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Developmental Biology

छवि Zebrafish आँख विकास के लिए प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Published: April 10, 2016 doi: 10.3791/53966
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2,3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2HHMI Janelia Research Campus, 3Berlin Institute of Medical Systems Biology of the Max Delbrück Center
* These authors contributed equally

Introduction

Morphogenesis प्रक्रिया है कि भ्रूण को आकार और एक साथ वृद्धि और भेदभाव के साथ एक परिपक्व बहुकोशिकीय जीव में एक निषेचित अंडे से ontogeny ड्राइव है। पशु विकास के दौरान morphogenetic प्रक्रियाओं बरकरार रहने वाले नमूनों 1-3 की इमेजिंग द्वारा सबसे अच्छा विश्लेषण किया जा सकता है। इसका कारण यह है इस तरह पूरे भ्रूण इमेजिंग सभी घटक है कि ड्राइव और संकेतन अणुओं की ढ़ाल, बाह्य मैट्रिक्स, वाहिका, तंत्रिका वितरण के साथ ही आसपास के ऊतकों के यांत्रिक गुणों सहित विकास को विनियमित को बरकरार रखता है। तराजू, जिस पर morphogenesis होता है पाटने के लिए, तेजी से subcellular घटनाओं घंटे या दिनों में पूरे ऊतक के विकास के संदर्भ में एक मिनट के समय के पैमाने पर कब्जा कर लिया जाना है। इन सभी आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, orthogonal विमान रोशनी माइक्रोस्कोप 5 का एक आधुनिक कार्यान्वयन 4 विकसित किया गया था। मूल रूप से, यह चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआई नामित किया गया थाएम) 4; अब एक सब को गले लगाते अवधि प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) आम तौर पर प्रयोग किया जाता है। जबकि लेजर स्कैनिंग या कताई डिस्क confocal सूक्ष्मदर्शी 6.7 की तुलना में कम phototoxicity उत्प्रेरण LSFM उच्च समय संकल्प पर इमेजिंग सक्षम बनाता है। आजकल, वहाँ पहले से ही बुनियादी प्रकाश शीट रोशनी सिद्धांत के कई कार्यान्वयन कर रहे हैं और यह छवि के नमूनों और प्रक्रियाओं को पहले से शोधकर्ताओं ने 8-11 के लिए दुर्गम की एक विशाल विविधता के लिए इस्तेमाल किया गया है।

हम पहले पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण पर LSFM के कई महत्वपूर्ण लाभ उजागर करना चाहते हैं:

लाइव इमेजिंग सूक्ष्म प्रयोगों से सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि अवलोकन केवल न्यूनतम नमूना प्रभावित करता है। हालांकि, zebrafish सहित कई जीवों बहुत लेजर प्रकाश जोखिम के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, phototoxicity एफई के बिना उच्च समय संकल्प के साथ एक confocal खुर्दबीन में यह उन्हें छवि के लिए चुनौतीपूर्ण बनाठप या देरी विकास 6.7 तरह fects। LSFM वर्तमान नमूना 7 पर कम से कम विघटनकारी प्रभाव के साथ प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक है। चूंकि पतली लेजर प्रकाश चादर नमूना है कि एक विशेष समय बिंदु पर imaged है का ही हिस्सा illuminates, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप बहुत कुशलता फोटॉनों का उपयोग कर रहा है। नतीजतन, कम प्रकाश जोखिम स्वस्थ नमूनों की लंबी समय चूक टिप्पणियों, जैसे 12-17 के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, LSFM की न्यूनतम invasiveness के लिए धन्यवाद, अधिग्रहीत छवियों की संख्या अब कोई कितना प्रकाश नमूना बर्दाश्त कर सकते हैं, बल्कि द्वारा कितना डेटा संसाधित और संग्रहित किया जा सकता निर्धारित होता है।

निकट शारीरिक स्थितियों में रखने का नमूना ही लाइनों के साथ, LSFM विकल्प नमूना बढ़ते रणनीतियों अच्छी तरह से जीने के लिए अनुकूल भ्रूण के साथ आता है। LSFM तकनीक में, भ्रूण आम तौर पर कम प्रतिशत agarose की एक पतली स्तंभ के भीतर एम्बेडेड रहे हैं। mountinagarose सिलेंडरों में जी रोटेशन की पूर्ण स्वतंत्रता के लिए अनुमति देता है, तो नमूना सही कोण से देखा जा सकता है और साथ ही साथ कई दृश्य से (में LSFM दृश्य के रूप में करने के लिए कहा गया है)। MultiView इमेजिंग और बाद MultiView संलयन बड़े, बिखरने नमूनों के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है और उन्हें उच्च, isotropic संकल्प के साथ कब्जा करने की अनुमति देता है। अन्य संभावित LSFM बढ़ते रणनीतियों का एक सारांश अधिकारी माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग मैनुअल में पाया जा सकता है, नमूना तैयार ई रेनौड की प्रयोगशाला द्वारा लिखित पर अध्याय में। यह एक सिफारिश पढ़ा है, लक्ष्य की तुलना में यहाँ वर्णित छवि अलग नमूने लिए है, खासकर अगर।

LSFM में छवि अधिग्रहण के रूप में लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के लिए विरोध के व्यापक क्षेत्र है, कैमरा आधारित है। यह एक उच्च संकेत से प्राप्त कर लिया छवियों के लिए शोर अनुपात (SNR) में यह परिणाम है और बहुत तेजी से हो सकता है (फ्रेम प्रति सेकंड की सैकड़ों करने के लिए दसियों) कर सकते हैं। LSFM की उच्च संवेदनशीलता आगे कमजोर फ्लोरोसेंट samp की इमेजिंग सक्षम बनाता हैलेस, अंतर्जात स्तर 18 या निकट भविष्य में कम से व्यक्त प्रतिलेखन कारक की तरह, अंतर्जात प्रोटीन CRISPR का उपयोग कर / Cas9 चिह्नित। उच्च SNR भी सफल नीचे की ओर छवि विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। उच्च गति न केवल तेजी से intracellular प्रक्रियाओं पर कब्जा करने की आवश्यकता है, लेकिन यह भी छवि के लिए काफी तेजी से कई विचार से पूरे भ्रूण। कई बार देखा की एक सहज संलयन ही प्राप्त किया जा सकता है, तो मनाया घटना अलग विचारों से आ रही इन कई जेड के ढेर के अधिग्रहण के दौरान बदल नहीं है।

LSFM के फायदे के लिए आम तौर पर छवि गुणवत्ता की कीमत पर नहीं आते हैं। LSFM के पार्श्व संकल्प एक confocal खुर्दबीन के संकल्प की तुलना में थोड़ा भी बदतर है। इसका कारण यह है पता लगाने LSFM में इस्तेमाल उद्देश्यों को कम संख्यात्मक एपर्चर (आमतौर पर 1.0 या उससे कम) मानक confocal setups पर पानी या सिलिकॉन विसर्जन उद्देश्यों के 1.2-1.3 की तुलना की है। इसके अतिरिक्त, LSFM में विस्तृत क्षेत्र का पता लगाने (के कारण Absenएक पिनहोल के सीई), वहाँ एक confocal खुर्दबीन की तुलना में और अधिक जानकारी का ध्यान केंद्रित प्रकाश है। बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश की मात्रा प्रकाश शीट मोटाई से निर्धारित होता है। फिर भी, इन नुकसान LSFM में उच्च SNR द्वारा मुआवजा दिया जाता है। अभ्यास में, इस उदाहरण के लिए डिस्क confocal अधिग्रहण 15 कताई की तुलना में समान गुणवत्ता छवियों में यह परिणाम है। नतीजतन, इस कोशिका झिल्ली या नाभिक, जैसे जैसी सुविधाओं के विश्वसनीय निकासी के लिए सक्षम बनाता है, सेल वंश अनुरेखण 15,19 के लिए।

LSFM का अक्षीय संकल्प का पता लगाने के उद्देश्य के अलावा निर्धारित किया जाता है, प्रकाश शीट मोटाई से। कुछ मामलों में LSFM कर सकते हैं का अक्षीय संकल्प confocal सूक्ष्मदर्शी के संकल्प को पार। सबसे पहले, संकल्प में सुधार आता है, जब प्रकाश शीट का पता लगाने के उद्देश्य है, जो आम तौर पर बड़े एक कम बढ़ाई उद्देश्य के साथ imaged नमूनों के लिए होता है की अक्षीय संकल्प की तुलना में पतली है। दूसरा तरीका, कैसे LSFM ach कर सकते हैंबेहतर अक्षीय संकल्प ieve, MultiView संलयन, जिसमें अलग अलग विचार से उच्च XY संकल्प जानकारी एक छवि ढेर में संयुक्त है। जिसके परिणामस्वरूप विलय कर दिया ढेर एक isotropic संकल्प पार्श्व दिशा 20,21 में संकल्प के मूल्यों के करीब पहुंच गया है। इस आलेख में वर्णित एक दूसरे पर कई विचार पंजीकरण के लिए रणनीति नमूना 20,21 के आसपास agarose में एम्बेडेड प्रत्ययी मार्कर के रूप में फ्लोरोसेंट polystyrene मोती के प्रयोग पर आधारित है।

LSFM व्यावसायीकरण का एक परिणाम के रूप में, इस तकनीक अब वैज्ञानिकों ने 22 वर्ष की एक व्यापक समुदाय के लिए उपलब्ध है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल लिखने के लिए प्रेरणा इस प्रौद्योगिकी LSFM में व्यावहारिक अनुभव की कमी विकासात्मक जीव के लिए सुलभ बनाने के लिए और इन वैज्ञानिकों ने अपने नमूनों के साथ इस तकनीक का उपयोग शुरू कर दिया है। हमारी प्रोटोकॉल वाणिज्यिक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप, जो एक धारणात्मक साधारण माइक्रोस्कोप टी गठन का उपयोग करता हैटोपी संचालित करने के लिए आसान है। हम इसके अतिरिक्त घर में निर्मित LSFM setups, जो विशेष रूप से सवाल जवाब करने के लिए 23-25 ​​उपयुक्त हो सकता है के साथ zebrafish इमेजिंग के लिए अन्य हाल प्रोटोकॉल का उल्लेख करना चाहूंगा। LSFM के लिए एक और प्रविष्टि विकल्प खुले प्लेटफार्म 26,27, जो एक व्यापक समुदाय के लिए प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी लाने के लिए खुला पहुँच सिद्धांतों का उपयोग कर रहे हैं। हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर दोनों पहलुओं के दस्तावेज http://openspim.org और https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ पर पाया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हम LSFM के साथ विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में teleost zebrafish का उपयोग करें। zebrafish आँख की Morphogenesis एक उदाहरण है कि LSFM के लाभ के कई रेखांकित करता है। LSFM पहले से ही medaka 28 में और zebrafish 29,30 में आंख विकास की जांच करने के लिए अतीत में इस्तेमाल किया गया है। आंख के विकास के प्रारंभिक चरण में यह पारंपरिक माइक्रोस्कोपी के लिए सही ढंग से भ्रूण ग्रहण करने के लिए जटिल है,भारी जर्दी के रूप में भ्रूण अपनी आंख उद्देश्य का सामना करना पड़ के साथ कंधे पर झूठ बोलने के लिए अनुमति नहीं है। हालांकि, LSFM एक agarose स्तंभ में बढ़ते के साथ, नमूना reproducibly तैनात किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ऑप्टिक कप चरण के लिए ऑप्टिक पुटिका से संक्रमण के दौरान, आंख प्रमुख मॉर्फ़ोजेनेटिक विकास है, जो एक बड़ी Z ढेर और देखने का एक बड़ा क्षेत्र पर कब्जा करने की आवश्यकता के साथ rearrangements आए। इसके अलावा इन चुनौतियों के लिए LSFM पारंपरिक confocal इमेजिंग के लिए बेहतर है। ऑप्टिक कप गठन की प्रक्रिया तीन आयामी है, इसलिए यह समझना और एक दृश्य से इमेजिंग द्वारा पूरी तरह कल्पना करना मुश्किल है। इस isotropic संकल्प के साथ MultiView इमेजिंग फायदेमंद बनाता है। ऑप्टिक कप गठन के बाद, रेटिना तेजी से लेजर जोखिम के प्रति संवेदनशील हो जाता है। इस प्रकार, कम LSFM के साथ जुड़े phototoxicity लंबी अवधि इमेजिंग के लिए एक बड़ा फायदा है।

यहाँ हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल एक से तीन दिन की इमेजिंग के लिए पुराने zebrafish एक भ्रूण पेशआंख के विकास पर ध्यान देने के साथ एन डी लार्वा। हमारे विधि समय चूक उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ 12-14 मानव संसाधन तक को कवर फिल्मों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, हम भी, डाटा प्रोसेसिंग, जो LSFM में एक आवश्यक कदम है के लिए एक पाइप लाइन दिखाने के रूप में इस तकनीक को सदा ही, बड़े डेटासेट उत्पन्न अक्सर टेराबाइट रेंज में।

Protocol

नोट: सभी जानवर काम यूरोपीय संघ (ईयू) के निर्देश 2011/63 / यूरोपीय संघ और जर्मन पशु कल्याण अधिनियम के अनुसार में प्रदर्शन किया गया था। प्रोटोकॉल, बिना किसी रुकावट के लिए पीछा किया जा करने के लिए नमूना इमेजिंग के लिए बढ़ते से मतलब है। व्यावहारिक अनुभव पर निर्भर करता है, यह 2-3 मानव संसाधन लेने के लिए एक समय चूक प्रयोग शुरू करने के लिए होगा। डाटा प्रोसेसिंग इस समय गणना में शामिल नहीं है। सभी प्रयोग के लिए आवश्यक सामग्री सामग्री की सूची है कि एक अनुपूरक दस्तावेज़ के रूप में प्रदान की जाती है शुरू करने से पहले की जरूरत में पाया जा सकता है। चरण 1, 2, 3 और 4 कदम 2, 3, 4 के लिए और के प्रोटोकॉल अधिकारी भी माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग मैनुअल को देखें 5 दौरान पाउडर मुक्त दस्ताने पहनें।

1. इमेजिंग प्रयोग से पहले प्रारंभिक कार्य

  1. फ्लोरोसेंट मनका स्टॉक समाधान
    1. इस प्रोटोकॉल के लिए, 500 या 1000 एनएम व्यास polystyrene मोती लाल (उत्सर्जन फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल) का उपयोग करें। मोतियों का काम कर रहे कमजोर पड़ने 1: 4,000. पहले, भंवर 1 मिनट के लिए मनका शेयर समाधान। DDH 2 ओ के 990 μl में मोतियों की 10 μl पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में समाधान की दुकान है और यह 1 का उपयोग करें: 1:40 में आगे कमजोर पड़ने के लिए शेयर समाधान के रूप में 100 के कमजोर पड़ने।
  2. नमूना कक्ष के लिए समाधान की तैयारी
    1. एक 100 मिलीलीटर बीकर मिश्रण methylene नीले बिना E3 के माध्यम से 38.2 मिलीलीटर, 10 मिमी एन -phenylthiourea का 0.8 मिलीग्राम और 1 0.4 मिलीलीटर% एमएस-222 में। यह फ़िल्टर E3 के माध्यम का उपयोग करने के लिए बाद में नमूना कक्ष में तैरते धूल के छोटे कणों या undissolved क्रिस्टल से बचने के लिए फायदेमंद है।
  3. फ्लोरोसेंट मछली भ्रूण चयन
    1. दिन प्रयोग करने से पहले, फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त भ्रूण तैयार करते हैं। प्रयोग से पहले ठीक है, फ्लोरोसेंट संकेत के वांछनीय ताकत के लिए फ्लोरोसेंट स्टिरियोस्कोप के तहत भ्रूण तरह। 5-10 स्वस्थ भ्रूण ले लो और चिमटी का उपयोग कर उन्हें Dechorionate।
      नोट: इस प्रोटोकॉल 16-72 वर्ष मानव संसाधन के लिए अनुकूलित हैभ्रूण।

