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Immunology and Infection

रक्त प्रसंस्करण के लिए एक तेजी से विधि मानव रक्त में प्लाज्मा पेप्टाइड स्तर की पैदावार बढ़ाने के लिए

Published: April 28, 2016 doi: 10.3791/53959
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 3, 1, 1, 1
1Charité Center for Internal Medicine and Dermatology, Division General Internal and Psychosomatic Medicine, Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Benjamin Franklin, 2Department of Internal Medicine, Institute of Neurogastroenterology and Motility, Martin-Luther Hospital, Academic Teaching Institution of Charité Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Hepatology and Gastroenterology, Molecular Cancer Research Center (MKFZ), Campus Virchow-Klinikum, Charité-Universitätsmedizin Berlin

Summary

त्वरित रक्त प्रसंस्करण विधि मानव में इस्तेमाल किया जा सकता है और उच्च पेप्टाइड स्तरों पैदावार के साथ ही सही आणविक फार्म के आकलन के लिए अनुमति देता है। इसलिए, इस विधि पेप्टाइड अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा।

Abstract

भोजन का सेवन विनियमन के क्षेत्र में अनुसंधान के महत्व को फायदा हो रहा है। इस बार भोजन का सेवन को विनियमित करने पेप्टाइड्स की माप भी शामिल है। एक पेप्टाइड की एकाग्रता का सही निर्धारण के लिए, यह रक्त प्रसंस्करण के दौरान स्थिर होना चाहिए। हालांकि, यह कई पेप्टाइड्स जो जल्दी अंतर्जात peptidases द्वारा अपमानित कर रहे हैं के लिए मामला नहीं है। हाल ही में, हम एक रक्त प्रसंस्करण विधि विकसित आर educed तापमान, ए cidification रोजगार, पी निषेध rotease, मैं exogenous नियंत्रण और चूहों में प्रयोग के लिए डी ilution (त्वरित) sotopic। यहाँ, हम इंसानों में इस्तेमाल के लिए इस तकनीक की स्थापना की और वसूली, आणविक फार्म और भोजन का सेवन नियामक हार्मोन के घूम एकाग्रता की जांच की है। तेजी से विधि काफी के लिए 125 मैं लेबल सोमेटोस्टैटिन-28 (+ 39%), ग्लूकागन-जैसे पेप्टाइड -1 (+ 35%) वसूली, एसाइल ghrelin और ग्लूकागन (+ 32%), इंसुलिन और kisspeptin (+ 29% से सुधार ), nesfatin -1 (+ 28%), लेप्टिन(+ 21%) और पेप्टाइड YY 3-36 (+ 19%) मानक प्रोसेसिंग (बर्फ पर EDTA रक्त, पी <0.001) की तुलना में। उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी, तेजी से प्रसंस्करण के बाद उम्मीद की स्थिति में अंतर्जात एसाइल ghrelin की क्षालन से पता चला है, जबकि मानक प्रसंस्करण के बाद एसाइल ghrelin के 62% के पहले के एक चोटी में जिसके परिणामस्वरूप संभावना desacyl ghrelin का प्रतिनिधित्व कर अपमानित किया गया। 3 मानक प्रोसेसिंग (पी = 0.03) के बाद 1:23 की तुलना में: तेजी से प्रसंस्करण के बाद सामान्य वजन विषयों के रक्त में एसाइल / desacyl ghrelin अनुपात 1 था। इसके अलावा अंतर्जात kisspeptin का स्तर मानक प्रसंस्करण की तुलना में तेजी के बाद उच्च स्तर पर थे (+ 99%, पी = 0.02)। त्वरित रक्त प्रसंस्करण विधि मानव में इस्तेमाल किया जा सकता है, उच्च पेप्टाइड स्तरों पैदावार और सही आणविक फार्म के आकलन के लिए अनुमति देता है।

Introduction

मोटापा 1,2 की दुनिया भर में बढ़ती व्यापकता के प्रकाश में, भोजन का सेवन विनियमन के क्षेत्र में अनुसंधान महत्व प्राप्त कर रहा है। अब तक केवल एक पेप्टाइड ज्ञात है कि सतही तौर पर उत्पादन किया जाता है और केन्द्र पिछले दशकों के भीतर, भोजन का सेवन, अर्थात् ghrelin 3 प्रोत्साहित करने के लिए काम करने के दौरान, पेप्टाइड्स की एक विस्तृत रेंज पहचान की गई है कि भोजन का सेवन कम करने, उदाहरण के लिए। लेप्टिन, पेप्टाइड YY (पी वाई वाई) और भी ग्लूकागन की तरह पेप्टाइड 1 (जीएलपी -1) और इंसुलिन 4, इसलिए, भूख और तृप्ति पेप्टाइड स्तर के नियामक तंत्र की जांच के अध्ययन में अक्सर मूल्यांकन कर रहे हैं और एक ही समय में, यह माना जाता है कि पेप्टाइड का अध्ययन किया स्थिर और प्लाज्मा गठन के दौरान उच्च पैदावार में बरामद किया है। हालांकि, बहुत बार यह मामला तेजी से अंतर्जात टूटने के कारण के रूप में उदाहरण के लिए पहले दिखाया गया है। ghrelin जो एसाइल से ghrelin 5 desacyl को अपमानित किया जाता है। इसलिए, हम हाल ही में रक्त की प्रक्रिया के लिए तेजी से विधि का वर्णन कियाआर educed तापमान, ए cidification रोजगार चूहों में गाते हैं, पी निषेध rotease, मैं exogenous नियंत्रण और डी 6 ilution sotopic। इस विधि को 12 में से 11 पेप्टाइड्स परीक्षण किया और मानक रक्त प्रसंस्करण की तुलना में सही घूम आणविक फार्म के दृढ़ संकल्प (बर्फ पर EDTA रक्त) के लिए अनुमति दी 6 के लिए वसूली में सुधार हुआ। इस विधि ghrelin घूम corticotropin रिहा कारक के रूप में 13 के रूप में अच्छी तरह से पता लगाने के लिए कई बाद में पढ़ाई 7-12 में इस्तेमाल किया गया है। इसलिए, विधि कृन्तकों में पेप्टाइड अनुसंधान के लिए उपयोगी साबित हो गया। हालांकि, बाद से कृंतक अध्ययन नहीं हमेशा एक और प्रजातियों के लिए अनुवाद कर रहे हैं, विधि मानव रक्त में उपयोग के लिए के रूप में अच्छी तरह से स्थापित किया जाना चाहिए।

वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य मानव में रक्त के प्रसंस्करण के लिए तेजी से विधि का परीक्षण करने के लिए मानक रक्त प्रसंस्करण, बर्फ पर EDTA खून है, जो व्यापक रूप से सिफारिश की है 14 और बार-बार यू की तुलना में थानैदानिक ​​साथ ही अनुसंधान की स्थापना में sed। हमने हाल ही में (भोजन का सेवन पर प्रभाव तालिका 1 में दिखाया गया है) के बाद प्रसंस्करण विनियमन खिलाने में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया 125 मैं लेबल स्थापित पेप्टाइड्स के साथ ही नए उम्मीदवारों सहित भोजन का सेवन के नियमन में शामिल पेप्टाइड्स की एक चयन की वसूली का परीक्षण किया दोनों तरीकों के साथ। हार्मोन भी अलग अलग लंबाई और प्रभारी (तालिका 2) के पेप्टाइड्स प्रतिनिधित्व करने के लिए चुने गए हैं। इसके अलावा, ghrelin के लिए हम आणविक फॉर्म (s) मानक और तेजी से विधि निम्न की जांच की। अन्त में, हम अंतर्जात ghrelin (एसाइल और desacyl ghrelin) के साथ ही kisspeptin स्तर, एक पेप्टाइड भी हाल ही में तेजी से या मानक प्रसंस्करण के बाद भोजन का सेवन 15,16 के नियमन में एक भूमिका निभाने के लिए सुझाव का आकलन किया। इसके अलावा, हम भी बॉडी मास इंडेक्स (10.2-67.6 किलो से लेकर / एम 2) possib अध्ययन करने के लिए की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ विषयों की आबादी में इन पेप्टाइड स्तरों की जांच कीलंबे समय बदल शरीर के वजन से संबंधित Le मतभेद।

तालिका एक

सारणी 2

निदान, मूल्यांकन, और योजना:
अध्ययन प्रतिभागियों
सभी अध्ययन प्रतिभागियों नव अस्पताल में भर्ती थे रोगियों Charité-Universitätsmedizin बर्लिन में मनोदैहिक चिकित्सा के डिवीजन के (शामिल किए जाने के अस्पताल में प्रवेश के दो दिनों के भीतर था) और सूचित सहमति लिखा दिया। लिंग के किसी भी प्रभाव केवल महिला रोगियों को शामिल किया गया से बचने के लिए। 42 विषयों की कुल इस अध्ययन में भाग लिया और तीन समूहों में विभाजित किया गया: सामान्य वजन (बीएमआई 18.5-25 किग्रा / एम 2 n = 12), एनोरेक्सिया नर्वोसा (बीएमआई <17.5 किग्रा / एम 2 n = 15) और मोटापा (बीएमआई> 30 किग्रा / एम 2 n = 15)। Anorexic और मोटापे से ग्रस्त रोगियों थेरोग-10 के अंतर्राष्ट्रीय वर्गीकरण का निदान और वजन (एनोरेक्सिया नर्वोसा) या वजन में कमी (मोटापा), क्रमशः के लिए अस्पताल में भर्ती कराया। सभी सामान्य वजन रोगियों प्रासंगिक दैहिक विकारों के बिना somatoform लक्षणों के कारण विशेष रूप से अस्पताल में भर्ती थे। जठरांत्र somatoform लक्षण या जठरांत्र सर्जरी के इतिहास के साथ मरीजों को बाहर रखा गया। अपवर्जन मानदंड भी एक उम्र <18 साल, वर्तमान गर्भावस्था और इलाज मानसिक रोगों घेर लिया। रक्त संग्रह आदेश में वृद्धि या क्रमश: शरीर के वजन को कम करने के लिए आहार में उपचार प्राप्त करने से पहले अस्पताल में प्रवेश के बाद दिन में 2 या 3 पर प्रदर्शन किया गया था। मानवशास्त्रीय मानकों को एक ही दिन में मूल्यांकन किया गया।

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Protocol

प्रोटोकॉल (/ 114/10 प्रोटोकॉल संख्या EA1) मानव अनुसंधान के लिए स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. रक्त प्रसंस्करण

