Protocol
Avian embryoer regnes ikke virveldyr henhold IUCAC forskrifter.
1. Innhenting av embryoer for kirurgi
- Inkuber 80 - 90 befruktede Bovan kylling egg (butt ende opp) i en fuktet (60%) rocker inkubator ved 40 ° C i ca 72 timer å få embryoer på Hamilton og Hamburger (HH) stadium 17. Bestem eksakt antall egg basert på maktanalyse og overlevelse av embryo 17. Bruk plast egg skuffer for inkubasjon å gi tilstrekkelig luftsirkulasjon.
- Når dette ønskede utviklingsstadiet er nådd, helle omtrent 20 ml varm (37 ° C) Tyrodes buffer (supplert med natriumbikarbonat (1 g / l)) i en 100 mm x 26 mm petriskål.
- Steriliser et egg skall med 70% etanol.
- Forsiktig sprekke skallet med en skalpell håndtak og nøye frigi innholdet i formen inneholdende Tyrodes buffer. Kast embryoer dersom (i) de visuelt ser unormal (ii) deer ikke på riktig utviklingsstadiet (iii) de har feil orientert på plommen og / eller (iv) enhver blødning oppstår. Beholde noen embryoer ikke utsettes for kirurgi umiddelbart etter å ha blitt plassert ex ovo ved 40 ° C for å ikke gå på akkord utvikling.
Merk: Staging er utført basert på Hamilton og Hamburger 18. Abnormitet av kyllingfoster blir bestemt av det blotte øye og under disseksjonen omfang. Sørg for at fosteret har riktig folding og bøying og blodkar.
2. OFT Banding
- Tweeze ut enkelt 1 cm lange tråder fra en enkelt 11/0 nylon kirurgisk sutur og danner en løs knute. UV sterilisere alle prefabrikerte knop.
- Under en disseksjon mikroskop, visuelt at hjertet slår med en normal hastighet (~ 120 slag / min). Hvis ikke, kast embryo.
- Like før kirurgi, gjelder 5 - 6 ml varmt (37 ° C) Tyrodes buffer til embryoet overflaten ved hjelp av en overføring pipette.
- Pass en fri ende av prefabrikkerte knute under OFT, plasserer sutur ved OFT / ventrikkel krysset (OVJ) (eller ønsket plassering), og passerer den frie enden inn i knuten og dermed hemme OFT inkludert membraner rundt hjertet.
- Etter operasjonen fukte overflaten av eggeplomme med 5 - 6 ml varmt (37 ° C) Tyrodes buffer ved hjelp av en overføring pipette.
- Opprettholde kontroll embryoer ex ovo som banded embryoer; men ikke utsette dem for den kirurgiske prosedyren.
- Inkuber embryoer, til den ønskede mengde av tid, ved 40 ° C i en fuktet (60%) inkubator.
- Så snart det ønskede tidspunkt er nådd, eksisere embryoet fra eggeplomme ved hjelp av rette saks. Dissekere hjerte med fine tang og bruke i flere nedstrøms studier som endringer i hjerte morfologi på grunn av endret hemodynamics 17.
3. Bekrefter at Banding Intervention fører til en endring i hemodynamikken
Merk: delvis innsnevring forårsaket av banding intervensjon fører til en økning i blodstrømningshastigheten ved OVJ. Denne hemodynamiske parameteren blir hensiktsmessig bedømmes ved hjelp av 2D ultralyd avbildning, som utføres på det ønskede tidspunkt for eksperimentet.
- Siden bare en enkelt embryo kan avbildes samtidig, opprettholde alle andre embryoer og utformet for ultralydavbildning i en 40 ° C inkubator.
- Sett petriskål som inneholdt embryoet som skal bli avbildet på en varmepute innstilt på 40 ° C.
- Fyll fatet, opp til randen, med varm (37 ° C) Tyrode buffer. Hell sakte bufferoppløsningen i formen for å holde den eggeplomme intakt. Hvis imidlertid integriteten til eggeplomme er kompromittert under dette trinnet, forkaste embryo.
- Orienter embryo slik at den sentrale akse av embryoet er vinkelrett på ultralydsonden som er opphengt i et justerbart stativ.
- Med ultralyd maskin operating i B-mode, får et 2D-bilde av det bankende hjerte på skjermen og flytte scenen (oppvarming pad) slik at OFT, ventrikkel og OVJ er klart synlig.
- Bytt til pulset-wave (PW) modus, ved ønsket pulsrepetisjonsfrekvens (f.eks 20 kHz) og få hastighetsdata nøyaktig på OVJ. A B-mode bilde av det bankende hjertet oppnås på skjermen.
- Flytt scenen for å se OFT, ventrikkel og OVJ. Bruk av ultralyd maskin programvare, få hastighetsmålinger nøyaktig på OVJ.
Merk: Hvis puls av et embryo avtar under avbildning, bør hastighetsdataene oppnådd på denne måten ikke bli brukt for analyse. Alle embryoer som brukes for hastighetsmålinger bør helst ikke brukes til andre eksperimenter etter ultralydavbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vist i figur 1 er anbefalt virkemidler som trengs for OFT banding. Den petriskål (figur 1 A) inneholdende det embryo ex ovo bør være dypt nok, slik som å ikke ødelegge embryoet når dekket med lokket. Dype petriskåler (figur 1C) bør også brukes for ultralydavbildning for å tillate et tilstrekkelig volum av Tyrodes buffer som skal helles på toppen av eggeplomme.