2. नमूना कक्ष की स्थापना

  1. तीन चैंबर विंडोज कोडांतरण
    1. वहाँ नमूना कक्ष में 4 खिड़कियां, उद्देश्य के लिए एक और तीन coverslips के साथ सील किया जा करने के लिए (18 मिमी व्यास, मोटाई 0.17 मिमी चयनित) कर रहे हैं। 70% इथेनॉल में इन coverslips स्टोर। उन्हें ईथर के साथ उपयोग करने से पहले साफ साफ कर लें: इथेनॉल (1: 4)।
    2. ठीक संदंश का उपयोग विंडो में coverslip डालें और यकीन है कि यह छोटी से छोटी नाली में फिट बैठता है। 17 मिमी व्यास रबर O- अंगूठी के साथ कवर और कक्ष की खिड़की उपकरण का उपयोग कर रोशनी एडाप्टर रिंग में पेंच। अन्य दो खिड़कियों के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
  2. शेष चैंबर पार्ट्स संलग्न
    1. चैम्बर के चौथे शेष पक्ष में एक उचित उद्देश्य के लिए एडाप्टर भाड़ में। एडाप्टर के केंद्र में 15 मिमी व्यास हे अंगूठी डालें।
    2. चा में निचले सही खोलने में सफेद luer ताला एडाप्टर में पेंचmber और ऊपरी बाएँ खोलने में ग्रे नाली कनेक्टर। काले अंधा प्लग के साथ सभी तीन शेष उद्घाटन ब्लॉक।
    3. Peltier ब्लॉक और चैम्बर एक एलन रिंच का उपयोग करने का धातु सामंजस्य स्थापित स्लाइड नीचे संलग्न। Luer ताला एडाप्टर के लिए 50 मिलीलीटर सिरिंज के साथ नली देते हैं। कक्ष में तापमान जांच डालें।
  3. माइक्रोस्कोप में उद्देश्य और चैंबर डालने
    1. स्टिरियोस्कोप कि सभी उद्देश्यों को साफ कर रहे हैं के तहत की जाँच करें। 10X / 0.2 रोशनी के उद्देश्यों और योजना Apochromat 20X / 1.0 डब्ल्यू का पता लगाने के उद्देश्य का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि अपनी अपवर्तनांक सुधार कॉलर पानी के लिए 1.33 के लिए सेट है। माइक्रोस्कोप में पता लगाने के उद्देश्य भाड़ में, कवर रोशन उद्देश्यों को ध्यान में रखते हुए, जबकि।
    2. रोशन उद्देश्यों को कवर सुरक्षात्मक प्लास्टिक की टोपियां निकालें। ध्यान से माइक्रोस्कोप में चैम्बर स्लाइड और हासिल पेंच के साथ यह कस लें।
    3. कनेक्ट तापमान समर्थकहो सकता है और माइक्रोस्कोप के साथ Peltier ब्लॉक।
      नोट: दो ट्यूबों कि Peltier ब्लॉक के लिए ठंडा तरल प्रसारित दोनों कनेक्टर्स के साथ संगत कर रहे हैं। वे एक कार्य सर्किट कनेक्शन के उन्मुखीकरण के भले के रूप में।
    4. चैम्बर खिड़कियों के ऊपरी किनारे करने के लिए 1.2 चरण में तैयार समाधान के साथ सिरिंज के माध्यम से चैम्बर भरें। जाँच करें कि चैम्बर लीक नहीं है।
    5. माइक्रोस्कोप, ऊष्मायन और नियंत्रित करने और भंडारण कंप्यूटर को प्रारंभ करें। माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें और 28.5 डिग्री सेल्सियस तापमान ऊष्मायन निर्धारित किया है।
      नोट: यह 1 घंटा लेने के लिए पूरी तरह से संतुलित करने के लिए होगा। इस बीच में नमूना तैयार करें।

3. नमूना तैयार

  1. Agarose मिक्स तैयारी
    1. agarose मिश्रण के लेने से पहले 15 मिनट, एक हीटिंग 70 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट ब्लॉक में एक 1 मिलीलीटर 1% की विभाज्य कम पिघलने बिंदु agarose (E3 के माध्यम में भंग) पिघला। एक बार agarose पूरी तरह से मोल हैदस, एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 600 μl हस्तांतरण E3 के माध्यम से 250 μl, 0.4% MS-222 के 50 μl और vortexed मनका शेयर समाधान के 25 μl जोड़ें।
      नोट: इस मिश्रण के 925 μl, जबकि अतिरिक्त 75 μl तरल भ्रूण के साथ बाद में एक साथ जोड़ लिए गणना की है बनाता है।
    2. 38-40 डिग्री सेल्सियस पर एक दूसरे हीटिंग ब्लॉक में ट्यूब रखें या यह सुनिश्चित करें कि agarose इसे में नमूना भ्रूण डालने से पहले अपने बीच बढ़िया तालमेल बात करने के लिए बहुत करीब है।
  2. भ्रूण बढ़ते
    1. (एक काला निशान के साथ, ~ 1 मिमी भीतरी व्यास) 20 μl मात्रा के पांच कांच केशिकाओं ले लो और उन्हें मिलान में Teflon टिप plungers डालें। केशिका के माध्यम से सवार धक्का इतना है कि Teflon टिप केशिका के नीचे स्थित है।
    2. स्थानांतरण पांच भ्रूण (एक संख्या है कि एक बार में रखा जा सकता है) एक गिलास या vortexed 37 डिग्री सेल्सियस गर्म agarose मिश्रण की ट्यूब में प्लास्टिक विंदुक के साथ।
      नोट: तरल एक साथ बुद्धि की एक न्यूनतम मात्रा पर ले जाने की कोशिशज भ्रूण।
    3. इस मिश्रण में डालें और केशिका सवार को खींच कर अंदर एक भ्रूण चूसना। सुनिश्चित करें कि भ्रूण के सिर पूंछ से पहले केशिका प्रवेश करती है। सवार और नमूना के बीच किसी भी हवाई बुलबुले से बचें। वहाँ ± 2 भ्रूण ऊपर agarose की सेमी और यह नीचे ± 1 सेमी होना चाहिए। शेष भ्रूण के लिए दोहराएँ।
    4. जब तक agarose पूरी तरह से solidifies रुको, जो कुछ ही मिनटों के भीतर होता है और फिर, E3 के माध्यम में नमूनों की दुकान उन्हें प्लास्टिसिन या टेप के साथ एक बीकर की दीवार से चिपके द्वारा। केशिका के नीचे खुलने के समाधान के लिए नमूना गैस विनिमय अनुमति देने में मुक्त फांसी दी जानी चाहिए।
      नोट: वर्गों 3.1 और 3.2 के लिए एक समान प्रोटोकॉल भी OpenSPIM विकी पेज http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation पर पाया जा सकता है।

4. नमूना पोजिशनिंग

  1. नमूना धारक विधानसभा
    1. (काला) सही आकार के 2 प्लास्टिक आस्तीन डालेंनमूना धारक स्टेम में एक दूसरे के खिलाफ। उनका भट्ठा पक्षों बाहर सामना करना पड़ता है। यह 2-3 दौर मोड़ से शिथिल दबाना पेंच संलग्न। दबाना पेंच के माध्यम से केशिका डालें और धारक के माध्यम से धक्का जब तक काले रंग बैंड दूसरी तरफ दिखाई हो जाता है। सवार को छूने से बचें।
    2. दबाना पेंच कस। केशिका के बाहर भ्रूण नीचे agarose से अधिक 1 सेमी पुश और यह कटौती। नमूना धारक डिस्क में स्टेम डालें।
    3. सॉफ्टवेयर है कि खुर्दबीन मंच लोड की स्थिति में है, में की पुष्टि करें। मार्गदर्शक रेल का प्रयोग माइक्रोस्कोप में खड़ी नीचे की तरफ नमूने के साथ पूरे धारक फिसलना। यह बारी है, तो उस स्थिति में चुंबकीय धारक डिस्क ताले।
  2. केशिका लगाने
    1. अब से, सॉफ्टवेयर द्वारा नमूना स्थिति को नियंत्रित। पता लगाएँ टैब में चयन केशिका विकल्प का पता लगाने और सिर्फ पता लगाने वस्तु ऊपर एक्स, वाई में केशिका और ध्यान में Z स्थितिIve लेंस। मार्गदर्शन के लिए नमूना नाविक में चित्रमय प्रतिनिधित्व का प्रयोग करें।
    2. केशिका के बाहर धीरे भ्रूण पुश जब तक यह पता लगाने के उद्देश्य की पुतली के सामने है।
      नोट: 'पता केशिका' शेष प्रोटोकॉल, जिसके दौरान माइक्रोस्कोप के ऊपरी ढक्कन खोला जाना चाहिए और नमूना बाहर धक्का दे दिया में ही कदम है।
  3. नमूना लगाने
    1. 'पता नमूना' विकल्प के लिए स्विच और 0.5 ज़ूम पर देखने के क्षेत्र के केंद्र में zebrafish आँख लाने के लिए। भ्रूण घुमाएँ, ताकि प्रकाश चादर नमूना के किसी भी अत्यधिक अपवर्तनांक या अवशोषित भागों के माध्यम से पारित नहीं होगा पहले यह आंख तक पहुँचता है। इसी तरह, उत्सर्जित प्रतिदीप्ति नमूना के बाहर एक स्पष्ट पथ की जरूरत है। पर 'सेट घर की स्थिति' पर क्लिक करें।
    2. माइक्रोस्कोप के सामने का दरवाजा खुला और कक्ष वाष्पीकरण से बचने के लिए की चोटी पर एक 3 मिमी खोलने के साथ प्लास्टिक कवर डाल दिया।
      ध्यान दें: तरल स्तर नीचे चला जाता हैइमेजिंग स्तर, प्रयोग समझौता हो जाएगा।
    3. समग्र स्वास्थ्य के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में भ्रूण के दिल की धड़कन की जाँच करें। यदि यह भी धीमी है, एक और नमूना का उपयोग (गैर घुड़सवार नियंत्रण करने के लिए की तुलना; विशिष्ट मूल्यों विकास मंच पर निर्भर करती है)। अंतिम ज़ूम सेटिंग के लिए स्विच और भ्रूण की स्थिति को बदल डालना।

5. एक बहुआयामी अधिग्रहण की स्थापना

  1. अधिग्रहण पैरामीटर
    1. 'अधिग्रहण' टैब में स्विच करें। लेजर लाइनों, पता लगाने के उद्देश्य, लेजर अवरुद्ध फिल्टर, बीम फाड़नेवाला और कैमरों सहित प्रकाश पथ को परिभाषित करें।
    2. चेकबॉक्स धुरी स्कैन सक्रिय करें। थोड़ी गहराई, छवि प्रारूप, प्रकाश शीट मोटाई जैसे अन्य अधिग्रहण सेटिंग्स को परिभाषित करने और एक तरफा रोशनी चुनें।
    3. प्रेस 'सतत' और प्राप्त छवि की तीव्रता के आधार पर लेजर शक्ति और कैमरे के जोखिम समय बदल जाते हैं।
      नोट: एडजस्ट करने के लिए सभी इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग लेसलेजर पावर (100 मेगावाट लेजर, 30 मिसे जोखिम समय के 0.5%), वास्तविक प्रयोग के लिए की तुलना में नमूना करने के लिए अनावश्यक तस्वीर नुकसान से बचने के लिए।
  2. प्रकाश शीट समायोजन
    1. 'दोहरी तरफा रोशनी' और करने के लिए स्विच 'ऑनलाइन दोहरी पक्ष Fusio'n चेकबॉक्स को सक्रिय करें। 'Lightsheet जादूगर ऑटो समायोजित' की शुरुआत करें। कदम से कदम निर्देश का पालन करें।
      ध्यान दें: जादूगर का पता लगाने के उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ में प्रकाश चादर ले जाता है, और यह सुनिश्चित करता है कि यह झुका हुआ नहीं है और अपनी कमर को देखने के क्षेत्र के केंद्र में है। स्वत: समायोजन खत्म करने के बाद छोड़ दिया और सही प्रकाश शीट के पदों पर स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर में नवीनीकृत कर रहे हैं। छवि गुणवत्ता में सुधार अभी स्पष्ट होना चाहिए। 'जेड ढेर' चेकबॉक्स को सक्रिय करें।
    2. बात फैल समारोह (पीएसएफ) xz और yz ऑर्थो दृश्य में फ्लोरोसेंट मोती के द्वारा दिए गए समरूपता का निरीक्षण द्वारा प्रकाश चादर समायोजन की जाँच करें। कोई अगर ऐसा हैटी सममित, मैन्युअल ऊपर और नीचे एक सममित hourglass आकार का पीएसएफ (चित्रा 1 ए) को प्राप्त करने के लिए जब तक प्रकाश शीट पैरामीटर स्थिति को समायोजित।
  3. बहुआयामी अधिग्रहण सेटिंग्स
    1. 'पहला टुकड़ा' और 'आखिरी टुकड़ा' विकल्पों के साथ जेड ढेर परिभाषित करें और 1 माइक्रोन को जेड कदम निर्धारित किया है।
      नोट: इस माइक्रोस्कोप में प्रकाश चादर स्थिर है और जेड सेक्शनिंग के माध्यम से नमूना ले जाकर हासिल की है। हमेशा जेड के ढेर के तेजी से अधिग्रहण के लिए 'सतत ड्राइव' विकल्प का उपयोग करें।
    2. 'टाइम' सीरीज चेकबॉक्स को सक्रिय करें। समय अंक की कुल संख्या और उन दोनों के बीच में अंतराल को परिभाषित करें।
    3. 'मल्टीव्यू' चेकबॉक्स को सक्रिय करें। MultiView सूची, जहां एक्स, वाई, जेड और कोण जानकारी संग्रहित है में वर्तमान दृश्य जोड़े। केशिका बारी बारी से और अन्य वांछित विचारों को परिभाषित करने के लिए मंच नियंत्रक का प्रयोग करें। प्रत्येक दृश्य में एक z ढेर सेट करें और उन्हें MultiView सूची में जोड़ें।
      ध्यान देंइतना है कि केशिका unidirectionally कर दिया है, जबकि छवि अधिग्रहण कर लिया है सॉफ्टवेयर एक सीरियल फैशन में विचारों तरह।
  4. बहाव सुधार और प्रयोग शुरू
    1. एक बार अधिग्रहण की स्थापना पूरा हो गया है, वास्तविक प्रयोग शुरू करने से पहले 15-30 मिनट इंतज़ार करो।
      नोट: नमूना शुरू में एक्स, वाई और जेड में कुछ माइक्रोमीटर drifts, लेकिन 30 मिनट के भीतर बंद कर देना चाहिए। नमूना समय के लिए बहती रहती है, तो एक और नमूना या गोड़ा का उपयोग करें।
    2. 'स्ट्रीमिंग' विकल्प 'बनाए रखें' टैब के लिए और में स्विच कैसे परिभाषित डेटा बचाया जाना चाहिए, जैसे, प्रत्येक दृश्य और चैनल के लिए समय बिंदु या अलग फाइल प्रति एक फ़ाइल। , वापस 'अधिग्रहण' टैब पर जाएं प्रेस 'आरंभ प्रयोग' और फ़ाइल नाम, स्थान, जहां इसे बचाया जाना चाहिए और फ़ाइल स्वरूप (प्रयोग .czi) को परिभाषित।
    3. पहली बार बिंदु के अधिग्रहण का निरीक्षण करें कि सब कुछ flawlessly चल रहा है इस बात की पुष्टि करने के लिए। इसके तत्काल पंजीकरण के साथ आगे बढ़नाऔर कदम 6 और 7 में वर्णित के रूप में पहली बार बिंदु के संलयन, पुष्टि करने के लिए कि यह पूरे डाटासेट संसाधित करने के लिए संभव हो जाएगा।