  1. 07:00 से 08:00 के बीच रक्त शिराओं मानक प्रक्रिया या तेजी से विधि के अनुसार एक प्रकोष्ठ नस और इस प्रक्रिया से रातोंरात तेजी से एक के बाद लीजिए। विषयों व्यायाम या धूम्रपान न करने के लिए रक्त वापसी से पहले निर्देश दें।
  2. मानक प्रसंस्करण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,000 XG पर 10 मिनट के भीतर ठंडा EDTA युक्त ट्यूबों में रक्त और सेंट्रीफ्यूज इकट्ठा। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और radioimmunoassay द्वारा आगे की प्रक्रिया जब तक डिग्री सेल्सियस -80 में रहते हैं।
  3. तेजी से प्रसंस्करण के लिए, तुरंत खून पतला ठंडा बफर 1:10 (3.6 पीएच) 0.1 एम अमोनियम एसीटेट, 0.5 एम NaCl युक्त और एंजाइम inhibitors (रक्त वापसी के बाद 1 मिनट के भीतर) (diprotin ए, ई-64-डी, antipain , leupeptin, chymostatin, 1 माइक्रोग्राम / एमएल)। फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,000 XG पर 10 मिनट के भीतर सेंट्रीफ्यूज और हमें सतह पर तैरनेवाला इकट्ठाpolypropylene ट्यूबों में एक विंदुक के रूप में चूहों 6 में पहले विस्तृत हैैं।
    1. 100% acetonitrile (दर 10 मिलीग्राम / मिनट) के साथ प्रभारी क्रोमैटोग्राफी कारतूस (360 एमजी, 55-105 माइक्रोन), 1 मिलीलीटर की एक स्थिर दर पर 0.1% trifluoroacetate (टीएफए, दर 10 मिलीग्राम / मिनट) और लोड सतह पर तैरनेवाला के साथ साथ संतुलित करना / एक सिरिंज पंप का उपयोग मिनट।
    2. इसके बाद, (10 मिलीग्राम / मिनट की दर) 3 मिलीलीटर 0.1% TFA के साथ कारतूस धोने और धीरे-धीरे 2 मिलीलीटर 70% 0.1% TFA (2 मिलीग्राम / मिनट) युक्त acetonitrile साथ elute।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम centrifugation और दुकान का उपयोग radioimmunoassay द्वारा आगे की प्रक्रिया जब तक सूखी eluted नमूने हैं।
      नोट: polypropylene (तेजी से प्रसंस्करण) और borosilicate (radioimmunoassay) नलियों उल्लेखनीय है कि निचली सतह बाध्यकारी गुणों का प्रदर्शन और इस तरह पेप्टाइड्स 26 से पहले अध्ययन के अधिकांश के लिए पेप्टाइड नुकसान को कम करने में सभी चरणों का संचालन।

2. माप

नोट: इस खंड में कदम एक प्रयोगशाला में किया जाना चाहिएरेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करने के लिए प्रमाणित है। काम 125 के साथ मैं लिया जाना चाहिए के लिए मानक सावधानियों।

