Summary
RAPID blod behandlingsmetode kan anvendes i mennesker og giver højere peptidniveauer samt giver mulighed for vurdering af den korrekte molekylære formular. Derfor vil denne metode være et værdifuldt værktøj i peptid forskning.
Abstract
Forskning inden for regulering fødeindtagelse vinder betydning. Dette omfatter ofte måling af peptider regulerer fødeindtagelse. Til korrekt bestemmelse af et peptid koncentration, bør det være stabile under blod forarbejdning. Dette er imidlertid ikke tilfældet for flere peptider, som hurtigt nedbrydes af endogene peptidaser. For nylig har vi udviklet en blod forarbejdningsmetode ansætte R educed temperaturer, A cidification, P rotease hæmning, jeg sotopic eksogene kontroller og D ilution (RAPID) til brug i rotter. Her har vi etableret denne teknik til brug i mennesker og undersøgte nyttiggørelse, molekylær form, og cirkulerende koncentration af fødeindtagelse regulatoriske hormoner. RAPID metode forbedret genopretning for 125I-mærket somatostatin-28 (+ 39%), glucagon-lignende peptid-1 (+ 35%), acyl ghrelin og glucagon (+ 32%), insulin og kisspeptin (+ 29% signifikant ), nesfatin-1 (+ 28%), leptin(+ 21%) og peptid YY 3-36 (+ 19%) sammenlignet med standard behandling (EDTA-blod på is, p <0,001). Højtryksvæskekromatografi viste eluering af endogene acyl ghrelin på det forventede position efter hurtig behandling, medens den efter standard behandling 62% af acyl ghrelin blev nedbrudt resulterer i en tidligere top sandsynligvis repræsenterer desacyl ghrelin. Efter hurtig behandling af acyl / desacyl ghrelin-forholdet i blodet hos normalvægtige forsøgspersoner var 1: 3 i forhold til 1:23 efter standard behandling (p = 0,03). Også endogene kisspeptin niveauer var højere efter RAPID sammenlignet med standard behandling (+ 99%, p = 0,02). RAPID blod behandlingsmetode kan anvendes i mennesker, giver højere peptidniveauer og muliggør vurdering af den korrekte molekylære formular.
Introduction
I lyset af den verdensomspændende stigende forekomst af fedme 1,2, er forskning inden for regulering fødeindtagelse større betydning. Mens indtil videre kun et peptid er kendt, at der er perifert produceret og centralt virkende til at stimulere fødeindtagelse, nemlig ghrelin 3, inden for de seneste årtier, har en bred vifte af peptider er blevet identificeret som reducerer fødeindtagelse, f.eks. leptin, peptid YY (PYY) og også glukagon-lignende peptid-1 (GLP-1) og insulin 4, derfor i studier, der undersøger de regulatoriske mekanismer af sult og mæthed peptidniveauer ofte vurderes og samtidig, antages det at det undersøgte peptid er stabil og udvindes i høje udbytter under plasma formation. Men meget ofte er dette ikke tilfældet på grund af hurtig endogen opdeling som anført før til f.eks. ghrelin som nedbrydes blandt acyl til desacyl ghrelin 5. Derfor har vi for nylig beskrev RAPID metode til blod processynge i rotter beskæftiger R educed temperaturer, A cidification, P rotease hæmning, jeg sotopic eksogene kontroller og D ilution 6. Denne metode forbedret inddrivelse for 11 af 12 peptider testet og tilladt for bestemmelse af den korrekte cirkulerende molekylære form, sammenlignet med standard blod behandling (EDTA blod på is) 6. Denne metode er blevet anvendt i flere efterfølgende undersøgelser 7-12 til påvisning af cirkulerende ghrelin samt corticotropin-frigørende faktor 13. Derfor har metoden vist sig nyttig for peptid forskning i gnavere. Men da gnavere er ikke altid oversættes til en anden art, bør der etableres metoden til brug i humant blod så godt.