6. मल्टीव्यू पंजीकरण

  1. मल्टीव्यू पुनर्निर्माण आवेदन
    1. इमेजिंग सत्र के अंत में, एक डाटा प्रोसेसिंग कंप्यूटर के लिए माइक्रोस्कोप पर डेटा भंडारण कंप्यूटर से डाटा हस्तांतरण। 'MultiView का प्रयोग करें ReconstructionApplication '20,21,31 डाटा प्रोसेसिंग के लिए फिजी 32 (चित्रा 1 बी) में लागू किया है।
  2. डेटासेट को परिभाषित करें
    1. अद्यतन फिजी: फिजी> मदद> अद्यतन ImageJ और फिजी> मदद> अद्यतन फिजी। मुख्य ImageJ और फिजी अद्यतन साइटों का उपयोग करें।
    2. एक फ़ोल्डर में पूरे डाटासेट स्थानांतरण। परिणाम और प्रसंस्करण के मध्यवर्ती फ़ाइलें इस फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा। शुरू MultiView पुनर्निर्माण आवेदन: फिजी> प्लगइन्स> मल्टीव्यू पुनर्निर्माण> Multiviईडब्ल्यू पुनर्निर्माण आवेदन।
    3. 'एक नया डाटासेट को परिभाषित' का चयन करें। डाटासेट के प्रकार के रूप Meu विकल्प "जीस Lightsheet Z.1 डेटासेट (लोकी Bioformats)" का चयन करें और एक्सएमएल फ़ाइल के लिए एक नाम बनाने के लिए। तब डाटासेट (सूचकांक बिना यानी फ़ाइल) के पहले .czi फ़ाइल का चयन करें। यह छवि डेटा के रूप में अच्छी तरह के रूप में रिकॉर्डिंग के मेटाडाटा शामिल हैं।
      नोट: एक बार कार्यक्रम के पहले .czi फाइल को खोलता है, मेटाडाटा कार्यक्रम में लोड कर रहे हैं।
    4. कि कोण, चैनल, illuminations की संख्या की पुष्टि करें और मेटाडाटा से voxel आकार निरीक्षण करते हैं। ठीक दबाने पर, खुले तीन अलग-अलग खिड़कियां (चित्रा 1 सी) का निरीक्षण: एक लॉग खिड़की, प्रसंस्करण और उसके परिणामों, 'ViewSetup एक्सप्लोरर' और एक सांत्वना की प्रगति दिखा रहा है, फिजी की त्रुटि संदेश दिखा।
      नोट: 'ViewSetup एक्सप्लोरर' एक उपयोगकर्ता के अनुकूल इंटरफेस है कि प्रत्येक दृश्य, चैनल और रोशनी दिखाता है और के चयन के लिए अनुमति देता है ब्याज की फ़ाइलें। इसके अतिरिक्त, 'ViewSetup एक्सप्लोरर' सभी प्रसंस्करण कदम के स्टीयरिंग के लिए अनुमति देता है।
    5. फ़ाइलों संसाधित करने की आवश्यकता और एक्सप्लोरर में सही माउस बटन दबाएँ कि चयन करें। एक खिड़की के विभिन्न प्रसंस्करण कदम (चित्रा 1 सी) के साथ खुला का निरीक्षण करें।
    6. डाटासेट को परिभाषित करने पर, कि निरीक्षण डेटा के साथ फ़ोल्डर में एक एक्सएमएल फ़ाइल बनाई गई है।
      नोट: इस फाइल मेटाडाटा है कि इससे पहले इस बात की पुष्टि किए गए है।
    7. शीर्ष दाएं कोने में दो बटन 'जानकारी' का पालन और 'बचाने'। 'जानकारी' दबाने एक्सएमएल फ़ाइल की सामग्री का एक सारांश प्रदर्शित करता है। दबाने 'बचाने' के प्रसंस्करण के परिणामों की बचत होगी।
      नोट: 'MultiView पुनर्निर्माण आवेदन' विभिन्न प्रसंस्करण कदम की जरूरत में प्रसंस्करण फिजी बंद करने से पहले एक्सएमएल में बचाया जा रहा है।

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चित्रा 1: मल्टीव्यू पुनर्निर्माण कार्यप्रवाह और ब्याज बिंदु का पता लगाने (ए) प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट मनका इमेजिंग के आधार पर संरेखण।। प्रणाली, (बीच में) गठबंधन जब मनका की छवि xz और yz अनुमानों में एक सममित hourglass आकार दिया जाता है। या तो दिशा में misaligned प्रकाश शीट का उदाहरण छोड़ दिया और सही पर दिखाए जाते हैं। xz में एक 500 एनएम मनका की अधिकतम तीव्रता अनुमानों, yz और xy कुल्हाड़ियों दिखाए जाते हैं। ध्यान दें कि पक्ष पालियों को हवादार डिस्क (XY में) के केंद्रीय चोटी की तीव्रता के अनुपात से अधिक है, जब lightsheet सही ढंग से misaligned स्थिति की तुलना में गठबंधन किया है। छवियाँ 0.7 ज़ूम पर 20X / 1.0 डब्ल्यू उद्देश्य के साथ ले जाया गया। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) डाटासेट में परिभाषित किया जाता है और फिर HDF5 प्रारूप में resaved। मोती खंडित होते हैं और उसके बाद दर्ज की गई। एक समय श्रृंखला के लिए हर समय बिंदु के लिए एक संदर्भ बिंदु समय पर पंजीकृत है। डेटा अंत में एक में जुड़े हुए हैंएकल isotropic मात्रा। (सी, ऊपर) ViewSetup एक्सप्लोरर अलग अलग समय बिंदुओं, कोण, चैनलों और डाटासेट की रोशनी पक्षों से पता चलता है। (सी, निचले कोने बाएं) BigDataViewer खिड़की का मानना ​​है कि ViewSetup एक्सप्लोरर में चयन किया जाता है पता चलता है। (सी, मध्य दाएं) सही ViewSetup एक्सप्लोरर में क्लिक प्रसंस्करण विकल्प खुल जाता है। (सी, सही निचले कोने) प्रगति और प्रसंस्करण के परिणामों को लॉग फ़ाइल में प्रदर्शित कर रहे हैं। (डी और ई) का पता लगाने के उद्देश्य के लिए संभव के रूप में नमूना यहाँ इंटरैक्टिव मनका विभाजन से स्क्रीनशॉट के रूप में दिखाया गया के रूप में छोटा पता लगाने के साथ खंड के रूप में कई ब्याज अंक (मोती) है। (डी और ई, ऊपरी बाएँ कोने) विभाजन दो मापदंडों, सिग्मा -1 और सीमा के लिए अंतर-की-गाऊसी मूल्यों से परिभाषित किया गया है। (डी) एक सही ढंग से पता चला मनका के एक बढ़ाया दृश्य के साथ एक सफल पता लगाने का एक उदाहरण है। (ई) के लिए भी कई झूठी सकारात्मक है और एक भी मनका के कई पता लगाने के साथ विभाजन। (सी) में स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. HDF5 प्रारूप में डेटासेट resave
    1. पूरे डाटासेट resave के लिए, Ctrl / एप्पल + एक और सही क्लिक के साथ सभी फ़ाइलों का चयन करें। तब resave डाटासेट का चयन करें और HDF5 के रूप में।
    2. एक विंडो एक चेतावनी है कि वर्तमान डाटासेट के सभी विचारों resaved हो जाएगा प्रदर्शित दिखाई देगा। प्रेस हां।
      नोट: कार्यक्रम हर फ़ाइल खोलने और HDF5 प्रारूप के विभिन्न स्तरों संकल्प resaving द्वारा HDF5 को .czi फ़ाइलें resave के लिए जारी रहेगा। साथ पूरा होने पर 'किया' यह पुष्टि करेगा। usuall resavingY timepoint प्रति कुछ मिनट लगते हैं (1 टेबल देखें)।
      नोट: चूंकि HDF5 प्रारूप में फाइल को बहुत तेजी से लोड किया जा सकता है, यह अब संभव एक्सप्लोरर में 'ठीक क्लिक करें' और toggling द्वारा अपंजीकृत डाटासेट देखने के लिए 'BigDataViewer में प्रदर्शन (/ बंद)' है। एक BigDataViewer खिड़की चयनित दृश्य (चित्रा 1 सी) के साथ दिखाई देंगे। BigDataViewer 33 के मुख्य कार्य तालिका 2 और http://fiji.sc/BigDataViewer में समझाया जाता है।
  2. ब्याज अंक का पता लगाने
    1. Ctrl / एप्पल + एक सब समय के साथ अंक का चयन करें और सही क्लिक करें ब्याज अंक का पता लगाने।
    2. अंतर-की-गाऊसी का चयन 34 ब्याज बिंदु का पता लगाने के प्रकार के लिए। मनका-आधारित पंजीकरण यहाँ लेबल ब्याज अंक के लिए क्षेत्र में, प्रकार "मोती" का इस्तेमाल किया जाता है के बाद से। सक्रिय करें 'विभाजन से पहले छवियों downsample'।
    3. अगली विंडो में, Det निरीक्षणection सेटिंग्स। 'सब-पिक्सेल स्थानीयकरण' उपयोग '3-आयामी द्विघात फिट' के लिए 34 और मनका विभाजन का उपयोग 'i'nterest बिंदु के निर्देशन में' इंटरएक्टिव 'के लिए अंतर-की-गाऊसी मूल्यों और त्रिज्या निर्धारित करने के लिए।
    4. 'Downsample XY' उपयोग 'मैच जेड संकल्प (कम downsampling)' और 'downsample जेड' 1 * प्रयोग के लिए। जेड कदम आकार XY पिक्सेल आकार से भी बड़ा है, इस प्रकार बस नीचे XY मैच के लिए जेड संकल्प पर्याप्त है नमूना। 'सीपीयू (जावा) पर गणना' का चयन करें। दबाबो ठीक'।
    5. एक पॉप अप विंडो में, ड्रॉप डाउन मेनू से मानकों को परीक्षण के लिए एक दृश्य का चयन करें। एक बार दृश्य भार, चमक और फिजी के साथ खिड़की के विपरीत> छवि को समायोजित> समायोजित> चमक / विपरीत या Ctrl + Shift + सी टिक बॉक्स मनका पता लगाने के लिए 'Maxima (हरा) के लिए देखो'।
    6. aroun 'viewSetup' के रूप में हरी छल्ले में विभाजन का निरीक्षणघ पता लगाने Maxima और minima के लिए लाल रंग के लिए जब लग रही है। विभाजन दो मापदंडों, सिग्मा 1 के लिए अंतर-की-गाऊसी मूल्यों और थ्रेसहोल्ड (चित्रा -1) द्वारा परिभाषित किया गया है। उन्हें खंड नमूना आसपास के रूप में कई मोती और संभव (चित्रा -1) के रूप में नमूना भीतर के रूप में कुछ झूठी सकारात्मक पता लगाने के लिए समायोजित करें। केवल एक बार और नहीं कई बार (चित्रा 1E) प्रत्येक मनका का पता लगाने। इष्टतम मापदंडों का निर्धारण करने के बाद, प्रेस 'किया'।
      ध्यान दें: पता लगाने के समय बिंदु के प्रत्येक व्यक्ति के दृश्य लोड हो रहा है और मोतियों के विभाजन से शुरू होता है। लॉग फ़ाइल में, इस कार्यक्रम के मोती यह देखने के प्रति पता चला की संख्या outputs। पता लगाने के कुछ ही सेकंड में किया जाना चाहिए (1 टेबल देखें)।
    7. प्रेस (कई हजार देखने के प्रति 600) बचाने के लिए जब पता लगाने की राशि उचित है।
      ध्यान दें: एक फ़ोल्डर डेटा निर्देशिका में बनाया जाएगा, जो informatio में शामिल होंगेपता चला मोतियों की निर्देशांक के बारे में एन।
  3. ब्याज अंक का उपयोग कर रजिस्टर
    1. Ctrl / एप्पल के साथ हर समय अंक का चयन एक +, ठीक क्लिक करें और चुनें 'रजिस्टर ब्याज अंक का उपयोग कर'।
    2. 'पंजीकरण एल्गोरिथ्म' के रूप में मनका पता लगाने के लिए 'तेजी से 3 डी ज्यामितीय हैशिंग (रोटेशन अपरिवर्तनीय)' का प्रयोग करें।
      ध्यान दें: इस एल्गोरिथ्म एक दूसरे के लिए सम्मान के साथ अभिविन्यास और विभिन्न विचारों की स्थिति के बारे में कोई पूर्व ज्ञान हो जाती है।
    3. एक दूसरे पर विचारों के पंजीकरण के लिए, 'रजिस्टर timepoints व्यक्तिगत रूप से' 'पंजीकरण के प्रकार' के रूप में चयन करें। चयनित चैनल में 'ब्याज अंक' के लिए ब्याज अंक के लिए पहले से निर्दिष्ट लेबल अब दिखाई (यानी "मोती") होना चाहिए।
    4. अगली विंडो में, पंजीकरण के लिए पूर्व निर्धारित मूल्यों का उपयोग करें। चयन करके पहला दृश्य फिक्स 'फिक्स टाइल्स: पहला टाइल और उपयोग वापस नक्शा नहीं है फिक्स' (तिल, तो इस का उपयोगतों 'वापस टाइल्स नक्शा' खंड में तय नहीं कर रहे हैं)।
    5. 'नियमितीकरण' के साथ 'एक affine परिवर्तन मॉडल' का प्रयोग करें।
      नोट: RANSAC के लिए अनुमति दी त्रुटि को 5px होगी और वह 'एक वर्णनकर्ता मैच के लिए महत्व' 10 'नियमितीकरण' 0.10 की एक लैम्ब्डा, जिसका मतलब है कि परिवर्तन के लिए 10% कठोर और 90 के साथ एक 'कठोर मॉडल' का उपयोग के लिए किया जाएगा % affine 35। प्रेस ठीक पंजीकरण शुरू करने के लिए।
      नोट: के रूप में लॉग विंडो में प्रदर्शित किया, पहले प्रत्येक दृश्य के अन्य सभी विचारों के साथ मिलान किया जाता है। फिर यादृच्छिक नमूना आम सहमति (RANSAC) 36 पत्राचार का परीक्षण करती है और झूठी सकारात्मक शामिल नहीं है। एक मजबूत पंजीकरण के लिए, RANSAC मूल्य 90% से अधिक होना चाहिए। जब दो विचारों के बीच इसी सच उम्मीदवारों के लिए पर्याप्त संख्या में पाए जाते हैं, एक परिवर्तन मॉडल पिक्सल में औसत विस्थापन के साथ प्रत्येक मैच के बीच गणना की जाती है। फिर चलने का वैश्विक अनुकूलन किया जाता है और सभी विचारों है तय दृश्य पर पंजीकृत हैं। सफल पंजीकरण के साथ, एक परिवर्तन मॉडल की गणना की और इसकी स्केलिंग और पिक्सेल में विस्थापन के साथ प्रदर्शित किया जाता है। औसत त्रुटि 1 बेहतर नीचे पिक्सल और परिवर्तन करने के लिए 1. बंद पंजीकरण सेकंड (1 टेबल देखें) में मार डाला है की स्केलिंग होना चाहिए।
    6. पुष्टि के रूप में नमूना भीतर ठीक संरचनाओं पर मनाया अलग अलग विचारों के बीच कोई बदलाव, जैसे कोशिका झिल्ली नहीं है। फिर एक्सएमएल फ़ाइल में प्रत्येक दृश्य के लिए परिवर्तन को बचाने के।
      नोट: अब पंजीकृत विचारों BigDataViewer (2A चित्रा) में एक दूसरे अतिव्यापी हैं और मनका छवियों के रूप में अच्छी तरह से overlaying किया जाना चाहिए (चित्रा 2 बी)।
    7. समय अंक सही उन पर क्लिक करें का चयन करके परिवर्तनों निकालें और फिर परिवर्तनों हटाये> नवीनतम / नवीनतम परिवर्तन का चयन करें।