  1. Radiolabeled पेप्टाइड्स की वसूली
    1. प्राप्त 125 मैं-radiolabeled मानव पेप्टाइड्स (जैसे। एसाइल ghrelin, जीएलपी -1, ग्लूकागन, इंसुलिन, kisspeptin, लेप्टिन, nesfatin -1, पी वाई वाई 3-36 और सोमेटोस्टैटिन-28)।
    2. प्रयोग जब तक पाउडर के रूप में पेप्टाइड्स रखें, तो हौसले से 0.1% में एसिटिक एसिड पतला (~ मिलीलीटर प्रति 100,000 सीपीएम)।
    3. मानक रक्त प्रसंस्करण के लिए, सीधे के बाद ठंडा ट्यूब, 3,000-6,000 सीपीएम युक्त radiolabel के 50 μl के साथ एक ट्यूब में हस्तांतरण रक्त के 1 मिलीलीटर युक्त EDTA में रक्त वापसी (सीधे गिना से पहले प्रयोग शुरू होता है)।
    4. तेजी से प्रसंस्करण के लिए, एक ट्यूब 9 मिलीलीटर युक्त त्वरित बफर में रक्त युक्त EDTA के हस्तांतरण के 1 मिलीलीटर रक्त (रचना के लिए 1.3 देखें) और 500 μl radiolabel 30,000-60,000 सीपीएम से युक्त। radiolabe के 1:10 कमजोर पड़ने उपयोग के कारण 10 गुना अधिक मात्रातेजी से प्रसंस्करण के लिए एल।
    5. बाद में, इस प्रक्रिया के नमूने के रूप में कदम 1.3.2 के लिए 1.2 में वर्णित है।
    6. वसूली प्रयोगों के लिए, वैक्यूम centrifugation द्वारा नहीं सूखी नमूने करते हैं और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान नहीं है। इसके बजाय, radioactively लेबल पेप्टाइड्स सीधे बाद एक गामा काउंटर का उपयोग कर की वसूली का आकलन करें।
    7. मानक नमूनों में पूरे सतह पर तैरनेवाला उपाय है, जबकि रैपिड में नमूने कुल मात्रा का विश्लेषण 1/10 इस्तेमाल किया radiolabel की राशि की तुलनात्मकता प्राप्त करने के लिए। माप के लिए, ट्यूब गामा काउंटर में फिटिंग में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण और प्रति मिनट की गिनती का आकलन
    8. एक 100% मानक के रूप में, 125 मैं-radiolabeled पेप्टाइड कि प्रसंस्करण से गुजरना नहीं है के 50 μl के साथ दो नमूने का उपयोग करें। 2.1.7 में वर्णित के रूप में अन्य नमूनों के साथ एक ही समय में उपाय।
    9. प्रत्येक पेप्टाइड के लिए प्रयोग में पांच से छह बार प्रदर्शन करना।
  2. Radiolabeled ghrelin के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी
    1. ग में रक्त वापस ले लेंhilled EDTA ट्यूब और 200 μl radiolabeled-एसाइल 15,000-20,000 सीपीएम (सीधे गिना से पहले प्रयोग शुरू होता है) युक्त ghrelin युक्त ट्यूबों के लिए स्थानांतरण 1 मिलीलीटर से युक्त।
    2. तेजी से प्रसंस्करण के लिए, एक ट्यूब 9 मिलीलीटर युक्त त्वरित बफर में स्थानांतरण 1 मिलीलीटर रक्त (रचना के लिए 1.3 देखें) और 200 μl radiolabeled एसाइल ghrelin 15,000-20,000 सीपीएम से युक्त।
    3. बाद में, इस प्रक्रिया के नमूने के रूप में कदम 1.3.2 के लिए 1.2 में वर्णित है।
    4. रिवर्स चरण HPLC द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए, सीधे एक स्थिर बंधन C18 स्तंभ (2.1 मिमी x 50 मिमी, 1.8 माइक्रोन) पानी में 17% acetonitrile में equilibrated (दोनों 0.1% TFA के साथ पूरक) पर नमूने लोड।
    5. 5 मिनट के संतुलन के बाद, 40 मिनट में नमूना elute करने के लिए 17-40% acetonitrile से एक ढाल का उपयोग करें (प्रवाह 1 मिलीग्राम / मिनट की दर)।
    6. 1 मिलीलीटर हर मिनट के भागों को इकट्ठा करने और एक गामा काउंटर का उपयोग रेडियोधर्मिता का विश्लेषण।
    7. एक अलग प्रयोग में, भार 200 μl radiolabeled एसाइल ghrelin 15,000-20,000 युक्तसीपीएम स्तंभ सीधे पर और कदम 2.2.6 के लिए 2.2.4 में वर्णित के रूप में एचपीएलसी प्रदर्शन करते हैं।
  3. radioimmunoassay
    1. radioimmunoassay के लिए, जमे हुए supernatants (मानक प्रोसेसिंग) पिघलना और कमरे के तापमान पर सूखे पाउडर (तेजी से विधि) वैक्यूम।
    2. तुरंत पहले radioimmunoassay, सूखी त्वरित नमूने दोहरा आसुत एच 2 ओ में फिर से निलंबित प्लाज्मा (500 μl) के मूल मात्रा के अनुसार।
    3. के रूप में 'निर्माताओं प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक radioimmunoassays का उपयोग कर 12,27 से पहले वर्णित kisspeptin और कुल (दोनों desacyl और एसाइल ghrelin सहित) के साथ ही एसाइल ghrelin का आकलन करें। borosilicate ट्यूबों कि स्थिर गोली गठन की अनुमति का प्रयोग करें।
      1. एक दिन, 24 घंटा की अवधि के लिए निर्माता द्वारा प्रदान की कमजोर पड़ने में परख बफर और प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे। विरोधी ghrelin) के साथ नमूने सेते हैं।
      2. दो दिन, vo 125 मैं दरियाफ्त (जैसे 125 मैं-ghrelin) जोड़नेrtex और 24 घंटे की अवधि के लिए सेते हैं।
      3. तीन दिन, precipitating अभिकर्मक, भंवर जोड़ने के लिए और के रूप में निर्माता से सिफारिश की सेते हैं। फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 3,000 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। supernatants निकालें और एक गामा काउंटर का उपयोग छर्रों में रेडियोधर्मिता की गिनती
    4. कुल शून्य से एसाइल ghrelin के अंतर के रूप में desacyl ghrelin की गणना। प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए desacyl ghrelin द्वारा एसाइल विभाजित करके एसाइल / desacyl ghrelin अनुपात का आकलन करें।
    5. सभी नमूने प्रक्रिया - यदि संभव हो तो - एक बैच में अंतर-परख परिवर्तनशीलता से बचने के लिए। वर्तमान प्रयोग में इंट्रा-परख परिवर्तनशीलता kisspeptin के लिए <8%, <कुल के लिए 7% और एसाइल ghrelin के लिए <9% थी।

3. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. Kolmogorov-Smirnov परीक्षण का उपयोग कर डेटा का वितरण निर्धारित करते हैं। एक्सप्रेस मतलब का मतलब ± मानक त्रुटि (SEM) के रूप में डेटा।
  2. दोनों के बीच मतभेद का आकलनटी परीक्षण द्वारा समूहों। सभी जोड़ी वार एकाधिक तुलना प्रक्रियाओं (Tukey पोस्ट अस्थायी परीक्षण) या दो तरह से एनोवा होल्म-सिदक विधि के द्वारा पीछा करके कई समूहों के बीच मतभेद का आकलन करें।
  3. पी महत्वपूर्ण विचार करें <0.05 और एक आँकड़े प्रोग्राम का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन।