Formålet med den foreliggende undersøgelse var at afprøve hurtig fremgangsmåde til blod forarbejdning i mennesker sammenlignet med standard blod behandling, EDTA-blod på is, som er bredt anbefales 14 og hyppigt used i den kliniske samt forskning indstilling. Vi testede inddrivelse af et udvalg af 125 I-mærkede peptider er involveret i reguleringen af fødeindtagelse, herunder etablerede peptider samt nye kandidater for nylig foreslået at spille en rolle i fodring regulering (virkninger på fødeindtagelse er vist i tabel 1) efter forarbejdning med begge metoder. Hormoner blev også valgt til at repræsentere peptider af forskellig længde og ladning (tabel 2). Desuden for ghrelin vi undersøgte den molekylære form, (e) efter standard og RAPID metode. Endelig vurderede vi endogene ghrelin (acyl og desacyl ghrelin) samt kisspeptin niveauer, et peptid også for nylig foreslået at spille en rolle i reguleringen af fødeindtagelse 15,16 efter RAPID eller standard behandling. Derudover undersøgte vi også disse peptid-niveauer i en population af individer med en lang række af body mass index (i området fra 10.2-67.6 kg / m 2) at undersøge possible forskelle forbundet med kronisk ændret kropsvægt.
Diagnose, Vurdering, og Plan:
undersøgelse deltagere
Alle undersøgelsens deltagere var nyligt indlagt patienter (inklusion var senest to dage efter indlæggelse på hospitalet) for afdelingen for psykosomatisk medicin på Charité-Universitätsmedizin Berlin og gav skriftligt informeret samtykke. For at undgå enhver påvirkning af køn eneste kvindelige patienter blev inkluderet. I alt 42 patienter deltog i denne undersøgelse og blev inddelt i tre grupper: normal vægt (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) og fedme (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorektiske og overvægtige patienter vardiagnosticeret i henhold til International Classification of Diseases-10 og indlagt for vægtøgning (anorexia nervosa) eller vægtreduktion (fedme), hhv. Alle normalvægtige patienter blev udelukkende indlagt på grund af somatoforme symptomer uden relevante somatiske lidelser. Patienter med gastrointestinale somatoforme symptomer eller en historie af gastrointestinale kirurgi blev udelukket. Eksklusionskriterier omfattede også en alder <18 år, nuværende graviditet og ubehandlede psykotiske sygdomme. Blodopsamling blev udført på dag 2 eller 3 efter indlæggelse, før de modtager behandling kosten for at øge eller reducere kropsvægten, hhv. Antropometriske parametre blev vurderet på samme dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen blev godkendt af lokale etiske råd for menneskelig forskning (protokol nummer EA1 / 114/10).
1. Blod Processing
- Saml veneblod fra 7:00 til 08:00 efter en nats faste fra en underarm vene og fremgangsmåde ifølge standardprocedure eller RAPID metode. Instruer de emner, ikke udøver eller røg før blod tilbagetrækning.
- For standard forarbejdning, indsamle blod i kølede EDTA-holdige rør og centrifugeres inden 10 min ved 3.000 x g i 10 min ved 4 ° C. Saml supernatanten og holde ved -80 ° C indtil videre forarbejdning af radioimmunoassay.
- For hurtig behandling, straks fortyndet blod (inden for 1 min efter blod tilbagetrækning) 1:10 i iskold puffer (pH 3,6) indeholdende 0,1 M ammoniumacetat, 0,5 M NaCl og enzyminhibitorer (diprotin A, E-64-d, antipain , leupeptin, chymostatin, 1 ug / ml). Derefter centrifugeres inden for 10 min ved 3.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og samle bundfald osing en pipette i polypropylenrør som beskrevet før i rotter 6.
- Charge kromatografi patroner (360 mg, 55 til 105 um) med 100% acetonitril (rate 10 ml / min), i ligevægt med 0,1% trifluoracetat (TFA, bedøm 10 ml / min) og belastning med supernatanten ved en konstant hastighed på 1 ml / min under anvendelse af en sprøjtepumpe.