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चित्रा 2:। MultiView पुनर्निर्माण के परिणाम (ए) पंजीकृत विचार, एक अलग रंग में प्रत्येक मढ़ा उन दोनों के बीच ओवरलैप प्रदर्शित करने के लिए। (बी) के अलग अलग विचार से imaged मोतियों की PSFs के ओवरलैप दिखा दृश्य बढ़ाया। (सी) बंद संलयन के बाद एक मनका के ऊपर, पीएसएफ विभिन्न विचारों का एक औसत है। (डी) के बाद MultiView deconvolution दिखा रहा है कि पीएसएफ एक बिंदु में गिर में (सी) के रूप में ही मनका के पीएसएफ। (ई) XY अनुभाग और (एफ) एक ऑप्टिक पुटिका, जिसमें झिल्ली के ऊतकों में गहरी Z में संकेत के GFP दिखा गिरावट के साथ चिह्नित कर रहे हैं की एक ही दृश्य की yz अनुभाग। (G) XY अनुभाग और (एच) yz लगभग 20 डिग्री के अलावा 4 विचारों की भारित औसत संलयन से थोड़ा अधिक degra के साथ के बाद एक ही दृश्य की धारासमग्र देद XY संकल्प लेकिन वृद्धि Z संकल्प। (मैं) XY अनुभाग और (जे) yz MultiView deconvolution के बाद ही डेटा की धारा, संकल्प और दोनों XY में और जेड में संकेत के विपरीत में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखा। (ईजे) में छवियां एक ऑप्टिकल स्लाइस हैं। स्केल पट्टी का प्रतिनिधित्व करता है 50 माइक्रोन (ए, बी, ईजे) और 10 माइक्रोन (सी, डी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. समय चूक पंजीकरण
    1. पूरे समय चूक का चयन करें, ठीक क्लिक करें और चुनें समय से अधिक समय व्यतीत हो जाने के स्थिर करने के लिए 'ब्याज अंक का उपयोग कर रजिस्टर'।
    2. में 'बुनियादी पंजीकरण पैरामीटर खिड़की पंजीकरण के प्रकार के लिए एक संदर्भ बिंदु समय के खिलाफ मैच (कोई वैश्विक अनुकूलन) का चयन करें। Ke ईपी टी वह अन्य व्यक्ति समय अंक के पंजीकरण के रूप में ही सेटिंग्स।
    3. अगलेखिड़की का चयन करें, समय बिंदु एक संदर्भ, समय चूक के बीच में आम तौर पर एक समय बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। बॉक्स टिक, 'कठोर इकाई के रूप में प्रत्येक timepoint पर विचार' के बाद से हर समय बिंदु के भीतर अलग-अलग विचारों को पहले से ही एक दूसरे पर पंजीकृत हैं।
    4. 'शो timeseries आँकड़े' के लिए बॉक्स को टिक करें। अन्य पंजीकरण मापदंडों के नियमितीकरण सहित पहले के रूप में रहते हैं। प्रेस ठीक है।
      नोट: लॉग विंडो में, एक ही उत्पादन अलग-अलग समय बिंदु पंजीकरण के रूप में प्रदर्शित किया जाएगा। अलग-अलग समय बिंदुओं के लिए पंजीकरण सफल और मजबूत था, तो RANSAC अब 99-100% और औसत, न्यूनतम और अधिकतम त्रुटि आमतौर पर 1 px नीचे है। आगे बढ़ने से पहले इस पंजीकरण की बचत करें।

7. मल्टीव्यू फ्यूजन

नोट: पंजीकरण कदम से उत्पन्न परिवर्तनों कई विचार के बाहर एक दूसरे से जुड़ने isotropic ढेर गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह स्टैक हा, मूल डेटा की तुलना में जेड स्लाइस की संख्या में वृद्धि हुई है क्योंकि Z रिक्ति अब XY में मूल पिक्सेल आकार के बराबर है। फ्यूजन या तो एक सामग्री आधारित MultiView संलयन 21,31 या Bayesian आधारित MultiView deconvolution 31 है, जो दोनों MultiView पुनर्निर्माण आवेदन में लागू कर रहे हैं के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है।

  1. बंद डब्बा
    नोट: फ्यूजन एक computationally महंगी प्रक्रिया (1 टेबल देखें), इस प्रकार परिभाषित एक bounding बॉक्स में काफी प्रसंस्करण की गति बढ़ जाती है से डेटा की मात्रा को कम करने के लिए है।
    1. सभी समय अंक ठीक क्लिक करें और परिभाषित 'bounding बॉक्स' का चयन चयन करें। का प्रयोग करें 'BigDataViewer साथ परिभाषित' और bounding बॉक्स के लिए एक नाम का चयन।
    2. ब्याज के क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए अक्ष और फिर 'ठीक' प्रेस 'मिनट' और हर में 'मैक्स' के लिए स्लाइडर ले जाएँ। bounding बॉक्स के मापदंडों को प्रदर्शित किया जाएगा।
      नोट: bounding बॉक्स के भीतर सब कुछ शामिल होंगेहरे बॉक्स है कि एक पारदर्शी मैजेंटा परत के साथ मढ़ा है।
  2. सामग्री आधारित मल्टीव्यू फ्यूजन
    नोट: सामग्री-आधारित MultiView फ्यूजन 21 के बजाय एक साधारण औसत का उपयोग करने की बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए खाते में ढेर पर छवि गुणवत्ता मतभेद (यानी Z में सिग्नल की गिरावट) लेता है और उच्च भार लागू होता है।
    1. समय बिंदु (s) है कि 'ViewSetup एक्सप्लोरर' में जुड़े हुए किया जाना चाहिए का चयन करें, ठीक क्लिक करें और चुनें 'छवि संलयन / Deconvolution'।
    2. छवि संलयन विंडो में, ड्रॉप डाउन मेनू से 'भारित औसत फ्यूजन' का चयन करें, और चुनें 'bounding बॉक्स के लिए पूर्व निर्धारित bounding बॉक्स का उपयोग करें'। चुनिंदा जुड़े हुए छवि के उत्पादन के लिए, जो पहले से ही HDF5 मौजूदा फाइल करने के लिए नए HDF5 फ़ाइलों लिखते हैं और एक साथ पंजीकृत unfused विचारों और जुड़े छवि का उपयोग की अनुमति देता है 'वर्तमान एक्सएमएल परियोजना को जोड़ें'। दबाबो ठीक'।
    3. तो फिर 'में पूर्व परिभाषित bounding बॉक्स & #39; पॉप अप विंडो पहले से परिभाषित bounding बॉक्स के नाम का चयन करें और 'ठीक' दबाएँ।
    4. अगले विंडो में bounding बॉक्स के मापदंडों को ध्यान से देखें। त्वरित संलयन के लिए, इनकार डाटासेट पर एक नीचे नमूना लागू होते हैं।
      नोट: जुड़े हुए ढेर एक निश्चित आकार से ऊपर है, तो प्रोग्राम एक अधिक कुशल स्मृति 'ImageLib2 containe'r उपयोग करने की सिफारिश करेंगे। 'ArrayImg' से 'PlanarImg (बड़े छवियों को प्रदर्शित करने के लिए आसान) या CellImg (बड़े चित्र)' कंटेनर, जो बड़े डेटा की प्रोसेसिंग अनुमति देने के लिए स्विच करें। अन्यथा पूर्वनिर्धारित सेटिंग्स का उपयोग करें और लागू होते हैं 'सम्मिश्रण और सामग्री आधारित फ्यूजन'। दबाने 'ठीक है' से आगे बढ़ें।
    5. अगले विंडो में HDF5 सेटिंग्स का निरीक्षण करें। पूर्वनिर्धारित मानकों को प्रयोग करें और संलयन की प्रक्रिया शुरू करते हैं। सुनिश्चित करें कि फिजी में पर्याप्त स्मृति सौंपा गया है बनाओ संपादित करें> विकल्प> मेमोरी और धागे।
  3. मल्टीव्यू Deconvolution
    ध्यान दें: मल्टीव्यू Deconvolution 31 anot हैMultiView संलयन की उसे लिखें। यहाँ फ्यूजन करने के लिए इसके अतिरिक्त, इमेजिंग प्रणाली का पीएसएफ आदेश छवि और उपज में वृद्धि हुई संकल्प और संकेत के विपरीत deconvolve करने में ध्यान में रखा जाता है (चित्रा -2 सी-जम्मू, चित्रा 5 और मूवी 3 में तुलना में)।
    1. समय बिंदु (s) deconvolved जा करने के लिए चयन करें, ठीक क्लिक करें और प्रेस 'छवि संलयन / Deconvolution'।
    2. 'मल्टीव्यू Deconvolution' और उपयोग 'पूर्व निर्धारित bounding बॉक्स और वर्तमान एक्सएमएल परियोजना को संलग्न' का चयन करें। bounding बॉक्स का चयन करें और जारी रखें।
      नोट: deconvolution के लिए पूर्व निर्धारित मापदंडों का एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। पहले परीक्षण के उपयोग '20 पुनरावृत्तियों के लिए डिबग मोड '' और का उपयोग करके deconvolution के प्रभाव का आकलन '। अंत करने के लिए 512 x 512 x 512 ब्लॉकों पर गणना की स्थापना की।
    3. अगली विंडो में, पूर्व निर्धारित सेटिंग्स का उपयोग करें। परिणाम हर '5 ite प्रदर्शित करने के लिए' डिबग मोड 'सेटराशन '।
      नोट: deconvolution के उत्पादन में 32-बिट डेटा है, लेकिन BigDataViewer वर्तमान में केवल 16-बिट डेटा का समर्थन करता है। आदेश में मौजूदा HDF5 डाटासेट को deconvolution के उत्पादन में संलग्न करने के लिए, यह 16 बिट करने के लिए परिवर्तित किया जाना है।
    4. रूपांतरण के लिए, चलाने के 'पहली छवि का न्यूनतम / अधिकतम उपयोग करें (समय के साथ तीव्रता तर हो सकता है)।
      ध्यान दें: deconvolution तो छवियों को लोड और उन्हें deconvolution के लिए तैयारी से शुरू होगा।
  4. BigDataServer
    1. बहुत बड़े एक्सएमएल साझा करने के लिए / HDF5 डेटासेट HTTP सर्वर BigDataServer 33 का उपयोग करें। सेटअप करने के लिए कैसे और इस तरह के सर्वर से कनेक्ट करने के लिए एक परिचय http://fiji.sc/BigDataServer पर पाया जा सकता है।
    2. एक मौजूदा BigDataServer खुला फिजी> प्लगइन्स> BigDataViewer> BrowseBigDataServer से कनेक्ट करने के लिए।
    3. विंडो में बंदरगाह सहित URL दर्ज करें।
      नोट: सिनेमा इस प्रकाशन में वर्णित इस विज्ञापन के माध्यम से सुलभ हैंपोशाक: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
    4. एक खिड़की उपलब्ध फिल्मों के चयन की अनुमति देता है कि निरीक्षण करें। डबल BigDataViewer खिड़की खोलने के लिए और के रूप में पहले से वर्णित डेटा को देखने के लिए क्लिक करें।

पूरक: सामग्री की चेकलिस्ट शुरू करने से पहले की जरूरत

  • zebrafish भ्रूण / लार्वा फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त (methylene नीले रंग के बिना zebrafish E3 के माध्यम में भ्रूण रखें। चरणों के लिए 24 घंटा से अधिक पुराने 0.2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीटीयू जोड़कर रंजकता प्रतिक्रिया।)
  • फ्लोरोसेंट स्टिरियोस्कोप
  • केशिकाओं (20 μl मात्रा, एक काला निशान के साथ) और उचित plungers (केशिकाओं पुनः प्रयोग न करें। plungers, दूसरे हाथ पर, कई प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है।)
  • 1.5 मिलीलीटर प्लास्टिक की ट्यूब
  • तेज चिमटी
  • ग्लास (आग पॉलिश) या प्लास्टिक pipettes (प्लास्टिक 24 घंटा और पुराने भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)
  • कांच या प्लास्टिक के बर्तन व्यास 60 मिमी (प्लास्टिक हो सकता है24 घंटा और पुराने भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया)
  • दो 100 मिलीलीटर बीकर
  • निषेचन के लिए 150 सेमी विस्तार नली के साथ 50 मिलीलीटर luer ताला सिरिंज (नली और सिरिंज प्रयोगों सूक्ष्मजीवों द्वारा संक्रमण से बचने के लिए बीच में पूरी तरह से सूखा रखा जाना चाहिए।)
  • प्लास्टिसिन
  • कम पिघलने बिंदु (एलएमपी) agarose
  • E3 के माध्यम (5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी MgSO 4)
  • MS-222 (Tricaine)
  • phenylthiourea (पीटीयू)
  • फ्लोरोसेंट microspheres (यहां मोती के रूप में करने के लिए कहा गया है)
  • दोहरा आसुत एच 2 ओ (DDH 2 हे)

Representative Results

LSFM तराजू भर में विकास की प्रक्रिया इमेजिंग के लिए एक आदर्श तरीका है। कई आवेदन यहाँ दिखा intracellular संरचना, साथ ही कोशिकाओं और ऊतकों की पूरी दोनों छोटी और लंबी अवधि इमेजिंग संकलित कर रहे हैं। इन उदाहरणों को भी दिखाना है कि LSFM एक उपयोगी रेटिना में न्यूरोजेनेसिस के लिए ऑप्टिक कप गठन से आंख विकास के विभिन्न चरणों में उपकरण है। फिल्म 1, सामान्य LSFM दृष्टिकोण का एक उदाहरण के रूप में कार्य करता पहली दिखाने में एक अक्षुण्ण भ्रूण की एक बाहर तेजी से बढ़ी देखें brightfield में agarose सिलेंडर embedding और बाद में प्रतिदीप्ति चैनल में रेटिना की एक विस्तृत दृश्य दिखा।