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Representative Results

त्वरित रक्त प्रोसेसिंग मानक रक्त प्रसंस्करण की तुलना में मानव रक्त में 125 मैं-radiolabeled पेप्टाइड्स की पैदावार बढ़ जाती है।
मानक रक्त प्रोसेसिंग (बर्फ पर EDTA रक्त) के बाद, radiolabeled पेप्टाइड्स की वसूली 9/9 पेप्टाइड्स (- कश्मीर 48-68%, चित्रा 1 ए से लेकर) में ~ 60% थी। तेजी से प्रसंस्करण (+ 39%, चित्रा 1 ए), 125 सब मैं लेबल पेप्टाइड्स में उपज में सुधार अर्थात् सोमेटोस्टैटिन-28 में, ग्लूकागन-जैसे पेप्टाइड -1 (+ 35%, चित्रा 1 बी), एसाइल ghrelin (एन octanoyl ghrelin, + 32%, चित्रा 1 सी), ग्लूकागन (+ 32%, चित्रा -1), इंसुलिन (+ 29%, चित्रा 1E), kisspeptin (+ 29%, चित्रा 1F), nesfatin -1 (+ 28%, चित्रा 1G), लेप्टिन (+ 21%, चित्रा 1H) और पेप्टाइड YY 3-36 (+ 19%, चित्रा 1K) मानक प्रसंस्करण (पी की तुलना <0.001)। इन 9 पेप्टाइड्स में, तेजी से विधि के बाद वसूली ~ 90% (- कश्मीर 71-98%, चित्रा 1 ए से लेकर) था।

आकृति 1
चित्रा 1:। स्टैंडर्ड या तेजी से रक्त प्रसंस्करण radiolabeled पेप्टाइड निम्नलिखित मानव रक्त में 125 मैं लेबल पेप्टाइड्स की वसूली मानव रक्त में जोड़ा और मानक प्रक्रिया (बर्फ पर EDTA रक्त) या तेजी से विधि (कम तापमान, अम्लीकरण, प्रोटीज के अनुसार संसाधित किया गया था निषेध, समस्थानिक बहिर्जात नियंत्रण और कमजोर पड़ने)। supernatants एकत्र की है और रेडियोधर्मिता के लिए गिना रहे थे। प्रत्येक स्तंभ पांच से छह प्रयोगों के SEM मतलब ± प्रतिनिधित्व करता है। *** पी <0.001 बनाम मानक प्रसंस्करण। कृपया यहाँ क्लिक करें होड़ करनायह आंकड़ा की वा बड़ा संस्करण।

उम्मीद की स्थिति में तेजी से प्रसंस्करण, Ghrelin elutes के बाद।
मानव रक्त का तेजी से प्रसंस्करण के बाद, 125 मैं लेबल ghrelin, उम्मीद स्थिति पर eluted जबकि मानक प्रक्रिया के बाद पहले के एक चोटी मनाया गया सबसे अधिक संभावना ghrelin (चित्रा 2) desacyl के लिए इसी। इस पेप्टाइड का एक 62% गिरावट का प्रतिनिधित्व किया।

चित्र 2
चित्रा 2:। 125 मैं लेबल Acyl ghrelin के क्षालन प्रोफाइल मानव रक्त में स्टैंडर्ड या तेजी से रक्त प्रसंस्करण radiolabeled पेप्टाइड निम्न मानक प्रक्रिया या तेजी से विधि के अनुसार मानव रक्त को जोड़ा गया और संसाधित किया गया था। बाद में, सतह पर तैरनेवाला एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ पर लोड किया गया था। eluate कर्नल थाहर मिनट lected और रेडियोधर्मिता के लिए गिना। तेजी से प्रसंस्करण के बाद पेप्टाइड की उम्मीद है और समय पर eluted की सबसे अधिक है, मानक के बाद एक बड़े पहले eluted अनुपात को संसाधित करते समय, सबसे अधिक संभावना desacyl ghrelin का प्रतिनिधित्व। संक्षिप्त:। सीपीएम, प्रति मिनट मायने रखता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

त्वरित रक्त प्रसंस्करण Acyl / Desacyl Ghrelin अनुपात और वृद्धि की अंतर्जात Kisspeptin रक्त के स्तर में परिणाम प्रोसेसिंग मानक की तुलना में बढ़ाता है।
रक्त anorexic, सामान्य वजन और मोटापे से ग्रस्त विषयों से वापस ले लिया और मानक या तेजी से प्रक्रिया के अनुसार कार्रवाई की गई थी। अंतर्जात ghrelin (कुल और एसाइल ghrelin) radioimmunoassay द्वारा मूल्यांकन किया गया था। मानवशास्त्रीय और comorbidities / अध्ययन समूह की दवा टेबल्स 3 और 4 में दिखाया जाता है। तेजी से प्रसंस्करण के बाद सामान्य वजन विषयों के रक्त में एसाइल / desacyl ghrelin अनुपात 1: 3 मानक रक्त प्रोसेसिंग (पी = 0.03, चित्रा 3 ए) के बाद 1:23 की तुलना में। (: 3 बनाम 1:19, पी <0.001 1) और मोटापे से ग्रस्त की स्थिति इसी तरह के परिणाम anorexic के तहत मनाया गया (1: 3 बनाम 01:13; पी = 0.04, चित्रा 3 ए।)। कोई मतभेद मानक या तेजी से प्रसंस्करण (चित्रा 3) के लिए तीन अलग-अलग समूहों के बीच मनाया गया। दो तरह से एनोवा, प्रसंस्करण विधि के फ्लोरिडा uence में एक उल्लेखनीय फाई खिचड़ी भाषा (एफ 1,64 = 15.3, पी <0.001) ने संकेत दिया है, जबकि शरीर के वजन / चयापचय हालत कोई प्रभाव नहीं पड़ा (एफ 2,64 = 0.5, पी = 0.62)।

