Developmental Biology

Brug Light Sheet Fluorescens mikroskopi til billede zebrafisk Eye Development

Published: April 10, 2016 doi: 10.3791/53966

Jaroslav Icha*¹, Christopher Schmied*¹, Jaydeep Sidhaye¹, Pavel Tomancak¹, Stephan Preibisch^1,2,3, Caren Norden¹

¹Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, ²HHMI Janelia Research Campus, ³Berlin Institute of Medical Systems Biology of the Max Delbrück Center

* These authors contributed equally

Introduction

Morfogenese er den proces, der former embryonet og sammen med vækst og differentiering driver ontogeni fra et befrugtet æg i en moden multicellulær organisme. De morfogenetiske processer under dyr udvikling kan analyseres bedst ved billeddannelse af intakte levende eksemplarer ^1-3. Dette er fordi sådan hele embryo billeddannelse bevarer alle de komponenter, som driver og regulerer udvikling, herunder gradienter af signalmolekyler, ekstracellulær matrix, vaskulatur, innervation samt mekaniske egenskaber af det omgivende væv. At bygge bro over skalaer, hvor morfogenese opstår, de hurtige subcellulære begivenheder skal indfanges på et minut tidsskala i forbindelse med udvikling af hele væv løbet timer eller dage. For at opfylde alle disse krav, blev en moderne implementering ⁴ i den retvinklede plane belysning mikroskop ⁵ udviklet. Oprindeligt blev det navngivet Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) ^4; nu en altomfattende sigt Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM) anvendes typisk. LSFM muliggør billedbehandling med høj tidsopløsning, mens fremkalde mindre fototoksicitet end laserscanning eller spinning disc konfokale mikroskoper ^6,7. I dag er der allerede mange implementeringer af den grundlæggende lys ark belysning princip, og det har været brugt til at afbilde et stort udvalg af prøver og processer hidtil utilgængelige for forskere ^8-11.

Vi vil først gerne fremhæve en række vigtige fordele ved LSFM forhold til konventionelle konfokal mikroskopi tilgange:

At erhverve meningsfulde resultater fra levende billeddannelse mikroskopiske eksperimenter, er det vigtigt, at observationen kun minimalt påvirker prøven. Men mange organismer, herunder zebrafisk er meget modtagelige for laserlys eksponering, hvilket gør det svært at billedet dem i et konfokalt mikroskop med høj tidsopløsning uden fototoksicitet efeffekter som gået i stå eller forsinket udvikling ^6,7. LSFM er i øjeblikket den fluorescens billeddannelse teknik med de mindst skadelige virkninger for prøven ^7. Da den tynde laserlys ark lyser kun den del af prøven, der afbildes på et bestemt tidspunkt, lyspladen mikroskopet er hjælp fotoner meget effektivt. Derfor den lave lys eksponering giver mulighed for længere time-lapse observationer af sundere prøver, fx ^12-17. Desuden, takket være den minimale invasivitet af LSFM, antallet af erhvervede billeder er ikke længere bestemt af hvor meget lys prøven kan tåle, men snarere ved, hvor mange data kan bearbejdes og lagres.

På samme måde at holde modellen i nær fysiologiske forhold, LSFM kommer med alternative prøve montering strategier velegnet til levende fostre. I LSFM teknikker er de embryoner typisk indlejret i en tynd søjle af lav procentdel agarose. Den mounting til agarose cylindre giver mulighed for fuldstændig fri rotation, så prøven kan observeres fra den perfekte vinkel (i LSFM benævnt visning) og fra flere synspunkter på samme tid. Den multiview billedbehandling og efterfølgende MultiView fusion er gavnligt især for store, spredning prøver og tillader fange dem med høj, isotropt opløsning. Et resumé af andre mulige LSFM montering strategier kan findes i den officielle mikroskop betjeningsvejledning, i kapitlet om prøveforberedelse skrevet af laboratoriet af E. Reynaud. Det er en anbefalet læsning, især hvis målet er at billedet forskellige prøver end beskrevet her.

Overtagelsen billede i LSFM er bredt felt, kamera-baseret, i modsætning til laser scanning konfokal mikroskop. Dette resulterer i en højere signal-støj-forholdet (SNR) for anskaffede billeder og kan være yderst hurtig (ti til hundrede billeder i sekundet). Den høje følsomhed LSFM muliggør yderligere billeddannelse af svagt fluorescerende Samples, ligesom transkriptionsfaktorer udtrykt på endogene niveauer ¹⁸ eller i den nærmeste fremtid, endogene proteiner kodet ved hjælp CRISPR / Cas9. Den høje SNR er også vigtig for en vellykket nedstrøms billedanalyse. Den høje hastighed er forpligtet til ikke blot at fange hurtige intracellulære processer, men også at billedet hele embryo fra flere synspunkter hurtigt nok. kan kun opnås en problemfri fusion af de mange synspunkter, hvis det observerede fænomen ikke ændres under erhvervelse af disse flere z stakke fra separate visninger.