फिल्म 1
फिल्म 1:। Zebrafish रेटिना के LSFM LSFM दृष्टिकोण उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, इस फिल्म brightfield कि भ्रूण के अंदर बरकरार imaged है में पहली से पता चलता हैप्रतिदीप्ति करने के लिए स्विच करने से पहले सिलेंडर garose। बाद में यह दिखाया गया है कि देखने के बड़े क्षेत्र पूरे रेटिना के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है। इसके बाद, फिल्म अच्छी subcellular संकल्प को उजागर करने के लिए रेटिना के एक बढ़ाया छोटे से क्षेत्र से पता चलता है। एक Ath5: अंतर-GFP 37 ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस ट्रांस्जीन रेटिना (मुख्य रूप से नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और फोटोरिसेप्टर व्यापारियों) में विभिन्न न्यूरॉन्स लेबल। फिल्म के प्रतिदीप्ति भाग 5 मिनट के अंतराल के साथ 40X / 1.0 डब्ल्यू उद्देश्य का उपयोग दोहरी तरफा रोशनी के साथ रिकॉर्डिंग एक ही दृश्य के रूप में कब्जा कर लिया था। एक 30 माइक्रोन मोटी मात्रा की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण दिखाया गया है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 2 को दर्शाता है, कैसे बहुत तेजी से intracellular घटनाओं उच्च संकल्प के साथ कब्जा कर लिया जा सकता है; इस मामले में सूक्ष्मनलिकाएं के विकास मेंउनके प्लस रेटिना न्यूरोनल पूर्वज कोशिकाओं में समाप्त होता है। जानकारी फिल्म में निहित ट्रैकिंग और microtubule प्लस अंत विकास की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है।

फिल्म 2
फिल्म 2:। एक ही सेल में microtubule गतिशीलता यह फिल्म प्लस टिप मार्कर प्रोटीन EB3-GFP 38 द्वारा लेबल सूक्ष्मनलिकाएं की अधिक सुझावों से बढ़ कब्जा। प्रोटीन एक भी रेटिना पूर्वज सेल में व्यक्त किया जाता है। सूक्ष्मनलिकाएं बेसल को शिखर से दिशा में मुख्य रूप से बढ़ रहे हैं (ऊपर से नीचे)। EB3 धूमकेतु की औसत गति 0.28 ± 0.05 माइक्रोन / सेकंड के रूप में मापा गया था। सेल उच्च microtubule nucleation गतिविधि प्रदर्शन के शिखर पक्ष में उज्ज्वल हाजिर केंद्रपिंड है। जंगली प्रकार भ्रूण hsp70 इंजेक्शन के साथ किया गया था: EB3-GFP प्लास्मिड डीएनए। फिल्म लगभग 28 hrpost fertiliz में गर्मी झटका (37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट) के बाद 4 घंटा अधिग्रहण कर लिया थाव्यावहारिक 63X / 1.0 डब्ल्यू उद्देश्य और 1 सेकंड समय के अंतराल का उपयोग कर एक तरफा रोशनी के साथ रिकॉर्डिंग एक ही दृश्य के रूप में (HPF)। एकल कक्ष रेटिना के बहुमत को कवर देखने का एक क्षेत्र से फसली गया था। अधिकतम तीव्रता के दो स्लाइस के प्रक्षेपण दिखाया गया है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 शो, कैसे intracellular संरचना कई घंटे से अधिक का पालन किया जा सकता है। इधर, रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) translocating भीतर केंद्रपिंड कब्जा कर लिया है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल translocation दौरान सेंट्रोसोम स्थानीयकरण एक समय चूक प्रयोग की इस असेंबल रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल (RGC) परिपक्वता भर केंद्रपिंड की स्थिति से पता चलता।neuronal progenitors में केंद्रपिंड शिखर प्रक्रिया (1:00) की बहुत टिप में स्थानीय है। कोशिका विभाजन के दौरान दोनों centrosomes mitotic धुरा (2:25) के लिए डंडे के रूप में सेवा करते हैं। यह विभाजन एक बेटी सेल है कि एक RGC और एक दूसरी बेटी सेल है कि एक फोटोरिसेप्टर सेल अग्रदूत बन जाता है में differentiates में यह परिणाम है। विभाजन के बाद, RGC की सेल शरीर जबकि शिखर प्रक्रिया शिखर पक्ष में जुड़ा रहता है, रेटिना के बेसल पक्ष को translocates। एक बार जब RGC बेसल पक्ष में पहुँचता है, अपने शिखर प्रक्रिया खिसकाते और केंद्रपिंड यह (6:15) के साथ यात्रा करता है। केंद्रपिंड जबकि धीरे-धीरे शिखर प्रक्रिया (6:50, 7:20, 8:10) के साथ मिलकर retracting पीछा किया जा सकता। अंतिम फ्रेम में (8:55) नाड़ीग्रन्थि सेल, अपने बेसल की ओर से एक अक्षतंतु से बढ़ रहा है, जबकि अभी भी केंद्रपिंड ऊर्ध्वस्थ होते हुए स्थानीय है। मूसा की अभिव्यक्ति एक सेल मंच पर जंगली प्रकार भ्रूण में डीएनए इंजेक्शन द्वारा हासिल की थी। कोशिकाओं Ath5 द्वारा कल्पना कर रहे हैं: GFP-CAAX (हरा) construct, जो RGCs और अन्य न्यूरॉन्स लेबल। Centrosomes (तीर) Centrin-tdTomato 29 अभिव्यक्ति (मैजंटा) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। रेटिना के शिखर की ओर तल पर छवि के ऊपर और बेसल पक्ष में है। एक 30 माइक्रोन मोटी मात्रा की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण दिखाया गया है। छवियों एक फिल्म पूरे रेटिना को कवर से फसली थे। फिल्म लगभग 34 घंटा के बाद निषेचन (HPF) में शुरू होता है। एक जेड ढेर 40X / 1.0 डब्ल्यू उद्देश्य से हर 5 मिनट का अधिग्रहण किया गया था। समय HH में दिखाया गया है: मिमी। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4 में यह प्रदर्शित होता है, कैसे एकल कोशिका व्यवहार पूरे ऊतक कब्जा डेटा से इस तरह की फिल्म 1 के रूप में निकाला जा सकता है। एक RGC की translocation आसानी से लगाया जा सकता है और इसके शिखर और बेसल प्रक्रियातों का पालन किया।

चित्रा 4
चित्रा 4:। एक भी रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल की translocation रेटिना के बेसल पक्ष को शिखर से RGC translocation टर्मिनल बँटवारा के बाद चित्रा 3 में वर्णित के रूप में होता RGC Ath5 की अभिव्यक्ति द्वारा लेबल है। खाई-GFP 37 ट्रांस्जीन। एक 30 माइक्रोन मोटी मात्रा की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण दिखाया गया है। छवियों एक फिल्म पूरे रेटिना को कवर से फसली थे। फिल्म लगभग 34 HPF पर शुरू होता है। एक जेड ढेर 40X / 1.0 डब्ल्यू उद्देश्य से हर 5 मिनट का अधिग्रहण किया गया था। समय HH में दिखाया गया है: मिमी। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 ऊतक सुप्रीम कोर्ट पर कब्जा करने के MultiView LSFM की क्षमता को दर्शाता हैऑप्टिक कप morphogenesis के उदाहरण पर सेलुलर संकल्प, जिसके दौरान ऑप्टिक पुटिका एक ऑप्टिक कप में बदल देती है साथ शराब morphogenetic प्रक्रियाओं। छवि गुणवत्ता बेहद MultiView इमेजिंग, जब अंतिम छवि isotropic संकल्प के साथ एक z ढेर में 5 अलग अलग विचार (इस मामले में) से बाहर जानकारी से संयुक्त है द्वारा सुधार किया जा सकता है। यह आंकड़ा भारित औसत फ्यूजन और छवि के विपरीत में आगे बढ़ जाना और MultiView deconvolution के बाद संकल्प के बाद छवि गुणवत्ता में सुधार को दिखाता है। चित्रा डाटासेट के माध्यम से विभिन्न झुकाव में दो ऑप्टिकल स्लाइस से पता चलता है। इसके अतिरिक्त, deconvolved डाटासेट से एक असेंबल समय के साथ ऑप्टिक कप morphogenesis पता चलता है। सभी समय अंक तो मूवी 3 में दिखाया जाता है।

चित्रा 5
चित्रा 5: एकल दृश्य और multiv के दो तरीकों के बीच छवि गुणवत्ता की तुलनाiew संलयन। (ए) पार्श्व दृश्य और (बी) पृष्ठीय दृश्य से दिखाया ही दृश्य डेटा के एक ऑप्टिकल टुकड़ा। धारी कलाकृतियों और संकेत नमूना अंदर गहरी की गिरावट स्पष्ट कर रहे हैं। इसके अलावा छवि जुड़े हुए डेटा (सीएफ) में दिख का एक हिस्सा इस विशेष दृश्य में कब्जा नहीं कर रहा था। (सी) एक ही ऑप्टिकल टुकड़ा, MultiView जुड़े हुए डेटा पार्श्व दृश्य और (डी) पृष्ठीय दृश्य से दिखाया अब के रूप में। ध्यान दें कि धारी कलाकृतियों को दबा रहे हैं और संरचनाओं के नमूने में गहरी बेहतर हल कर रहे हैं। (ई) एक ही ऑप्टिकल टुकड़ा अब MultiView deconvolved पार्श्व दृश्य और (एफ) पृष्ठीय दृश्य से दिखाया डेटा के रूप में। नोट वृद्धि हुई इसके विपरीत है और संकल्प इसलिए व्यक्ति कोशिका झिल्ली और नाभिक में अच्छी तरह से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। संकल्प नमूना अंदर विशेष रूप से गहरा खराब नहीं करता। डाटासेट लगभग 20 डिग्री के अलावा 5 विचारों से दोहरी तरफा रोशनी के साथ अधिग्रहण कर लिया था। एबी के Z ढेर1.5 माइक्रोन कदम आकार के साथ 100 माइक्रोन 20X / 1.0 डब्ल्यू उद्देश्य से 10 घंटे के लिए प्रत्येक दृश्य पर हासिल किया गया बाहर 10 मिनट के अंतराल में। MultiView फ्यूजन और deconvolution के लिए इनपुट छवियों नीचे जांचा 2 × छवि प्रसंस्करण में तेजी लाने के लिए किया गया। MultiView deconvolution के 15 पुनरावृत्तियों चलाए जा रहे थे। (G) असेंबल deconvolved डेटा से पृष्ठीय दृश्य ऑप्टिक कप चरण के लिए ऑप्टिक पुटिका से जल्दी आंख के विकास के दौरान मॉर्फ़ोजेनेटिक घटनाओं को उजागर करने का एक फसली क्षेत्र से पता चलता है। ऑप्टिक पुटिका की दो परतों, जो शुरू में समान स्तंभ epithelia कर रहे हैं, अलग-अलग सेल आबादी में अंतर है। बाहर का परत एपिडर्मिस के करीब रेटिना neuroepithelium (आर एन) और समीपस्थ परत न्यूरल ट्यूब के करीब रेटिना वर्णक उपकला (आरपी) हो जाता है। आर.एन. बढ़ाना और invaginate में कोशिकाओं ऑप्टिक कप (5:00 करने के लिए 1:40) बनाने के लिए; एक ही समय में आरपी कोशिकाओं समतल। सतह बाह्य त्वक स्तर, एक लेंस (01:40) बनाने के लिए प्रेरित किया जाता है कआईसीएच invaginates बाद में (5:00)। फिल्म 17 HPF पर शुरू होता है। समय HH में दिखाया गया है: मिमी। सभी सेलुलर झिल्ली β-actin द्वारा चिह्नित कर रहे हैं: RAS-GFP transgene और सभी नाभिक hsp70 द्वारा चिह्नित कर रहे हैं: H2B आरएफपी ट्रांस्जीन। स्केल बार 30 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। अमेरिकन प्लान अग्रमस्तिष्क, ले लेंस, ओपी घ्राण placode, आर.एन. रेटिना neuroepithelium, आरपी रेटिना वर्णक उपकला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 3
मूवी 3: ऑप्टिक कप morphogenesis ही दृश्य और MultiView संलयन के दो तरीके के साथ दिखाया फिल्म समय चूक ऑप्टिक कप चरण के लिए ऑप्टिक पुटिका से ऑप्टिक कप morphogenesis की पूरी प्रक्रिया को दिखाता है।। यह (ऊपर) पार्श्व दृश्य और (नीचे) पृष्ठीय दृश्य से एक ऑप्टिकल टुकड़ा से एक ऑप्टिकल टुकड़ा पता चलता है। विकासशील ऑप्टिक पुटिका की कोशिकाओं जटिल rearrangements गुजरना अंत भीतर रेटिना neuroepithelium और बाहरी रेटिना वर्णक उपकला के साथ अर्धगोल ऑप्टिक कप के रूप में। एक लेंस की सतह बाह्य त्वक स्तर से ही बना है। यह neuroepithelium के साथ invaginates और ऑप्टिक कप में बैठता है। सभी सेलुलर झिल्ली β-actin की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे हैं: RAS-GFP (हरा) ट्रांस्जीन और नाभिक hsp70 के साथ चिह्नित कर रहे हैं: H2B आरएफपी (मैजंटा)। फिल्म लगभग 17 HPF पर शुरू होता है। डाटासेट 5 दर्शनों की संख्या लगभग 20 डिग्री के अलावा से दोहरी तरफा रोशनी के साथ और लगभग 100 माइक्रोन के ढेर AZ 20X / 1.0 डब्ल्यू उद्देश्य से हर 10 मिनट हासिल किया गया अधिग्रहण कर लिया था। समय HH में दिखाया गया है: मिमी। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

1. महत्वपूर्ण कदम और डाटा अधिग्रहण के लिए समस्या

एक GFP और आरएफपी नमूना व्यक्त करने के लिए ठेठ इमेजिंग सेटिंग्स तालिका 3 में पाया जा सकता है वर्णित माइक्रोस्कोप सेटअप प्रकाश शीट स्थिर है, एक बेलनाकार लेंस द्वारा निर्मित है। दो रोशनी उद्देश्यों को हवा लेंस हैं और पता लगाने के उद्देश्य के लिए एक पानी की सूई लेंस है। 20X / 1.0 या 40X / 1.0 उद्देश्यों के साथ 1.0 ज़ूम 230 एनएम और 115 एनएम पिक्सेल आकार और क्रमश: 441 x 441 माइक्रोन या 221 x 221 माइक्रोन के दृश्य के एक क्षेत्र देता है। 2: यह केंद्र के साथ डिफ़ॉल्ट प्रकाश शीट मोटाई का उपयोग करने के लिए सीमा को 1 अनुपात की सिफारिश की है। 20X / 1.0 के लिए इस मोटाई 4.5 माइक्रोन के लिए और 40X / 1.0 केंद्र में 3.2 माइक्रोन के लिए मेल खाती है। इमेजिंग गति प्राथमिक प्राथमिकता नहीं है, तो एक बहुरंगा नमूना के मामले में अलग पटरियों का उपयोग चैनलों के बीच प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के crosstalk से बचने के लिए। अधिग्रहण के उच्चतम गति से Z कदम प्रति 50 मिसे तक सीमित हैजेड-चालक के आंदोलन की गति। लक्ष्य के मामले में, उदाहरण के लिए अधिकतम इमेजिंग गति को प्राप्त करने के लिए है, तो दोहरी तरफा रोशनी के साथ दो पटरियों, जोखिम समय निर्धारित किया जाना चाहिए ताकि सभी Z कदम के प्रति लिया छवियों का योग 50 मिसे के नीचे है। दूसरी ओर, यदि केवल एक ही छवि जेड कदम के प्रति अधिग्रहण कर लिया है, यह नहीं जोखिम समय 50 मिसे की तुलना में कम स्थापित करने के लिए फायदेमंद है।