टेबल तीन

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परिसंचारी अंतर्जात kisspeptin स्तर, काफी अधिक anorexic में मानक प्रोसेसिंग (+ 60%, पी = 0.02) और सामान्य वजन विषयों (+ 99%, पी = 0.02) की तुलना में तेजी से पीछा कर रहे थे, जबकि अंतर (मोटापा की शर्तों के तहत महत्व नहीं पहुँची 23%, पी = 0.39, चित्रा 3 बी)। कोई महत्वपूर्ण मतभेद तीन अलग-अलग बीएमआई समूहों के बीच मनाया गया (p> 0.05, चित्रा 3 बी)। दो तरह से एनोवा प्रसंस्करण विधि के फ्लोरिडा uence में एक उल्लेखनीय फाई खिचड़ी भाषा (एफ 1,74 = 10.8, पी = 0.002) ने संकेत दिया है, जबकि शरीर के वजन / चयापचय हालत कोई प्रभाव नहीं पड़ा (एफ 2,74 = 0.5, पी = 0.60)।

चित्र तीन चित्रा 3: परिसंचारी Acyl / Desacyl Ghrelin अनुपात और निम्नलिखित विभिन्न चयापचय की स्थिति के तहत Kisspeptin स्तर परिसंचारी तेजी से या मानक रक्त प्रसंस्करण रक्त एक रात में तेजी के बाद anorexic, सामान्य वजन या मोटापे से ग्रस्त विषयों से वापस ले लिया और मानक प्रक्रिया या तेजी से विधि के अनुसार कार्रवाई की गई थी।। सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था और एसाइल के साथ ही कुल ghrelin स्तर या kisspeptin स्तर (बी) radioimmunoassay द्वारा मूल्यांकन। Desacyl ghrelin कुल ghrelin से एसाइल घटाकर द्वारा प्राप्त किया गया था। अनुपात desacyl ghrelin (ए) द्वारा एसाइल विभाजित करके गणना की गई। समूह आकार कॉलम के तल पर संकेत दिया है। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। * पी <0.05, ** पी <0.01 और *** पी <0.001 बनाम। मानक प्रसंस्करण। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

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Discussion

हम जानते हैं कि रक्त के प्रसंस्करण के लिए तेजी से विधि 11/12 पेप्टाइड्स के लिए वसूली में सुधार चूहों 6 में मानक रक्त प्रसंस्करण की तुलना में पहले की सूचना दी। वर्तमान अध्ययन में पता चला है कि हम इस पद्धति का भी मनुष्यों में उपयोग के लिए उपयुक्त है। तेजी से प्रसंस्करण के बाद, परीक्षण के 9 9 125 मैं लेबल पेप्टाइड्स के लिए वसूली मानक रक्त प्रोसेसिंग (बर्फ पर EDTA रक्त) की तुलना में सुधार हुआ है। मनाया सुधार 19-39% है जो प्रासंगिक हो सकता है, खासकर जब पेप्टाइड की उपज कम है नकाबपोश जा सकता है जो की स्थिति जब केवल सूक्ष्म अंतर उम्मीद कर रहे हैं के तहत संभावना है से लेकर।

हम यह भी पता चला है कि बाद तेजी से रक्त प्रसंस्करण ghrelin सही आणविक फॉर्म (एसाइल ghrelin) का संकेत है, जबकि मानक रक्त प्रसंस्करण के बाद 2/3 ghrelin desacyl को अपमानित कर रहे हैं एचपीएलसी के बाद सही क्षालन स्थिति में पाया जाता है। चूंकि एसाइल समूह ghrelin रिसेप्टर 28 को बाध्य करने के लिए आवश्यक है, घई-acylation बहुत पेप्टाइड की जैविक समारोह को बदलने की उम्मीद है। हालांकि, यह भी desacyl ghrelin तेजी से एक जैविक रूप से सक्रिय पेप्टाइड 29 के रूप में मान्यता प्राप्त है। दिलचस्प बात यह है desacyl ghrelin के रूप में भोजन का सेवन 30 या colonic गतिशीलता 31 के लिए पहले दिखाया ghrelin के प्रभाव प्रतिक्रिया करने के लिए सुझाव दिया गया था। यह आगे सही आणविक प्रपत्र की जांच के महत्व पर प्रकाश डाला गया।

जब सामान्य वजन विषयों में kisspeptin की अंतर्जात स्तर का अध्ययन, हम मानक रक्त प्रसंस्करण की तुलना में तेजी से निम्न काफी वृद्धि हुई स्तर (+ 99%) दिखाया। हालांकि, कोई सुधार नहीं मोटापे की स्थिति है, जो समग्र वृद्धि kisspeptin स्तर के कारण हो सकता है के तहत मनाया गया था (मोटे बनाम में 50%। सामान्य वजन)। रक्त में बीएमआई समूह (एनोरेक्सिया नर्वोसा, सामान्य वजन और मोटापे) या तो विधि, कोई महत्वपूर्ण मतभेद मनाया गया के साथ कार्रवाई की है जो इस तथ्य के कारण हो सकता है के बीच है कि केवल उपवास का स्तर werई का आकलन किया। मतभेद स्पष्ट postprandially, एक परिकल्पना है कि भविष्य के अध्ययनों में जांच की जानी चाहिए हो सकता है।

