 cm tråd (figur 2A) er tweezed ud fra en 11/0 nylon sutur (figur 1A) og bundet til en løs knude (figur 1B). Alle prædannede knob er UV steriliseret. Figur 3A viser en befugtet rocker kammer, hvor befrugtede hønseæg inkuberes, indtil den ønskede fase. Figur 3B viser et foster inkubator, hvor banded og kontrol embryoer opretholdes ex ovo
Vist i figur 4A er en HH17 embryo oven af blommen ex ovo. Figur 4B er en skematisk fremstilling, der viser positionen af suturen (bånd) ved OVJ af en HH17 embryo. Figur 4C er et repræsentativt billede af en banded embryo afbildes 48 timer efter operationen.
Virkningen af banding intervention blodgennemstrømningen hastighed gennem indsnævringen stedet måles ved 2D ultralydbilleddannelse. Som forventet, den hastighed ved OVJ er højere i banded embryo forhold til kontrollen (figur 5). Vi har for nylig udført Computational Fluid Dynamics (CFD) analyse på stribede og kontrol hjerter på 24 hr tidspunkt viser virkningerne af OFT banding på blod strømningshastighed og væg forskydningsspænding 17.
<p class = "jove_content" fo: holde-together.within-side = "1">
Figur 1. kirurgiske instrumenter. (A) 11/0 nylon sutur. (B) Petri plade indeholdende præfabrikerede dele knob. (C) Deep petriskål for ex ovo embryo kultur og ultralydsscanning. (D) Transfer pipette. (E) skalpel håndtag at knække æggeskallen. (F) Lige sakse til embryo excision for post-kirurgiske undersøgelser. (G) Fin pincet klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Sutur for OFT Banding. (A) En enkelt 1 cm tråd tweezed ud fra en sutur.
Figur 3. Inkubation Chambers. (A) Befugtet rocker inkubator for befrugtede æg. (B) Befugtet kammer til ex ovo kultur af stribede og kontrol embryoer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. OFT Banding. (A) Whole HH17 chick embryo opretholdt ex ovo, skala bar = 10 mm (B) Skematisk afbildning, der viser indsnævringenwebsted (rød). (C) Banded embryo afbildet 48 timer efter OFT banding, skala bar = 0,5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Ultralyd-afledte hastighedsmålinger. Repræsentant hastighedsprofiler af (A) kontrol og (B) banded embryoner opnået ved en 1 hr tidspunkt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknik er forholdsvis hurtig og let at udføre, skal holdes for øje, så for at få nøjagtige downstream resultater dog visse centrale punkter. Embryoner bør opretholdes ex ovo i en petriskål, der indeholder Tyrodes puffer til at yde passende rehydrering. Det er også vigtigt at fugte blommen post-kirurgi med Tyrodes buffer og for at sikre, inkubation kammer er tilstrækkeligt hydreret. Kirurgiske indgreb bør ikke udføres på et foster, hvis nogen blødning er synlige eller blommen er endda lidt brudt. Dette påvirker embryo overlevelse, især for langsigtede eksperimenter. En anden mulig årsag til dødelighed til embryoner, er, om bånd omkring OFT er for stram, når først anvendes, dermed væsentligt kompromittere hjertefunktion.
I øjeblikket bruger vi ultralyd som en bekræftende redskab til at bestemme ændringen i blodgennemstrømningen hastighed på OFT banding. I fremtiden vil vi bekræfte at bruge mikro-computertomografi (CT). Vi har også visuelt bestemme bandet tæthed omkring OFT i B-mode 2D-billeder. Vigtigere, er ikke observeret nogen forskel i hjertefrekvens og volumenstrøm (beregnet ved hjælp af CFD) mellem embryoner i de stribede og kontrolgrupper 17. Disse viser, at fysiologi af det kardiovaskulære system ikke er kompromitteret i stribeområderne embryoer, hvilket yderligere validering af banding intervention.
Ved det ønskede tidspunkt, efter banding, flere analyser kan udføres for at forstå virkningen af ændrede hæmodynamik på kritiske ventil udviklingsprocesser. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, bestemmelse af ændringer i transkriptniveauer af vigtige regulatoriske gener involveret i ventilen udvikling, bestemme lokalisering af ECM komponenter og bestemmelse ultrastruktur OFT.
Endelig er denne teknik forbedrer den nuværende metode til banding OFT i foster inde i windowed æg 19. Denne metode er sværly hæmmet af den manglende evne til at akkumulere nødvendige embryoer at gøre nedstrøms molekylære analyser. Denne nye teknik kan anvendes i redningsforsøg samt. Dette program giver mulighed for banded OFT at blive reddet og embryo lov til at komme fra fornærmelse. Ingen nuværende metode kan gøre dette og stadig være i stand til at udføre statistisk signifikante downstream analyser.
Vi har med succes anvendt denne teknik til at ændre de hæmodynamiske stimuli i hjertet af kyllingefostre på et meget tidligt udviklingsstadie (HH 16 - 17). Den banding-protokollen kan udgøre en udfordring, når du udfører operationen på senere stadier af udvikling på grund af risikoen for hakket nogen af de extraembryonic blodkar. Også i sene stadier af udvikling, er det ofte vanskeligt at holde blommesækken intakte, når ægindholdet overføres til petriskålen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