1920 x 1920 छवि का आकार
16-बिट
धुरी पर स्कैन
ऑनलाइन फ्यूजन के साथ दोहरी तरफा रोशनी
10X / 0.2 रोशनी उद्देश्य
20X / 1.0 डब्ल्यू योजना Apochromat का पता लगाने के उद्देश्य
ट्रैक 1: उत्तेजना 488 एनएम आम तौर पर 100 मेगावाट लेजर के 2%, 550 एनएम सपा उत्सर्जन फिल्टर
ट्रैक 2: उत्तेजना 561 एनएम आमतौर पर 3% की 75 मेगावाट लेजर, 585 एनएम एल.पी. उत्सर्जन फिल्टर
100 मिसे के संपर्क में समय अप
जेड ढेर मोटाई 50-100 माइक्रोन
1-1.5 माइक्रोन निरंतर Z ड्राइव मोड में Z कदम आकार
28.5 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन

तालिका 3: सेटिंग इमेजिंग।

प्रयोग के बाद नमूना निरीक्षण

यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना अभी भी प्रयोग के अंत में स्वस्थ है महत्वपूर्ण है। पहली बार एक readout के रूप में, एक स्टिरियोस्कोप के तहत नमूना के दिल की धड़कन की जाँच करें। तेज संदंश की एक जोड़ी के साथ नमूना agarose से बाहर ले जाया जा सकता है और इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करने के आदेश अगर यह इमेजिंग से प्रभावित था की जांच करने के लिए और अधिक विकसित करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, यह एंटीबॉडी धुंधला के लिए तय किया जा सकता है।

बढ़ते और बहाव

यह चैम्बर एस के परासारिता रखने के लिए आवश्यक हैएम्बेडिंग agarose की परासारिता के करीब olution, अन्यथा सूजन / agarose और नमूना घटित होगा के बाद अस्थिरता के सिकुड़ने। इसलिए, एक ही समाधान (methylene नीले बिना E3 के माध्यम) का उपयोग चैम्बर को भरने के लिए और 1% कम पिघलने बिंदु agarose aliquots तैयार करने के लिए। इसके अतिरिक्त, अधिक से अधिक 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक में agarose छोड़ नहीं है, क्योंकि यह अपने बीच बढ़िया तालमेल गुण खो सकते हैं।

बहुत गर्म agarose में मछली एम्बेड नहीं करें क्योंकि यह गर्मी झटका प्रतिक्रिया या भ्रूण की मौत हो सकती है। भ्रूण पर गर्म agarose के प्रभाव के बारे में अनिश्चित हैं, तो जाँच करें कि पूंछ मोड़ नहीं है और हृदय की दर को धीमा नहीं करता है। यदि ऐसा होता है, प्रयोग के लिए एक अलग भ्रूण का उपयोग करें।

नमूना कम (लगभग 2 सेमी) के साथ agarose स्तंभ की कुल लंबाई रखें और अपने सिर सवार टिप की ओर उन्मुख साथ zebrafish माउंट। इसी तरह, agarose सिलेंडर capill से निकालाआरे जितना संभव हो कम रखा जाना चाहिए। इन उपायों से फिल्म में नमूना की स्थिरता को सुनिश्चित करेगा। इसी समय, agarose स्तंभ काफी लंबे समय होना चाहिए ताकि कांच केशिका ही है, प्रकाश पथ में पहुँच नहीं है के रूप में इस प्रमुख अपवर्तन और परावर्तन का कारण होगा।

नमूने के प्रारंभिक बहाव agarose सिलेंडर ही की मात्रा में परिवर्तन के कारण होता है। सवार की रपट को इसके लिए कारण नहीं है। इसलिए, यह प्लास्टिसिन या नेल पॉलिश के साथ सवार को ठीक करने में मदद नहीं करता है। भ्रूण भी अपने प्राकृतिक विकास की वजह से फिल्म के दौरान अपनी स्थिति को बदल सकता है। तदनुसार, यह देखने के क्षेत्र के बीच में ब्याज के क्षेत्र केंद्र और इन आंदोलनों को समायोजित करने के किनारों पर कुछ कमरे में रखने की सलाह दी जाती है।

प्रकाश पथ में embedding माध्यम की कम राशि

नमूना सही ढंग से Orienting सबसे अच्छा संभव छवि गुणवत्ता 15 को प्राप्त करने में मदद करता है। जीनरैली, उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश के रूप में छोटे ऊतक और संभव के रूप में बढ़ते मीडिया के माध्यम से यात्रा करना चाहिए। इष्टतम समाधान agarose मुक्त बढ़ते है। यह Arabidopsis पार्श्व रूट इमेजिंग 14, जिसमें मुख्य जड़ phytagel में रखा गया था और बाद में पूरी तरह से पार्श्व जड़ों जेल स्तंभ से बाहर हो जाना करने के लिए करते थे के लिए एक सेटअप में, उदाहरण के लिए हासिल की थी। Agarose मुक्त बढ़ते भी दो दिन के 12 से अधिक Tribolium बीटल की पूरी embryogenesis की इमेजिंग के लिए विकसित किया गया था। छवि गुणवत्ता में सुधार है कि मामले में एक प्राथमिक प्रेरणा नहीं था। Tribolium भ्रूण बस agarose अंदर काफी देर तक जीवित नहीं है। एक बिल्कुल एम्बेडिंग मीडिया से मुक्त बढ़ते zebrafish में लंबे समय तक इमेजिंग के लिए हासिल नहीं किया गया है। फिर भी, हम इस तथ्य का लाभ ले सकते हैं कि जब agarose solidifies, सबसे भ्रूण तिरछे केशिका में एक आंख agarose में गहरी स्थित है और दूसरी आंख एम्बेडिंग स्तंभ की सतह के करीब होने के साथ तैनात हैं। टीवह आंख की सतह के करीब बेहतर छवि गुणवत्ता प्रदान करता है और इसलिए रियायत के तौर पर imaged किया जाना चाहिए।

Agarose एकाग्रता और लंबी अवधि इमेजिंग

बढ़ते के लिए agarose की एकाग्रता नमूना की स्थिरता और संभावना यह करने के लिए और ऑक्सीजन के भ्रूण के विकास के प्रसार को समायोजित करने के बीच एक समझौता है। वहाँ नमूना की स्थिरता में कोई अतिरिक्त लाभ जब 1% से अधिक agarose सांद्रता का उपयोग कर रहा है। प्रयोगों के अनुकूलन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में हम 0.6% agarose, जो भी भ्रूण छोटी से 24 HPF वह भी नाजुक 1% agarose में रखा जा रहे हैं के लिए उपयुक्त है सलाह देते हैं। पुराने भ्रूण और लार्वा चतनाशून्य करने के लिए, एमएस-222 एकाग्रता दुष्प्रभाव 13 बिना 200 माइक्रोग्राम / एमएल के लिए उठाया जा सकता है।

मामले में विकासशील भ्रूण अब से ± 12 घंटे के लिए imaged हैं, agarose बढ़ते सिफारिश नहीं है, क्योंकि यह भ्रूण और caus के विकास को प्रतिबंधिततों पूंछ विरूपण। यह समस्या समान अपवर्तनांक साथ FEP बहुलक ट्यूबों में भ्रूण बढ़ते 13,39 पानी के लिए द्वारा zebrafish के लिए हल किया गया था। माउस भ्रूण, दूसरे हाथ पर, खोखले agarose सिलेंडर 40 में या एक एक्रिलिक एक सिरिंज से जुड़ी 41 रॉड के छेद में स्थिर किया जा सकता है। FEP ट्यूब बढ़ते हालांकि डिफ़ॉल्ट पद्धति के रूप में की सिफारिश नहीं है, क्योंकि ट्यूब की दीवार प्रकाश थोड़ा agarose की तुलना में अधिक refracts।

हल्की चादर संरेखण

अच्छी छवि गुणवत्ता के लिए यह हर प्रयोग से पहले स्वत: प्रकाश चादर संरेखण प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। खासकर अगर ज़ूम सेटिंग्स बदल रहे थे, उद्देश्यों बाहर ले जाया गया, या एक अलग तरल कक्ष में इस्तेमाल किया गया था।

रोशनी

प्रकाश शीट की धुरी स्कैनिंग हमेशा सक्रिय किया जाना चाहिए। बड़े बिखरने नमूनों के लिए, यह ऑनलाइन एफ के साथ दोहरी तरफा रोशनी लागू करने के लिए आवश्यक हैusion देखने के क्षेत्र भर में भी रोशनी प्राप्त करने के लिए। दोहरी तरफा रोशनी भी आंख इमेजिंग, जो भ्रूण के लेंस से आने वाली प्रकाश के अपवर्तन चादर है की एक विशिष्ट समस्या कम हो। छोटे, कम बिखरने नमूनों कुशलता से एक तरफा रोशनी, जो आधे से इमेजिंग समय shortens और दोहरी तरफा रोशनी की तुलना में थोड़ा बेहतर छवि गुणवत्ता में परिणाम कर सकते हैं का उपयोग imaged किया जा सकता है। यह वह जगह है दो रोशनी हथियारों के लिए प्रकाश पथ हमेशा अलग हैं और अधिक कुशल एक चुना जा सकता है। इसके अतिरिक्त, दो प्रकाश शीट हर तरफ से आ रहे एक विमान है, जो फ्यूजन के बाद धुंधला हल्के कारण बनता में पूरी तरह से कभी नहीं कर रहे हैं। बहुत तेजी से intracellular घटनाओं, बढ़ रही सूक्ष्मनलिकाएं (मूवी 2) की तरह के लिए, दोहरी तरफा रोशनी छोड़ दिया और सही से रोशनी के साथ छवियों के बाद से क्रमिक रूप से है, जो नशे की गति में परिणाम सकता है अर्जित कर रहे हैं उचित नहीं है।

photobleachingऔर phototoxicity

कम fluorophore photobleaching अक्सर LSFM का एक प्रमुख लाभ के रूप में उल्लेख किया है। हम तर्क होता है कि इसका उद्देश्य सभी में कोई photobleaching होना चाहिए। अगर वहाँ रहते इमेजिंग प्रयोग में ध्यान देने योग्य photobleaching है, नमूना शायद सहन लेजर जोखिम की अपनी शारीरिक सीमा से बाहर पहले से ही है। कताई डिस्क माइक्रोस्कोप में zebrafish भ्रूण जब इमेजिंग, हमारे अनुभव में, उच्च phototoxicity भ्रूण विकास भी फ्लोरोसेंट संकेत bleaches स्पष्ट रूप से पहले दुकान कर सकते हैं। इसलिए, LSFM में इमेजिंग सेटिंग्स इतना है कि कम या कोई photobleaching मनाया जाता है समायोजित किया जाना चाहिए। हालांकि LSFM नमूने के लिए कोमल है, यह उतना ही लेजर शक्ति और जोखिम समय के रूप में शोर अनुपात बाद में डेटा विश्लेषण के लिए पर्याप्त के लिए एक संकेत प्राप्त करने की आवश्यकता का उपयोग करने के लिए समझदारी है।

जेड ढेर, समय अंतराल और डेटा का आकार

LSFM द्वारा उत्पन्न फ़ाइलें आमतौर पर बहुत बड़े हैं; कभी कभी टेराबाइट रेंज में। यह अक्सर छवि गुणवत्ता और डेटा आकार के बीच एक समझौता करने के लिए आवश्यक है। यह विशेष रूप से ढेर और समय चूक अधिग्रहण में अंतराल के Z रिक्ति के लिए मामला है। जेड अंतराल को परिभाषित करने के लिए, Z ढेर उपकरण टैब में इष्टतम बटन आदर्श रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, खासकर अगर डाटासेट बाद में deconvolved दिया जाएगा। यह रिक्ति पड़ोसी ऑप्टिकल स्लाइस के बीच 50% ओवरलैप प्राप्त करने के लिए खरीदते हैं। फिर भी, कुछ बड़ा Z अंतराल आमतौर पर स्वीकार्य हैं। वे समय Z ढेर के रूप में अच्छी तरह से अंतिम फ़ाइल आकार प्राप्त करने के लिए की जरूरत को कम। इष्टतम समय नमूना ब्याज की प्रक्रिया पर निर्भर करता है। समग्र आंख के लिए विकास 5-10 मिनट के अंतराल आमतौर पर स्वीकार्य हैं। कुछ संरचनाओं स्वचालित रूप से पता लगाया जा करने के लिए कर रहे हैं, बाद में समय अंक पर्याप्त समान होना चाहिए।

फ्लोरोसेंट मोती

फ्लोरोसेंट मोती मुख्य रूप से अलग अलग विचार पंजीकरण के लिए के रूप में असंदिग्ध मार्कर की सेवाएक-दूसरे पर एक MultiView डाटासेट की। हमेशा अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले मनका समाधान भंवर। के रूप में इस फ्लोरोसेंट डाई की हानि हो सकती है मोती गर्मी नहीं है। MultiView पंजीकरण के लिए इष्टतम मनका एकाग्रता प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना है। वर्णित प्लगइन प्रत्येक दृश्य के दौरान 1000 के आसपास का पता लगाया मोतियों के साथ सबसे अच्छा काम करता है। बड़ी (500 एनएम या 1,000 एनएम) मोती छोटे (कम से कम 500 एनएम) मोतियों की तुलना में अधिक मजबूती के साथ पता चला रहे हैं। इसका कारण यह है बड़ा मोती चमक रहे हैं और नमूने में संरचनाओं की झूठी सकारात्मक पता लगाने के बिना खंड के लिए आसान कर रहे हैं। बड़े मोतियों की नुकसान यह है कि वे अंतिम जुड़े हुए हैं और deconvolved छवि में बहुत महत्वपूर्ण हो जाता है। प्रत्येक नए फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए, उचित मनका आकार और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अनुकूलित किया जाना है। चित्रा 5 और मूवी 3 से नमूना का एक उदाहरण देने के लिए, 100 एनएम हरी उत्सर्जन मोती झिल्ली-GFP चैनल में भी कई झूठी सकारात्मक पता लगाने दिया था, लेकिन 1,000 nएम लाल उत्सर्जन मोती मजबूती के साथ नमूना अंदर बहुत कुछ सकारात्मक पता लगाने के साथ H2B आरएफपी चैनल में पाया गया। मनका पता लगाने फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ चैनल में विफल रहता है, एक अलग ही मोती युक्त चैनल का अधिग्रहण किया जा सकता है, लेकिन यह बहुत ही व्यावहारिक नहीं है। उप संकल्प आकार मोती माइक्रोस्कोप की बात फैल समारोह (पीएसएफ) है, जो deconvolution (चित्रा -2 सी-डी) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक सीधा readout दे। पंजीकरण और फ्यूजन बड़ा मोती (जैसे 1,000 एनएम) के साथ बेहतर काम करता है, तो पीएसएफ की एक अलग छवि उप-संकल्प, जैसे, 100 एनएम मोतियों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। बहुरंगा मनकों का उपयोग मल्टीचैनल अधिग्रहण के पंजीकरण के दौरान और पुष्टि है कि चैनलों ओवरले पूरी तरह से के लिए उपयोगी है।