En enkelt 1 cm tråd (figur 2A) er tweezed ut fra en 11/0 nylon sutur (figur 1A) og bundet inn i en løs knute (figur 1B). Alle prefabrikerte knop er UV sterilisert. Figur 3A viser en fuktet rocker kammer hvor befruktede kylling egg inkuberes inntil den ønskede scenen. 3B viser et embryo inkubator, hvor bundet og kontroll embryoer blir opprettholdt ex ovo
Vist i figur 4A er et HH17 embryo på toppen av eggeplomme ex ovo. Figur 4B er en skjematisk fremstilling som viser plasseringen av suturen (bånd) ved OVJ av en HH17 embryo. Figur 4C er et representativt bilde av en bøyle embryo avbildes 48 timer etter operasjonen.
Virkningen av bånd intervensjon på blodstrømningshastigheten gjennom innsnevringen stedet måles ved hjelp av 2D-ultralydavbildning. Som forventet, var hastigheten på OVJ er høyere i bundet embryo i forhold til kontrollgruppen (figur 5). Vi har nylig utført Computational Fluid Dynamics (CFD) analyser på banded og kontroll hjerter på 24 timers tidspunkt som viser effekten av OFT banding på blodstrømningshastighet og veggen skjærspenning 17.
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 1. kirurgiske instrumenter. (A) 11/0 nylon sutur. (B) Petri plate som inneholder pre-formet knop. (C) Deep petriskål for ex ovo embryo kultur og ultralydavbildning. (D) Transfer pipette. (E) skalpell klarer å knekke av eggeskallet. (F) Straight saks for embryo excision for post-kirurgi studier. (G) fin pinsett klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. søm for OFT banding. (A) En enkelt 1 cm tråd tweezed ut fra en sutur.
Figur 3. Inkubasjon Chambers. (A) fuktet rocker inkubator for befruktede egg. (B) fuktet kammer for ex ovo kultur stripete og kontroll embryoer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. OFT banding. (A) Hele HH17 kylling embryo opprettholdt ex ovo, skala bar = 10 mm (B) Skjematisk fremstilling som viser innsnevringnettsted (red). (C) Banded embryo avbildes 48 timer etter at OFT banding, skala bar = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Ultralyd-avledet hastighetsmålinger. Representant hastighetsprofiler (A) kontroll og (B) bundet embryoer oppnådd ved en 1 time tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknikken er relativt rask og enkel å utføre, men enkelte viktige punkter må holdes i bakhodet, slik som å få nøyaktige nedstrømsresultater. Embryo bør opprettholdes ex ovo i en petriskål som inneholder Tyrodes buffer for å tilveiebringe tilfredsstillende rehydratisering. Det er også viktig å hydrat plommen etter operasjonen med Tyrode buffer og å sørge for at inkubasjon kammeret er tilstrekkelig hydrert. Operasjoner bør ikke utføres på et foster hvis noen blødning er synlig eller eggeplomme er enda litt ødelagt. Dette påvirker embryo overlevelse, spesielt for langsiktige eksperimenter. En annen mulig årsak til dødelighet til embryoer, er om bandet rundt OFT er for stramt når først brukt, og dermed vesentlig kompromittere hjertefunksjon.
I dag bruker vi ultralyd som en bekreftende verktøy for å bestemme endringen i blodstrømningshastighet på OFT banding. I fremtiden vil vi bekrefte ved hjelp av mikro-computertomografi (CT). Vi har også visuelt bestemme bandet tetthet rundt OFT i B-mode 2D-bilder. Viktigere er ingen forskjeller i hjertefrekvensen og volumstrøm (beregnet ved hjelp av CFD) observert mellom embryo i bånd og kontrollgruppene 17. Dette tyder på at fysiologi av det kardiovaskulære systemet ikke er kompromittert i banded embryoer, og dermed ytterligere validere banding intervensjon.
Ved ønsket tidspunkt, etter banding, flere analyser kan utføres for å forstå virkningen av endrede hemodynamikk på kritisk ventil utviklingsprosesser. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, å bestemme endringer i transkripsjonsnivåer av viktige regulatoriske gener som er involvert i utvikling ventil, bestemme lokalisering av ECM-komponenter, og å bestemme ultra av OFT.
Til slutt, forbedrer denne teknikken på dagens metode for banding OFT i embryoet på innsiden av vindus egget 19. Denne metoden er alvorligly hemmet av den manglende evne til å akkumulere nødvendige embryoer for å gjøre nedstrøms molekylære analyser. Denne nye teknikken kan brukes i redningsforsøk også. Dette programmet gjør det mulig for banded OFT å bli reddet og embryo tillates å gjenopprette fra fornærmelse. Ingen nåværende metoden kan gjøre dette, og fremdeles være i stand til å utføre statistisk signifikante nedstrøms analyser.
Vi har med hell benyttet denne teknikken for å endre de hemodynamiske stimuli i hjertet av kyllingfoster på et svært tidlig utviklingsstadium (HH 16 - 17). Banding protokoll kan være en utfordring ved utførelse av operasjonen på senere stadier av utvikling på grunn av risikoen for sammenpressing hvilket som helst av de extraembryonic blodkar. Også i sene stadier av utvikling, er det ofte vanskelig å holde plommesekken intakt når egget innholdet blir overført til petriskål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