Kisspeptin बर्फ 32 पर केवल EDTA ट्यूब का उपयोग अध्ययन में पहले मापा गया है या प्रोटीज अवरोधकों 33 के अलावा द्वारा (वर्तमान अध्ययन में मानक के रूप में प्रसंस्करण के लिए कहा गया है)। वर्तमान अध्ययन के आधार पर ट्यूबों के द्रुतशीतन पेप्टाइड गिरावट को रोकने के लिए पर्याप्त नहीं है। अकेले अम्लीकरण या एकल प्रोटीज अवरोधकों kisspeptin संरक्षित करने के लिए पर्याप्त हैं कि क्या भविष्य के अध्ययनों में जांच की जानी चाहिए।

इसी तरह, तेजी से प्रसंस्करण भी अंतर्जात एसाइल ghrelin की उपज के रूप में एक बहुत बढ़ एसाइल / desacyl ghrelin अनुपात से संकेत दिया बढ़ जाती है (1: 3) मानक रक्त प्रोसेसिंग (1:23) की तुलना में। तेजी से प्रसंस्करण से पहले (1:19 मानक प्रसंस्करण के बाद की तुलना में) के बाद 5: जहां हम 1 के एक एसाइल / desacyl ghrelin अनुपात सूचना यह निष्कर्ष कृंतक पढ़ाई के साथ अच्छा सामंजस्य से पता चलता है।01:55 34,35 को 1:15 एसाइल / desacyl ghrelin अनुपात से पहले सूचना की व्यापक श्रृंखला इसलिए सबसे अधिक संभावना एक de-acylation निर्भर desacyl ghrelin के उच्च अनुपात के कारण थे। Kisspeptin के लिए ऊपर वर्णित के रूप में, एसाइल / desacyl ghrelin अनुपात का कोई परिवर्तन लंबे समय बदल शरीर के वजन (एनोरेक्सिया नर्वोसा बनाम। सामान्य वजन बनाम। मोटापा) के अलग अलग परिस्थितियों में मनाया गया। यह भी सच है कि एसाइल / desacyl ghrelin का केवल उपवास का स्तर का मूल्यांकन किया गया है और भोजन के बाद विनियमन ज्यादा महत्वपूर्ण है की वजह से हो सकता है। दूसरी ओर यह भी इंगित करता है कि लंबे समय से बदल शरीर के वजन के बावजूद एसाइल और desacyl ghrelin के अनुपात में बेसल शर्तों के तहत नहीं बदला जाता है और इन परिस्थितियों में मनाया अनुकूली परिवर्तन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा नहीं सकता है। हालांकि, भविष्य मानकीकृत भोजन प्रोटोकॉल का उपयोग और तेजी से विधि को लागू करने के अध्ययन के आगे इस सवाल का जवाब देने में मदद मिलेगी।

त्वरित मेरेThod निम्नलिखित घटकों का उपयोग करता है: के बाद से रासायनिक प्रतिक्रियाओं ज्यादातर तापमान 36 तापमान की कमी एक ठंडा समाधान का उपयोग करने पर निर्भर पेप्टाइड की गिरावट धीमा। अगले, यह भी पीएच (अम्लीकरण) में कमी गिरावट 37 की गति कम हो जाती है। इसके अलावा, पीएच में कमी के अन्य सतहों के लिए पेप्टाइड्स के सोखना कम हो जाती है और इसलिए भी पेप्टाइड नुकसान के जोखिम को कम करता है। (। उदाहरण के cathepsin बी / एच): प्रोटीज यहां इस्तेमाल अवरोधकों आदेश अंतर्जात peptidases की एक व्यापक स्पेक्ट्रम को कवर करने के लिए चुने गए हैं thiol proteases के लिए एक अवरोध के रूप में dipeptidyl पेप्टिडेज़ चतुर्थ, ई-64-डी के एक अवरोध के रूप में diprotin ए, के रूप में antipain trypsin, papain और cathepsin ए / बी के लिए एक अवरोध करनेवाला, काइमोट्रिप्सिन, papain और cathepsin बी / जी के लिए एक अवरोध के रूप में ट्रिप्सिन, plasmin, papain और cathepsin और chymostatin के लिए एक अवरोध के रूप में leupeptin। इसके अलावा, समस्थानिक पेप्टाइड्स आदेश विधि द्वारा वसूली के सुधार का आकलन करने में उपयोगी होते हैं। अन्त में, दर ओ के रूप मेंएफ एंजाइम सब्सट्रेट जटिल गठन एंजाइम (पेप्टिडेज़) की एकाग्रता पर निर्भर करता है और सब्सट्रेट (पेप्टाइड हार्मोन) प्लाज्मा के 38 कमजोर पड़ने गठन की दर कम कर देता है और इसलिए गिरावट (एक दस गुना कमजोर पड़ने की दर एक सौ गुना Michaelis के अनुसार कम कर देता है -Menten कैनेटीक्स)।