जब बाद में MultiView पंजीकरण और संलयन के बिना एक ही दृश्य से इमेजिंग फ्लोरोसेंट मोती के अलावा आवश्यक नहीं है। हालांकि, यहां तक ​​कि उन मामलों में मोती पहल के दौरान सहायक हो सकता हैएल प्रकाश शीट समायोजन प्रकाश शीट की गुणवत्ता की जांच करने के लिए और सामान्य में ऑप्टिकल aberrations प्रकट करते हैं। जैसे ऑप्टिकल aberrations क्षतिग्रस्त या गंदा उद्देश्यों, कक्ष या agarose में inhomogeneity के गंदे खिड़कियों की तरह विभिन्न स्रोतों से उत्पन्न हो सकता है। मोती भी MultiView पंजीकरण फिजी प्लगइन 20 से बहाव सुधार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

मल्टीव्यू

MultiView पुनर्निर्माण प्रयोजन के लिए, यह देखा गया 3, 5 और इतने पर है, जो एक दूसरे को नहीं विरोध कर रहे हैं की एक विषम संख्या प्राप्त करने के लिए बेहतर है। के बाद से PSFs अलग अलग दिशाओं से imaged हैं इस deconvolution में सुधार। यह भी समय व्यतीत हो जाने के अधिग्रहण की शुरुआत है कि वहाँ विचारों के बीच में पर्याप्त ओवरलैप पर पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह सबसे अच्छा है, अनुभव से किया जाता है यानी, तुरंत पुष्टि है कि पहली बार के बिंदु में विचारों को सफलतापूर्वक पंजीकृत किया जा सकता है। MultiView अधिग्रहण के लक्ष्य के संकल्प को बढ़ाने के लिए है जबएक बड़ी बिखरने नमूना की एक छवि है, यह छवि प्रत्येक दृश्य में पूरे नमूना करने के लिए उचित नहीं है, लेकिन नमूना है, जहां संकेत कमजोर होती जाती है के केन्द्र के आसपास रोकने के लिए। नमूना की दूसरी छमाही से कम गुणवत्ता अधिग्रहण MultiView पुनर्निर्माण के लिए उपयोगी जानकारी जोड़ नहीं होता।

2. महत्वपूर्ण कदम और डाटा प्रोसेसिंग के लिए समस्या

वर्तमान में, वहाँ एक प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप है कि अच्छी तरह से प्रलेखित रहे हैं और अपेक्षाकृत आसान अपनाने के लिए से MultiView डेटा के प्रसंस्करण के लिए कई संभावनाएं मौजूद हैं। हम MultiView पुनर्निर्माण अनुप्रयोग है, जो एक खुला स्रोत फिजी 32 (स्टीफ़न Preibisch अप्रकाशित, सॉफ्टवेयर में लागू है का उपयोग लिंक 1 ए और Link1b सामग्री की सूची में)। इस प्लगइन पिछले SPIM पंजीकरण प्लगइन 20 के एक प्रमुख को नया स्वरूप है, की समीक्षा कीSchmied एट अल। 42, BigDataViewer और उसके एक्सएमएल और SPIM पंजीकरण कार्यप्रवाह के साथ HDF5 प्रारूप 33 (चित्रा 1 बी, एकीकृत करके लिंक 2 , लिंक 3 )। यह आवेदन भी उच्च निष्पादन कंप्यूटिंग क्लस्टर है, जो काफी प्रसंस्करण 43 को गति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस MultiView पंजीकरण आवेदन को सक्रिय रूप से आगे विकसित की है और सुधार रहता है। वर्णित सॉफ्टवेयर के लिए समस्याओं या सुविधाओं के अनुरोध के मामले में, संबंधित GitHub पृष्ठों (पर मुद्दों दर्ज करें लिंक 4 मल्टीव्यू पुनर्निर्माण के लिए और लिंक 5 BigDataViewer के लिए)।

दूसरा विकल्प माइक्रोस्कोप के साथ एक साथ उपलब्ध वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए है। यह समाधान अच्छी तरह से काम करता है और कार्यरत हैं अलग अलग विचार रजिस्टर करने के लिए फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग करने का एक ही सिद्धांत। हालांकि, यह तेजी से BigDataViewer के साथ की तरह पूरे डाटासेट कल्पना करने के लिए विकल्प का अभाव है। इसके अलावा सॉफ्टवेयर क्लस्टर के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता और इसके अलावा प्रसंस्करण ब्लॉकों अन्य उपयोगकर्ताओं को, जब तक कि सॉफ्टवेयर के लिए अतिरिक्त लाइसेंस खरीदा है के लिए माइक्रोस्कोप।

तीसरा विकल्प है, जो भी एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर है, हाल ही में केलर प्रयोगशाला 44 द्वारा प्रकाशित और प्रसंस्करण और प्रकाश शीट डेटा के बहाव के विश्लेषण के लिए एक व्यापक रूपरेखा प्रदान किया गया था। इस सॉफ्टवेयर नमूना भीतर से जानकारी का उपयोग किया जाता है MultiView संलयन प्रदर्शन करने के लिए है, इसलिए यह नमूना आसपास फ्लोरोसेंट मोतियों की उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है। लेकिन एक ही समय में यह इमेजिंग दृश्य (उद्देश्यों) के orthogonal उन्मुखीकरण हो जाती है, तो यह मनमाना कोण 44 से प्राप्त डेटा के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।

हार्डवेयर आवश्यकताएँ

ntent "> हार्डवेयर प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल तालिका 4 में पाया जा सकता है। वहाँ पर्याप्त भंडारण क्षमता और उपलब्ध डाटा प्रोसेसिंग के लिए एक स्पष्ट पाइप लाइन, वास्तविक प्रयोग से आगे हो गया है। छवियों के अधिग्रहण के बाद के विश्लेषण से भी तेज है और यह आसान है असंसाधित डेटा के साथ पानी भर गया हो। यह अक्सर जुड़े हुए देखा गया, अधिकतम तीव्रता के अनुमानों या गोलाकार अनुमानों 45 की तरह सभी कच्चे छवियों, बल्कि एक फसली संस्करण या संसाधित छवियों को स्टोर करने के लिए अवास्तविक है।

प्रोसेसर दो इंटेल Xeon प्रोसेसर E5-2630 (छह कोर, 2.30 गीगा टर्बो, 15 एमबी, 7.2 जीटी / सेकंड)
याद 128 जीबी (16 × 8 जीबी) 1600 मेगाहर्ट्ज DDR3 ईसीसी RDIMM
हार्ड ड्राइव 4 × 4 टीबी 3.5inch सीरियल ATA (7.200 आरपीएम) हार्ड ड्राइव
HDD नियंत्रक PERC H310 SATA / एसएएस कोनडेल प्रेसिजन लिए ट्रोलर
HDD विन्यास सी 1 SATA 3.5 इंच, 1-4 हार्ड ड्राइव
ग्राफिक्स दोहरी 2 जीबी NVIDIA Quadro 4000 (2 कार्ड w / 2 डी पी और 1 DVI- मैं प्रत्येक) (2 डी पी-डीवीआई और 2 डीवीआई वीजीए अनुकूलक) (MRGA17H)
नेटवर्क इंटेल X520-T2 दोहरी पोर्ट 10 GbE नेटवर्क इंटरफेस कार्ड

सारणी 4: हार्डवेयर जरूरत।

डाटा प्रोसेसिंग गति

समय डाटा प्रोसेसिंग के लिए आवश्यक डेटा के आयामों पर और इस्तेमाल हार्डवेयर पर निर्भर करता है। तालिका 1 में, हम समय एक उदाहरण 8.6 जीबी MultiView डाटासेट कि 4 विचारों और 2 चैनल के साथ 1 समय बिंदु के शामिल प्रसंस्करण में महत्वपूर्ण कदम के लिए आवश्यक का एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं।

प्रसंस्करण रोंTEP पहर प्रोटोकॉल कदम
HDF5 के रूप में resave 6 मिनट 30 सेकंड 6.3
ब्याज अंक का पता लगाने 20 सेकंड 6.4
ब्याज अंक का उपयोग कर रजिस्टर 3 सेकंड 6.5
सामग्री आधारित MultiView संलयन 4 घंटा 7.2
मल्टीव्यू deconvolution (सीपीयू) 8 घंटा 7.3
मल्टीव्यू deconvolution (GPU) 2 घंटा 7.3

तालिका 1: डेटा प्रसंस्करण समय।

MultiView पुनर्निर्माण के लिए इनपुट डेटा स्वरूप

फिजी प्लगइन मल्टीव्यू पुनर्निर्माण .czi, .tif और ome.tiff स्वरूपों का समर्थन कर सकते हैं। .czi प्रारूप का आंकड़ा संरचना के कारण, असंतत डेटासेट नहीं हैंपूर्व प्रसंस्करण के बिना समर्थन किया। असंतत मतलब यह है कि रिकॉर्डिंग आरंभ किया जाना था (जैसे नमूने के बहाव के कारण पदों बदल डालना)। इस मामले में .czi फ़ाइलों .tif के रूप में resaved किए जाने की जरूरत है। .tif के लिए प्रत्येक दृश्य फ़ाइलों और रोशनी दिशा में एक अलग फ़ाइल के रूप में सहेजा जाना चाहिए।

पिक्सेल आकार की कैलिब्रेशन

माइक्रोस्कोप-ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर XY पिक्सेल चयनित उद्देश्य के आधार पर आकार के लिए अंशांकन खरीदते हैं। हालांकि, Z में पिक्सेल आकार कदम आकार द्वारा स्वतंत्र रूप से परिभाषित किया गया है। एक गलत उद्देश्य सॉफ्टवेयर में निर्दिष्ट किया जाता है, तो Z अनुपात करने के लिए XY गलत है और पंजीकरण असफल हो जायेगी।

प्रारंभिक पंजीकरण

डाटासेट परिभाषित करने के बाद पंजीकरण की संख्या 1 हो जाएगा और ब्याज अंकों की संख्या ViewSetup एक्सप्लोरर में 0 होगा। प्रारंभिक पंजीकरण डाटासेट की जांच का प्रतिनिधित्व करता है। दोनों संख्या ओएफ पंजीकरण और ब्याज अंक प्रसंस्करण के दौरान वृद्धि होगी।

नीचे ब्याज अंक का पता लगाने के लिए नमूने

नीचे नमूने का उपयोग की सिफारिश की है, फ़ाइलों की लोडिंग के बाद से और विभाजन बहुत तेजी से किया जाएगा। यह ध्यान रखें कि पता लगाने के मापदंडों के नीचे नमूने के आधार पर बदल जाएगा, इस प्रकार विभिन्न नीचे नमूना सेटिंग्स के बीच का पता लगाने सेटिंग्स स्थानांतरित करने के लिए संभव नहीं है, लेकिन महत्वपूर्ण है।

ब्याज अंक की जांच

यह प्रत्येक दृश्य में संभव के रूप में कई सच्चे मोती के रूप में खंड के लिए सलाह दी जाती है, यहां तक ​​कि कुछ झूठी सकारात्मक पता लगाने प्राप्त करने की कीमत पर, क्योंकि वे पंजीकरण में काफी बाधा नहीं है। नकली पता लगाने, यदि संख्या में कुछ, पंजीकरण के दौरान (ब्याज अंक का पंजीकरण देखें) बाहर रखा गया है। हालांकि, बड़े पैमाने पर झूठी सकारात्मक पता लगाने एल्गोरिथ्म के लिए एक समस्या खड़ी। यह न केवल पता लगाने के लिए प्रदर्शन कम कर देता है औरपंजीकरण, यह बहुत लंबे समय तक इस सेगमेंट के लिए छवि लेता है और साथ ही विचारों के बीच इन मोतियों की तुलना, लेकिन यह भी पंजीकरण की सटीकता कम कर देता है के बाद से। यह और अधिक कड़े पता लगाने के मापदंडों का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, मोती (एक मनका चित्रा 1E पर यानी कई पता लगाने) के विभाजन से अधिक पंजीकरण के लिए हानिकारक है और बचा जाना चाहिए।

ब्याज अंक का पंजीकरण

एक दूसरे पर विचारों का पंजीकरण करने के लिए, प्रत्येक दृश्य में प्रत्येक मनका के स्थान अपने तीन निकटतम पड़ोसी मोती के संबंध में अपनी स्थिति से वर्णन किया गया है। इन नक्षत्रों एक स्थानीय ज्यामितीय वर्णनकर्ता गठन कर रहे हैं और विचारों के बीच प्रत्येक मनका की तुलना अनुमति देते हैं। दो विचारों के बीच वर्णनकर्ता मिलान के साथ मोती तो उम्मीदवार पत्राचार के रूप में माना जाता है। ध्यान दें कि यह केवल बेतरतीब ढंग से वितरित की माला, जिसके लिए स्थानीय वर्णनकर्ता आमतौर पर प्रत्येक मनका के लिए अद्वितीय हैं के लिए काम करता है।ऐसा ही एक पंजीकरण के लिए नमूने में नाभिक के रूप में अन्य संरचनाओं का उपयोग कर सकते हैं। हालांकि, क्रम में नाभिक है, जो नमूने में गैर बेतरतीब ढंग से वितरित कर रहे हैं पता लगाने के लिए अन्य तरीकों 20,21 लागू होते हैं।

उम्मीदवार पत्राचार तो आदेश झूठी सकारात्मक को बाहर करने में RANSAC 36 के खिलाफ जांच कर रहे हैं। प्रत्येक पत्राचार एक दूसरे पर देखा गया overlaying के लिए एक परिवर्तन मॉडल सुझाव दे रहा है। यह सच है कि पत्राचार संभावना है, एक परिवर्तन मॉडल पर सहमत हैं जबकि outliers एक अलग से एक के लिए प्रत्येक बिंदु होगा। सच पत्राचार तो दो विचारों के बीच तुलना में एक affine परिवर्तन मॉडल गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक चलने का अनुकूलन एल्गोरिथ्म के साथ एक वैश्विक अनुकूलन तब किया जाता है, जिसके दौरान सभी विचारों विचारों 20,21 के बीच कम से कम विस्थापन के उद्देश्य से पहली बार देखने पर पंजीकृत हैं।

समय चूक पंजीकरण

स्थानांतरित करने के लिए कारणखुर्दबीन मंच के agarose और imprecise मोटर आंदोलन का बयान, प्रत्येक ढेर की स्थिति समय के साथ मामूली अंतर होता है। जबकि अलग-अलग समय बिंदु के पंजीकरण इस समय बिंदु के विचारों के बीच अंतर को हटा, समय चूक भी एक पूरे के रूप में पंजीकृत करने की जरूरत है। यह अंत करने के लिए, प्रत्येक व्यक्ति के समय बिंदु संदर्भ समय बिंदु पर पंजीकृत है।