- Derefter vaskes patroner med 3 ml 0,1% TFA (rate 10 ml / min) og langsomt elueres med 2 ml 70% acetonitril indeholdende 0,1% TFA (2 ml / min).
- Tørre eluerede prøver ved hjælp af vakuum centrifugering og opbevares ved -80 ° C indtil videre forarbejdning af radioimmunoassay.
BEMÆRK: Udfør alle trin i polypropylen (hurtig behandling) og borsilikat (radioimmunoassay) rør, der udviser signifikant lavere overflade bindende egenskaber, og dermed minimere peptid tab for de fleste af de undersøgte inden den 26. peptider.
2. Målinger
BEMÆRK: bør udføres Trin i dette afsnit i et laboratoriumcertificeret til arbejde med radioaktivt materiale. Standard forholdsregler ved arbejde med 125I bør træffes.
- Inddrivelse af radioaktivt mærket peptider
- Opnå 125 I-radiomærkede humane peptider (f.eks. Acyl-ghrelin, GLP-1, glucagon, insulin, kisspeptin, leptin, nesfatin-1, PYY 3-36 og somatostatin-28).
- Hold peptider i pulverform indtil eksperimentet, så frisk fortyndet i 0,1% eddikesyre (~ 100.000 cpm pr ml).
- For standard blod behandling, direkte efter blod tilbagetrækning i kølet EDTA indeholder rør, overførsel 1 ml blod i et rør med 50 gi radioaktiv mærkning indeholder 3,000-6,000 CPM (talt umiddelbart før forsøget starter).
- For hurtig behandling, overførsel 1 ml blod EDTA indeholdende blod ind i et rør, der indeholder 9 ml RAPID buffer (for sammensætning se 1.3) og 500 pi radioaktiv mærkning indeholder 30,000-60,000 CPM. På grund af den 1:10 fortynding brug 10 gange højere volumen af radiolabel for hurtig behandling.
- Bagefter proces prøver som beskrevet i trin 1.2 til 1.3.2.
- For forsøgene nyttiggørelse, ikke tørre prøver ved vakuum centrifugering og må ikke opbevares ved -80 ° C. I stedet vurderer inddrivelse af radioaktivt mærkede peptider direkte bagefter ved hjælp af en gamma-tæller.
- Mål hele supernatanten i standardprøver, mens prøver i RAPID analyserer 1/10 af den samlede mængde til opnåelse sammenligneligheden af mængden af radioaktivt mærke anvendes. Til måling, overføre supernatanten i rør passer ind i gammatæller og vurdere tællinger per minut
- Som en 100% standard, bruge to prøver med 50 pi 125I-radioaktivt mærket peptid, som ikke undergår forarbejdning. Mål samtidig med andre prøver som beskrevet i 2.1.7.
- Udfør eksperimentet fem til seks gange for hvert peptid.
- Højtryksvæskekromatografi af radioaktivt mærket Ghrelin
- Trække blod i chilled EDTA indeholder rør og overføres 1 ml til rør indeholdende 200 pi radioaktivt mærket-acyl ghrelin indeholder 15.000-20.000 cpm (talt umiddelbart før forsøget starter).
- For hurtig behandling, overførsel 1 ml blod ind i et rør, der indeholder 9 ml RAPID buffer (for sammensætning se 1.3) og 200 pi radioaktivt mærket acyl ghrelin indeholder 15.000-20.000 cpm.
- Bagefter proces prøver som beskrevet i trin 1.2 til 1.3.2.
- Til yderligere analyse ved omvendt fase-HPLC, direkte indlæse prøver på en stabil binding C18-søjle (2,1 mm x 50 mm, 1,8 um) ækvilibreret i 17% acetonitril i vand (begge suppleret med 0,1% TFA).
- Efter 5 min ækvilibrering bruge en gradient fra 17-40% acetonitril til eluering af prøven i 40 min (strømningshastighed på 1 ml / min).
- Opsaml fraktioner på 1 ml i minuttet og analysere radioaktivitet under anvendelse af en gammatæller.