तेजी से विधि के फायदे के बावजूद, विधि के कई सीमाओं के रूप में अच्छी तरह से स्वीकार किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम का समय है। रक्त के नमूने तुरंत रक्त वापसी जो नैदानिक ​​सेटिंग में मुश्किल हो सकता है के बाद तेजी से बफर में पतला होना चाहिए। इसके अलावा, विधि अधिक समय लगता है, प्रशिक्षण के एक उच्च स्तर की आवश्यकता है और यह भी मानक रक्त प्रसंस्करण से ज्यादा महंगा है। हालांकि यह नैदानिक ​​दिनचर्या में लागू करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, यह अनुसंधान प्रयोजनों के लिए उपयोगी हो जाएगा, खासकर जब केवल सूक्ष्म अंतर उम्मीद कर रहे हैं और इसलिए पेप्टाइड का एक उच्च उपज वांछनीय है।

हालांकि तेजी से विधि का वर्णन किया है और अपने सभी घटकों के साथ की सिफारिश की है (आर educed तापमान, ए cidification, पी निषेध rotease, मैं exogenous नियंत्रण और डी ilution sotopic) वर्तमान पत्र में, भविष्य के अध्ययन के लिए इस तकनीक का उपयोग कर सकते हैं संशोधनों। समस्थानिक बहिर्जात नियंत्रण का उपयोग अनिवार्य है और इसलिए आदेश का आकलन करने के लिए जो पेप्टाइड्स तेजी से प्रसंस्करण का उपयोग कर वसूली में सबसे बड़ी सुधार दिखा में पायलट अध्ययन करने के लिए प्रतिबंधित नहीं किया जा सकता। इसके अलावा, यह भी protease अवरोध कॉकटेल की रचना जब अन्य पेप्टाइड्स मूल्यांकन कर रहे हैं संशोधित किया जा सकता है। बहरहाल, यह जब एक नई पेप्टाइड मापा जाता है परीक्षण किया जाना चाहिए।

सारांश में, रक्त प्रसंस्करण के तेजी से विधि मानव रक्त के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और बहुत 9/9 पेप्टाइड्स मानक रक्त प्रसंस्करण की तुलना में परीक्षण किया की वसूली में सुधार हुआ। कुछ पेप्टाइड्स वसूली के उदारवादी सुधार करने के लिए केवल एक छोटा सा के लिए के बाद से मनाया गया, आवश्यकताविधि की जब एक नई पेप्टाइड विश्लेषण किया जाता है परीक्षण किया जा करने के लिए हो सकता है। इसके अलावा, तेजी से विधि के रूप में एसाइल ghrelin के लिए दिखाया गया है और यह भी काफी अंतर्जात घूम मानक रक्त प्रसंस्करण की तुलना में इस तरह के रूप में kisspeptin पेप्टाइड्स के स्तर की पैदावार बढ़ जाती है सही आणविक फार्म का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इसलिए, इस विधि पेप्टाइड स्तरों घूम, जैसे आकलन मानव अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण होना चाहिए। भूख और तृप्ति के नियमन में शामिल लोगों को।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा जर्मन रिसर्च फाउंडेशन STE 1765 / 3-1 (एएस) और शिक्षा और अनुसंधान 03IPT614A (सीजी) के लिए जर्मन मंत्रालय का समर्थन किया था। हम संगठन और मानवशास्त्रीय माप के निष्पादन के साथ मदद के लिए उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए रेइनहार्ड Lommel और पेट्रा BUSSE के साथ ही करीन जोहानसन और क्रिस्टीना Hentzschel धन्यवाद

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Diprotin A Peptides International, Louisville, KY, USA IDP-4132
E-64-d Peptides International, Louisville, KY, USA IED-4321-v
Antipain Peptides International, Louisville, KY, USA IAP-4062
Leupeptin Peptides International, Louisville, KY, USA ILP-4041
Chymostatin Peptides International, Louisville, KY, USA ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges Waters Corporation, Milford, MA, USA WAT051910 360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin Millipore, Billerica, MA, USA 9088-HK Radioactive
GLP-1 Millipore, Billerica, MA, USA 9035-HK Radioactive
Glucagon Millipore, Billerica, MA, USA 9030 Radioactive
Insulin Millipore, Billerica, MA, USA 9011S Radioactive
Leptin Millipore, Billerica, MA, USA 9081-HK Radioactive
Kisspeptin-10 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-048-56 Radioactive
Nesfatin-1 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-003-26 Radioactive
PYY3-36 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-059-02  Radioactive
Somatostatin-28 Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA T-060-16  Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 822700-902 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC  Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA # RK-048-56 Radioactive
Total ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRT-89HK  Radioactive
Active ghrelin RIA Millipore, Billerica, MA, USA # GHRA-88HK Radioactive
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA online download

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References

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रक्त प्रसंस्करण के लिए एक तेजी से विधि मानव रक्त में प्लाज्मा पेप्टाइड स्तर की पैदावार बढ़ाने के लिए
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Teuffel, P., Goebel-Stengel, M.,… More

Teuffel, P., Goebel-Stengel, M., Hofmann, T., Prinz, P., Scharner, S., Körner, J. L., Grötzinger, C., Rose, M., Klapp, B. F., Stengel, A. A RAPID Method for Blood Processing to Increase the Yield of Plasma Peptide Levels in Human Blood. J. Vis. Exp. (110), e53959, doi:10.3791/53959 (2016).

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