संदर्भ समय बिंदु

कई बार अंक के साथ एक समय श्रृंखला संसाधित किया जाता है, एक प्रतिनिधि समय बिंदु संदर्भ के रूप में आमतौर पर समय की श्रृंखला के बीच में से बाद से मनका तीव्रता विरंजन के कारण समय पर नीचा कर सकते हैं चुना जाता है। इस संदर्भ में, ब्याज बिंदु का पता लगाने, पंजीकरण, bounding बॉक्स और संलयन के लिए मानकों को निर्धारित किया जा सकता है। इन मानकों तो प्रत्येक व्यक्ति के समय बिंदु के लिए एक विशिष्ट परिवर्तन मॉडल गणना करने के लिए पूरे समय व्यतीत करने के लिए लागू कर रहे हैं। समय चूक पंजीकरण के दौरान अन्य सभी समय के अंक भी regist हैंइस संदर्भ में समय बिंदु पर स्थानिक जुटी। इस प्रकार पूरी रिकॉर्डिंग के लिए bounding बॉक्स मापदंडों के इस विशेष समय बिंदु के आधार पर कर रहे हैं।

मल्टीचैनल पंजीकरण

कई चैनलों जब इमेजिंग, आदर्श ही फ्लोरोसेंट मोती सभी imaged चैनलों में दिखाई जानी चाहिए। का पता लगाने और पंजीकरण तो हर चैनल को व्यक्तिगत रूप से, जो खाते में परिवर्तन पर अलग तरह के प्रकाश तरंग दैर्ध्य के प्रभाव लेता है पर प्रदर्शन किया जा सकता है। अक्सर यह संभव नहीं है, क्योंकि मोती सभी चैनलों में दिखाई नहीं हैं या मोती छवि एक चैनल में बहुत ज्यादा हावी रहे हैं और अन्य चैनल (ओं) में भी मंद कर रहे हैं। ठेठ समाधान केवल पता लगाने और पंजीकरण और अधिग्रहण परिवर्तन मॉडल के लिए एक चैनल में दिखाई मोतियों का इस्तेमाल होता है (यानी पता लगाने, पंजीकरण और समय चूक पंजीकरण के बाद) तब फिजी> प्लगइन्स> मल्टीव्यू Reconstr द्वारा अन्य चैनलों के लिए लागू किया जाता हैuction> बैच प्रोसेसिंग> उपकरण> डुप्लीकेट परिवर्तनों। ड्रॉप डाउन मेनू में अन्य चैनलों के लिए एक का चयन करें चैनल के परिवर्तन लागू करने के लिए। निम्न विंडो में एक्सएमएल का चयन करें और ठीक क्लिक करें। तब चैनल है कि स्रोत चैनल के रूप में मोती होता है और लक्ष्य चैनल के रूप में चैनल (एस) मोती के बिना चयन का चयन करें। डुप्लीकेट के लिए जो परिवर्तनों सभी परिवर्तनों और प्रेस ठीक बदलें का उपयोग करें। परिवर्तनों तो अन्य सभी चैनलों के लिए नकल की है और एक्सएमएल में बच रहे हैं। ViewSetup एक्सप्लोरर में नए परिवर्तनों को देखने के लिए, पुनः आरंभ MultiView पुनर्निर्माण आवेदन।

बंद डब्बा

कई विचार के विलय computationally बहुत गहन है। हालांकि, बड़े चित्र आमतौर पर न केवल नमूना है, लेकिन यह भी चारों ओर मोतियों को समायोजित करने के लिए अर्जित कर रहे हैं। एक बार पंजीकरण पैरामीटरएस मोतियों से निकाले जाते हैं, वे छवि के भाग के रूप में नहीं रह उपयोगी होते हैं। इसलिए, संलयन की दक्षता बढ़ाने के लिए, केवल नमूना युक्त छवि के ढेर के कुछ हिस्सों को आपस में जुड़े हुए किया जाना चाहिए। ब्याज (bounding बॉक्स) के एक क्षेत्र नमूना को रोकने के लिए और परिभाषित किया जाना चाहिए संभव के रूप में के आसपास के रूप में छोटे agarose। चित्रा 2 में उदाहरण के लिए 2229 × 2136 × 2106 पिक्सल के साथ पूरी मात्रा पर एक भारित औसत संलयन, राम के 38,196 एमबी की आवश्यकता होगी, जबकि एक bounding बॉक्स के साथ मात्रा 1634 × 1746 × 1632 पिक्सल के लिए कम है और स्मृति आवश्यकताओं को कम कर रहे हैं 17729 MB करने के लिए।

सामग्री आधारित MultiView संलयन

MultiView डेटा fusing में चुनौती यह है कि आम तौर पर देखा गया अचानक अंत और एक ही voxels के लिए एक ही छवि गुणवत्ता को शामिल नहीं करते। विचारों की साधारण औसत इसलिए सम्मिश्रण कलाकृतियों और अनावश्यक छवि गिरावट के लिए नेतृत्व करेंगे। सामग्री आधारित MultiView फू सायन खाते में इन दोनों समस्याओं का समय लगता है। सबसे पहले, यह अलग अलग विचार मिश्रणों, जहां एक छवि समाप्त हो जाती है और एक दूसरे को शुरू होता है और दूसरा, यह स्थानीय छवि गुणवत्ता का आकलन और फ्यूजन 21 में उच्च छवि गुणवत्ता के लिए उच्च भार लागू होता है। एक ही दृश्य की तुलना में XY में संकेत के एक मामूली गिरावट (चित्रा 2 ई-एच, चित्रा 5 ए-डी) के साथ Z में संकल्प के एक सुधार है।

मल्टीव्यू deconvolution

मल्टीव्यू deconvolution एक और दृष्टिकोण विचारों के विलय को प्राप्त है। इस विधि के साथ भी अलग अलग विचार के PSFs आदेश छवि है कि माइक्रोस्कोप के द्वारा प्रकाशिकी convolved कर दिया गया है ठीक करने के लिए ध्यान में रखा जाता है। इस विधि को काफी छवि कलंक को दूर करने और संकल्प और संकेत 31 (चित्रा -2 सी-डी, चित्रा 2I-जम्मू, चित्रा 5E-जी, मूवी 3) के विपरीत बढ़ाने के द्वारा छवि गुणवत्ता में सुधार।

ve_content "> Deconvolution computationally बहुत गहन है इस प्रकार का उपयोग कर प्रसंस्करण के लिए एक GPU इस प्रक्रिया की गति बढ़ जाती है (1 टेबल देखें)। यह भी नीचे नमूना डेटा पर deconvolution प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हो सकता है। नीचे नमूना करने के लिए, का उपयोग फिजी> मल्टीव्यू पुनर्निर्माण > बैच प्रोसेसिंग> उपकरण> लागू परिवर्तनों। यह देखा गया है कि एक्सएमएल फ़ाइल में सहेजा जाएगा पर एक नया परिवर्तन मॉडल लागू होगा।

BigDataViewer और BigDataServer के लिए HDF5 फ़ाइल स्वरूप

BigDataViewer 33 टेराबाइट डेटा के आकार की आसान दृश्य अनुमति देता है। कैसे BigDataViewer नियंत्रित करने के लिए 2 टेबल में संक्षेप। कार्यक्रम के बुनियादी आपरेशन के एक स्क्रीनकास्ट अपने मूल प्रकाशन 33 में एक पूरक के रूप में भी उपलब्ध है। BigDataViewer एक एक्सएमएल फ़ाइल है, जो मेटाडाटा होता है, और एक HDF5 फ़ाइल, जो छवि डेटा होता है पर केंद्रित है। छवि डेटा राष्ट्रपति हैं3 डी ब्लॉक में कई संकल्प के स्तर में HDF5 में ईएनटी। कई संकल्प स्तर, डेटा कम संकल्प के साथ तेजी से visualizing के लिए अनुमति देने से पहले पूर्ण संकल्प से भरी हुई है। व्यक्तिगत ब्लॉक केवल जब जरूरत स्मृति में लोड कर रहे हैं। इस प्रकार, HDF5 छवि प्रारूप BigDataViewer 33 के माध्यम से डेटा का प्रत्यक्ष और तेजी से दृश्य की अनुमति देता। यह भी के बाद से फ़ाइलों की लोडिंग और अधिक कुशलता से बाहर किया जाता है प्रसंस्करण गति। इसलिए, हम इस प्रारूप में डाटासेट resaving सिफारिश हालांकि यह सख्ती से प्रसंस्करण के लिए आवश्यक नहीं है। डेटा स्वरूप के आगे स्पष्टीकरण के लिए, कृपया देखें लिंक 3 । इसके अतिरिक्त, डेटासेट सहयोगियों या सार्वजनिक BigDataServer 33 (प्रयोग के साथ साझा किया जा सकता लिंक 6 )।

प्रभाव
कुंजी
एफ 1 और BigDataViewer का एक संक्षिप्त विवरण अपनी बुनियादी आपरेशन के साथ सहायता से पता चलता है
<> या माउस पहिया Z में आंदोलन
ऊपर और नीचे तीर में और बाहर ज़ूम
ठीक क्लिक करें और खींचें दर्शकों में नमूना ले जाता है
बाएँ क्लिक करें और खींचें कर्सर के आसपास घूमता है नमूना
दर्शक या टैब और छोड़ दिया है या सही तीर के नीचे स्लाइडर समय धुरी पर चलता रहता है
इसके अतिरिक्त पारी दबाने तेजी से आंदोलन या रोटेशन किसी भी अक्ष के साथ
एक्स और फिर छोड़ दिया और सही तीर एक्स अक्ष के चारों ओर घूमता
Y और फिर छोड़ दिया और सही तीर वाई अक्ष के चारों ओर घूमता
जेड और फिर छोड़ दिया और सही तीर जेड धुरी के चारों ओर घूमता है
पारी और एक्स एक्स अक्ष के साथ दृश्य orients
पारी और y Y अक्ष के साथ दृश्य orients
पारी और z जेड अक्ष के साथ दृश्य orients
मैं विभिन्न प्रक्षेप मोड के बीच स्विच (यानी निकटतम पड़ोसी और तीन रेखाओ)
एस या सेटिंग> चमक और विपरीत चैनल, चमक और विपरीत के रंग को संशोधित
F6 या सेटिंग> दृश्यता और समूहीकरण प्रदर्शित किया समूहों में परिवर्तन, संख्या चाबियाँ के माध्यम से विभिन्न समूहों overlaying और समूहों फोन करने के लिए सक्षम बनाता है समूहीकरण
F10 या उपकरण> रिकार्ड मूवी वर्तमान में प्रदर्शित टुकड़ा का एक समय श्रृंखला का अधिग्रहण

तालिका 2: बिग डाटा दर्शक।

3. LSFM का वर्णन किया कार्यान्वयन की सीमाएं

कम throughput

एक ठेठ LSFM प्रयोग में केवल प्रयोग के प्रति एक नमूना imaged है। फिर भी, हमारे अनुभव में, उपयोगी जानकारी का एक बहुत है कि एक नमूना से निकाला जा सकता है। कई भ्रूण के उच्च throughput इमेजिंग हाल ही नमूना स्थिति और रोटेशन की स्वतंत्रता की कीमत पर घर बनाया LSFM setups 46-48 में हासिल किया गया है, हालांकि आम तौर पर।

ऊतकों में अपर्याप्त पैठ गहरी

हालांकि zebrafish भ्रूण पारभासी हैं, प्राप्त छवि गुणवत्ता जल्दी से बिगड़ती जा रही है जब बिखरने और अवशोषण के कारण ऊतकों में गहरी इमेजिंग। आंशिक रूप से इस बिखरने और नमूना द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति के अवशोषण का एक प्रभाव है और मौजूदा सेटअप में सही नहीं किया जा सकता है। असमान छवि गुणवत्ता का एक अन्य स्रोत अनियमित रोशनी है। टीवह प्रकाश चादर और बाईं या दाईं ओर से इस घटना के लिए अपने रास्ते यह अपवर्तित, जो धारी कलाकृतियों और कलंक में यह परिणाम में किसी भी वस्तु है। दोहरी तरफा रोशनी और MultiView संलयन अंतिम छवि में कलाकृतियों कम कर सकते हैं। अन्त में, छवि गुणवत्ता प्रकाश शीट, जो किनारों की ओर मोटा होता जा रहा है की प्राकृतिक ज्यामिति के कारण देखने के क्षेत्र के मार्जिन की दिशा में थोड़ा बुरा हो जाता है।

लिमिटेड रासायनिक हेरफेर

दवाओं या अवरोधकों का उपयोग zebrafish अनुसंधान के क्षेत्र में बड़े पैमाने पर है। दवाओं की इस माइक्रोस्कोप उपयोग में विवश है, नमूना कक्ष और साधन के अन्य उपयोगकर्ताओं को, जो एक ही कक्ष साझा की बातों की बड़ी मात्रा के कारण है। एक अतिरिक्त कक्ष दवा प्रयोगों के लिए समर्पित का उपयोग करते हुए इस मुद्दे को हल कर सकते हैं। कांच के मोती के साथ आंशिक रूप से चैम्बर भरने तरल की मात्रा आवश्यक है कि कम करता है।

कोई photomanipulation

कुरेनtly वहाँ photoconversion, या इस माइक्रोस्कोप में लेजर पृथक तरह स्थानीय ऑप्टिकल गड़बड़ी की कोई संभावना नहीं है। फिर भी, घर बनाया setups ऐसे विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

4. महत्व और भविष्य के अनुप्रयोगों

LSFM सबसे अच्छा तरीका रहते भ्रूण की बड़ी मात्रा का तेज इमेजिंग के लिए तिथि करने के लिए उपलब्ध है। प्रयोगों एक confocal खुर्दबीन पर बोधगम्य के अधिकांश भी ऊपर उल्लिखित फायदे के साथ एक प्रकाश चादर खुर्दबीन पर किया जा सकता है। आंख विकास की इमेजिंग के मामले में, LSFM की गति महत्वपूर्ण पैरामीटर नहीं है। इसके बजाय, कम phototoxicity और नमूना स्थिति में लचीलापन निर्णायक लाभ कर रहे हैं।

LSFM डेटा एक उच्च SNR है, जो अच्छा deconvolution परिणाम प्राप्त करने में मदद करता है और यह भी स्वचालित छवि विश्लेषण और वस्तु ट्रैकिंग के लिए फायदेमंद है। अंत में, LSFM भ्रूण विकास और Overa पर मात्रात्मक डेटा पैदा करने के लिए एक महान उपकरण हैटू सेल और बाद मॉडलिंग और प्रश्न में प्रक्रियाओं के भौतिक विवरण के लिए ऊतक विशेषताओं।

Disclosures

इस वीडियो लेख का प्रकाशन जीस द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lightsheet Z.1 microscope Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose Roth 6351.1
Low melting point agarose Sigma A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) Sigma E10521
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050 Millipore (Estapor) 80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries Brand 701904 sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries Brand 701932 sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55 Dumont 0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes Becton Dickinson 300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes Becton Dickinson 397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration
http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer http://fiji.sc/BigDataServer

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References

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Icha, J., Schmied, C., Sidhaye, J.,… More

Icha, J., Schmied, C., Sidhaye, J., Tomancak, P., Preibisch, S., Norden, C. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. J. Vis. Exp. (110), e53966, doi:10.3791/53966 (2016).

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