- I et separat eksperiment, belastning 200 pi radiomærket acyl ghrelin indeholdende 15.000-20.000cpm onto direkte søjlen og udfører HPLC som beskrevet i trin 2.2.4 til 2.2.6.
- radioimmunoassay
- For radioimmunoassay, optø frosne supernatanter (standard forarbejdning) og vakuum tørret pulver (RAPID metode) ved stuetemperatur.
- Umiddelbart før radioimmunoassay, re-suspendere tørre RAPID prøver i dobbelt destilleret H2O i henhold til den oprindelige volumen af plasma (500 pi).
- Vurdere kisspeptin og total (herunder både desacyl og acyl ghrelin) samt acyl ghrelin som beskrevet før 12,27 under anvendelse af kommercielle radioimmunassays ifølge fabrikanternes protokoller. Brug borsilicat rør, der tillader stabil pelletdannelse.
- På dag ét, inkuberes prøverne med assay buffer og primært antistof (f.eks. Anti-ghrelin) i fortyndingen fra producenten i en periode på 24 timer.
- På dag to, tilsæt 125I tracer (f.eks 125I-ghrelin), vortex og inkuberes i et tidsrum på 24 timer.
- På dag tre, tilføje fældningsreagenset, vortex og inkuberes som anbefalet af producenten. Derefter centrifugerør ved 3.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanterne og tælle radioaktivitet i pelleterne under anvendelse af en gammatæller
- Beregn desacyl ghrelin som forskellen af total minus acyl ghrelin. Vurdere acyl / desacyl ghrelin-forholdet ved at dividere acyl af desacyl ghrelin for hver enkelt prøve.
- Proces alle prøver - om muligt - i et parti for at undgå inter-assay variation. Intra-assay variation i det foreliggende forsøg var <8% for kisspeptin, <7% for total og <9% for acyl ghrelin.
3. Statistisk analyse
- Bestem fordelingen af data ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov test. Udtrykke data som middel ± standardfejl på middelværdien (SEM).
- Vurdere forskelle mellem togrupper ved t-test. Vurdere forskelle mellem flere grupper af alle parvise multiple sammenligning procedurer (Tukey post-hoc test) eller to-vejs ANOVA efterfulgt af Holm-Sidak metoden.
- Overvej p <0,05 signifikant og udfører analyser ved hjælp af et statistikprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RAPID blod forarbejdning forøger udbyttet af 125I-radiomærkede peptider i humant blod sammenlignet med standard blod forarbejdning.
Efter standard blod forarbejdning (EDTA blod på is), inddrivelse af radioaktivt mærkede peptider var ~ 60% i 9/9 peptider (spænder fra 48 til 68%, figur 1A - K). Hurtig behandling forbedres udbyttet i alle 125I-mærkede peptider, nemlig i somatostatin-28 (+ 39%, figur 1A), glucagon-lignende peptid-1 (+ 35%, figur 1 B), acyl ghrelin (n-octanoyl ghrelin, + 32%, figur 1C), glucagon (+ 32%, figur 1D), insulin (+ 29%, figur 1E), kisspeptin (+ 29%, figur 1F), nesfatin-1 (+ 28%, figur 1G), leptin (+ 21%, figur 1H) og peptid YY 3-36 (+ 19%, figur 1K) sammenlignet med standard behandling (p <0.001). I disse 9 peptider, genopretning efter den hurtige metode var ~ 90% (fra 71-98%, figur 1A - K).
Figur 1:. Inddrivelse af 125 I-mærkede peptider i humant blod efter Standard eller RAPID Blood Processing Radiomærket peptid blev tilføjet til humant blod og forarbejdet i henhold til standard procedure (EDTA blod på is) eller RAPID metode (reducerede temperaturer, forsuring, protease hæmning, isotopiske eksogene kontroller og fortynding). Supernatanterne blev opsamlet og talt for radioaktivitet. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SEM af fem til seks eksperimenter. *** P <0,001 vs. standard behandling. Klik her for at viewa større version af dette tal.
Efter hurtig behandling, Ghrelin elueres ved den forventede position.
Efter hurtig behandling af humant blod, 125I-mærket ghrelin elueret ved den forventede position, medens den efter standardprocedure en tidligere top blev observeret mest sandsynligt svarer til desacyl ghrelin (figur 2). Dette repræsenterede en nedbrydning 62% af peptidet.
Figur 2:. Eluering Profil af 125I-mærket Acyl Ghrelin i humant blod efter Standard eller RAPID Blood Processing Radiomærket peptid blev tilføjet til humant blod og forarbejdet i henhold til standard procedure eller den RAPID metode. Bagefter blev supernatanten fyldt på en højtydende væskekromatografi kolonne. Eluatet var colkeret hvert minut og talt for radioaktivitet. Efter hurtig behandling meste af peptidet eluerede på det forventede tidspunkt, mens efter standard behandlingen af en stor del elueret tidligere, mest sandsynligt repræsenterer desacyl ghrelin. Forkortelse:. CPM, tællinger per minut Klik her for at se en større version af dette tal.
RAPID Blood Processing Forbedrer acyl / Desacyl Ghrelin Ratio og resulterer i øget Endogen kisspeptin blodniveauer Sammenlignet med Standard Processing.
Blod blev trukket tilbage fra anorektiske, normalvægtige og adipøse forsøgspersoner og forarbejdet i henhold til den standard eller RAPID procedure. Endogen ghrelin (total og acyl ghrelin) blev vurderet ved radioimmunoassay. Antropometrisk og co-morbiditet / medicinering af studiegrupper er vist i tabel 3 og 4. Efter hurtig behandling acyl / desacyl ghrelin-forhold i blodet hos normalvægtige forsøgspersoner var 1: 3 i forhold til 01:23 følgende standard blod forarbejdning (p = 0,03, figur 3A). Lignende resultater blev observeret under anorektiske (1: 3 vs. 1:19 p <0,001) og fede betingelser (1: 3 vs 1:13; p = 0,04, figur 3A.). Blev ikke observeret nogen forskel mellem de tre forskellige grupper til standard eller hurtig behandling (figur 3A). Tovejs ANOVA indikerede en betydelig indflydelse af forarbejdningsmetode (F 1,64 = 15,3, p <0,001), mens legemsvægt / metabolisk tilstand havde nogen virkning (F 2,64 = 0,5, p = 0,62).
tp_upload / 53.959 / 53959table4.jpg "/>
Cirkulerende endogene kisspeptin niveauer signifikant højere efter RAPID sammenlignet med standard forarbejdning i anorektiske (+ 60%, p = 0,02) og normalvægtige personer (+ 99%, p = 0,02), mens forskellen ikke nåede signifikans under betingelser med fedme ( 23%, p = 0,39, figur 3B). Blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem de tre forskellige BMI-grupper (p> 0,05, figur 3B). Tovejs ANOVA indikerede en betydelig indflydelse af forarbejdningsmetode (F 1,74 = 10,8, p = 0,002), mens legemsvægt / metabolisk tilstand havde nogen virkning (F 2,74 = 0,5, p = 0,60).
Figur 3: Cirkulerende Acyl / Desacyl Ghrelin Ratio og Cirkulerende kisspeptin Niveauer under forskellige metaboliske betingelser efter RAPID eller Standard Blood Processing Blod blev trukket tilbage fra anorektiske, normal vægt eller fede fag efter en nats faste og forarbejdet i henhold til standard procedure eller den RAPID metode.. Supernatanten blev opsamlet og acyl samt samlede ghrelin niveauer eller kisspeptin niveauer (B) vurderet af radioimmunoassay. Desacyl ghrelin blev opnået ved at trække acyl fra total ghrelin. Forholdet blev beregnet ved at dividere acyl af desacyl ghrelin (A). Gruppestørrelsen er angivet ved bunden af søjlerne. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM. * P <0,05, ** p <0,01 og *** p <0,001 vs.. standard behandling. Klik her for at se en større udgave afdette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporteret før, at den hurtige metode til blod behandling forbedret inddrivelse for 11/12 peptider i forhold til standard blod forarbejdning i rotter 6. I den foreliggende undersøgelse har vi vist, at denne metode også er egnet til anvendelse i mennesker. Efter hurtig behandling, blev opsvinget for 9 af 9 125 I-mærkede peptider testet forbedret i forhold til standard blod behandling (EDTA blod på is). Den observerede forbedring varierede fra 19-39%, hvilket sandsynligvis vil være relevant, især under forhold, når der forventes kun små forskelle, der kan maskeres når udbyttet af peptidet er lav.
Vi viste også, at efter RAPID blod forarbejdning ghrelin detekteres ved den korrekte eluering position efter HPLC viser den korrekte molekylære formular (acyl ghrelin), medens den efter standard blod forarbejdning 2/3 nedbrydes til desacyl ghrelin. Da acylgruppen er væsentlig for binding til ghrelin receptor 28, de-acylering forventes i høj grad at ændre den biologiske funktion af peptidet. Men også desacyl ghrelin anerkendes i stigende grad som en biologisk aktiv peptid 29. Interessant nok blev desacyl ghrelin foreslået at modvirke virkningerne af ghrelin, som vist før for fødeindtagelse 30 eller colon motilitet 31. Dette fremhæver endvidere betydningen af at undersøge den korrekte molekylære formular.
Når man studerer endogene niveauer af kisspeptin i normalvægtige forsøgspersoner, viste vi stærkt forøgede niveauer (+ 99%) efter RAPID forhold til standard blod behandling. Imidlertid blev ingen forbedring observeret under forhold med fedme, som kan være på grund af det samlede forhøjede kisspeptin niveauer (+ 50% i fede vs. Normal vægt). Mellem BMI grupper (anorexia nervosa, normal vægt og fedme) i blod behandlet med enten metode, blev der ikke observeret signifikante forskelle, som kan være på grund af det faktum, at kun fastende niveauer were vurderes. Forskelle kan være indlysende postprandialt, en hypotese, der bør undersøges i fremtidige studier.
Kisspeptin er blevet målt før i undersøgelser under anvendelse af kun EDTA-rør på is 32 (i den foreliggende undersøgelse benævnt standard forarbejdning) eller ved tilsætning af proteaseinhibitorer 33. Baseret på den foreliggende undersøgelse kølingen af rørene er ikke tilstrækkeligt til at forhindre peptidnedbrydning. Uanset om forsuring alene eller enkelt proteasehæmmere er nok til at bevare kisspeptin skal undersøges i fremtidige studier.
Tilsvarende RAPID behandling øger også udbyttet af endogene acyl ghrelin som angivet ved en stærkt forøget acyl / desacyl ghrelin-forhold (1: 3) sammenlignet med standard blod forarbejdning (01:23). Dette fund viser god overensstemmelse med gnavere, hvor vi rapporterede en acyl / desacyl ghrelin-forhold på 1: 5 efter hurtig behandling før (i forhold til 1:19 efter standard behandling).De brede intervaller af acyl / desacyl ghrelin-forhold på 1:15 til 1:55 34,35 rapporterede før var derfor mest sandsynligt på grund af en de-acyleringen-afhængige høj andel af desacyl ghrelin. Som beskrevet ovenfor for kisspeptin blev der ikke ændringer af acyl / desacyl ghrelin-forhold observeret under forskellige kronisk ændret kropsvægt (anorexia nervosa vs. Normalvægt vs. Fedme). Dette kan også skyldes det faktum, at kun fastende niveauer af acyl / desacyl ghrelin blev vurderet og postprandiale regulering er vigtigere. På den anden side indikerer dette også, at på trods af kronisk ændret kropsvægt andelen af acyl og desacyl ghrelin ændres ikke under basale betingelser og kan ikke spille en vigtig rolle i de adaptive ændringer, der observeres under disse betingelser. fremtidige undersøgelser anvender standardiserede måltid protokoller og anvender RAPID metode vil imidlertid bidrage til yderligere at besvare dette spørgsmål.
RAPID migThOD bruger følgende komponenter: Siden kemiske reaktioner afhænger i temperatur 36 en reduktion af temperaturen ved anvendelse af en iskold opløsning sinker nedbrydning af peptidet. Dernæst også et fald i pH (syrning) formindsker hastigheden for nedbrydningen 37. Desuden er en reduktion i pH reducerer adsorption af peptider til andre overflader og reducerer derfor også risikoen for peptid tab. Proteaseinhibitorerne anvendes her blev valgt for at dække et bredt spektrum af endogene peptidaser: (. F.eks cathepsin B / H) diprotin A som en inhibitor af dipeptidylpeptidase IV, E-64-d som en inhibitor for thiolproteaser, antipain som en inhibitor for trypsin, papain og cathepsin A / B, leupeptin som inhibitor for trypsin, plasmin, papain og cathepsin og chymostatin som inhibitor for chymotrypsin, papain og cathepsin B / G. Desuden isotopiske peptider er nyttige for at vurdere forbedring af genvinding ved fremgangsmåden. Endelig som satsen of enzym-substrat kompleksdannelse afhænger af koncentrationen af enzymet (peptidase) og substratet (peptid hormon) 38-fortynding af plasmaet reducerer hastigheden for dannelse og dermed nedbrydning (en tidobbelt fortynding reducerer hastigheden hundredfold ifølge Michaelis -Menten kinetik).
Trods fordelene ved den hurtig fremgangsmåde bør flere metodens begrænsninger anerkendes som godt. Det mest kritiske trin af protokollen er tid. Blodprøver bør fortyndes i RAPID buffer umiddelbart efter blod tilbagetrækning, som kan være vanskeligt i kliniske omgivelser. Desuden metode er mere tidskrævende, kræver et højere uddannelsesniveau og er også dyrere end standard blod forarbejdning. Selv om det kan være en udfordring at gennemføre i klinisk rutine, vil det være nyttigt til forskningsformål, især når der forventes kun små forskelle og dermed et højt udbytte af peptidet er ønskelig.
Selv er beskrevet og anbefalet med alle dets komponenter RAPID metode (R educed temperaturer, A cidification, P rotease hæmning, jeg sotopic eksogene kontroller og D ilution) i nærværende dokument, kan fremtidige undersøgelser bruge modifikationer af denne teknik. Brugen af isotopiske eksogene kontroller kan ikke være obligatorisk og derfor begrænset til pilotundersøgelser for at vurdere, hvilke peptider viser den største forbedring i nyttiggørelse hjælp hurtig behandling. Endvidere også sammensætningen af proteaseinhibitoren cocktail kan ændres, såfremt andre peptider vurderes. Dette bør dog testes, når en ny peptid måles.
Sammenfattende kan anvendes RAPID metode blod behandling til humant blod og stærkt forbedret inddrivelse af 9/9 peptider testet i forhold til standard blod behandling. Da nogle peptider kun en lille til moderat forbedring af inddrivelsen blev observeret, at det er nødvendigtaf fremgangsmåden kan skal testes, når en ny peptid analyseres. Desuden hurtig fremgangsmåde muliggør påvisning af den korrekte molekylære form, som vist for acyl ghrelin og også forøger udbyttet af endogene cirkulerende niveauer af peptider, såsom kisspeptin sammenlignet med standard blod forarbejdning. Derfor bør denne metode være et nyttigt redskab i humane undersøgelser, der vurderer cirkulerende peptid niveauer, f.eks. der er involveret i reguleringen af sult og mæthed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den tyske Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) og tyske ministerium for Uddannelse og Forskning 03IPT614A (CG). Vi takker Reinhard Lommel og Petra Busse for deres fremragende teknisk support samt Karin Johansson og Christina Hentzschel om hjælp med tilrettelæggelse og gennemførelse af antropometriske målinger
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| Antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| Leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| Chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| Acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| Glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| Insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| Leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| Nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| Somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
References
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. Jr The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. Principles of Biochemistry. , 5th ed, McGraw-Hill Book Co. New York. (1973).