Fordelene ved LSFM typisk ikke ske på bekostning af billedkvaliteten. Den laterale opløsning på LSFM er lidt dårligere end opløsningen af et konfokalt mikroskop. Dette skyldes, at målene påvisning anvendes i LSFM har lavere numeriske apertur (sædvanligvis 1,0 eller mindre) sammenlignet med 1,2-1,3 vand eller silicium immersionsobjektiver på standard konfokale opsætninger. Derudover grund af den brede felt afsløring i LSFM (absence af et lille hul), der er mere ude af fokus lys i forhold til et konfokalt mikroskop. Mængden af ude-af-fokus lys bestemmes af lys pladetykkelse. Ikke desto mindre er disse ulemper kompenseres ved højere SNR i LSFM. I praksis resulterer dette i lignende kvalitet billeder i forhold til for eksempel spinning disk konfokal erhvervelse ^15. Derfor er dette muliggør pålidelig udvinding af funktioner som cellemembraner eller kerner, fx for celle afstamning sporing ^15,19.

Den aksiale beslutning af LSFM bestemmes, foruden påvisningen mål af lyset pladetykkelse. Den aksiale opløsning på LSFM kan i nogle tilfælde overgå løsning af konfokale mikroskoper. For det første forbedring i beslutningen kommer, når lyset plade er tyndere end den aksiale opløsning på påvisning mål, der typisk sker for store prøver afbildet med en lav forstørrelse mål. Den anden måde, hvordan LSFM kan ACHieve bedre aksial opløsning, er det multiview fusion, hvor den høje xy opløsning information fra forskellige synspunkter er kombineret i ét billede stakken. Det resulterende fusionerede stak har en isotrop opløsning nærmer værdierne af opløsningen i sideretningen ^20,21. Strategien til registrering af flere visninger på hinanden beskrevet i denne artikel er baseret på anvendelse af fluorescerende polystyren perler som betroede markører indlejret i agarose omkring prøven ^20,21.

Som et resultat af den LSFM kommercialisering, denne teknik er nu tilgængelig for et bredt publikum af forskere ^22. Derfor er motivationen til at skrive denne protokol er at gøre denne teknologi tilgængelig for udviklingsmæssige biologer mangler praktisk erfaring i LSFM og at få disse forskere begyndte at bruge denne teknologi med deres prøver. Vores protokollen bruger den kommercielle lys ark mikroskop, som udgør en begrebsmæssigt enkel mikroskop that er nem at betjene. Vi vil desuden gerne nævne andre nylige protokoller til billeddannelse zebrafisk med hjemmelavede bygget LSFM opsætninger, som kan være egnet til at besvare bestemte spørgsmål ^23-25. En anden indgang mulighed for at LSFM er de åbne platforme ^26,27, som bruger de åbne adgang principper at bringe lys ark mikroskopi til en bredere samfund. Dokumentationen af både hardware og software aspekter kan findes på http://openspim.org og https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.

I denne protokol, bruger vi teleost zebrafisk som et modelsystem til at studere udviklingsprocesser med LSFM. Morfogenese af zebrafisk øjet er et eksempel, understreger mange af fordelene ved LSFM. LSFM er allerede blevet anvendt i fortiden for at undersøge øjet udvikling i Medaka ²⁸ og i zebrafisk ^29,30. På det tidlige stadium af øjet udvikling det er kompliceret at orientere embryo korrekt for konventionelle mikroskopi,som den voluminøse blommen ikke tillader embryonet at ligge på den side med øjet vender mod målet. Men med LSFM montering i en agarose søjle, prøven kan reproducerbart placeret. Derudover under overgangen fra optikken vesikel til optikken cup fase, øjet foretages større morfogenetiske omlejringer ledsaget af vækst, der kræver indfange et stort z stakken og en stor synsfelt. Også til disse udfordringer LSFM er overlegen i forhold til konventionel konfokal billeddannelse. Processen med optiske kop dannelse er tredimensional, derfor er det svært at forstå og visualisere udelukkende ved billeddannelse fra en oversigt. Dette gør MultiView billeddannelse med isotropisk opløsning gavnligt. Efter optisk kop dannelse, nethinden bliver stadig følsomme over for laser eksponering. Den lave fototoksicitet forbundet med LSFM er således en stor fordel for langsigtet billeddannelse.

Her præsenterer vi en optimeret protokol til billeddannelse af en til tre dage gamle zebrafisk embryoner ennd larver med fokus på øjet udvikling. Vores metode giver mulighed for optagelse af time-lapse film, der dækker op til 12-14 timer med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Vigtigt er det, viser vi også en rørledning til databehandling, hvilket er et vigtigt skridt i LSFM, da denne teknik uvægerligt genererer store datasæt, ofte i terabyte rækkevidde.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med Den Europæiske Union (EU) direktiv 2011/63 / EU og den tyske dyreværnsloven. Protokollen er beregnet til at blive fulgt uden afbrydelse, fra montering til billeddannelse af prøven. Afhængig af den praktiske erfaring, vil det tage 2-3 timer at starte en tidsforskudt eksperiment. Databehandling er ikke inkluderet i denne tid beregning. Alt det nødvendige til forsøget materiale kan findes i checkliste over materiale nødvendig før start, der leveres som et supplerende dokument. Bær pulver fri handsker under trin 1, 2, 3 og 4. For trin 2, 3, 4 og 5 i protokollen også henvise til den officielle mikroskop betjeningsvejledning.

1. Forberedende arbejde Før Imaging Experiment

Fluorescent Bead Stock Solution
1. Til denne protokol, skal du bruge 500 eller 1000 nm polystyren diameter perler (mærket med rød udsender fluorescerende farvestof). Arbejdsgruppen fortynding af perlerne er 1: 4,000. Først vortex perlen stamopløsning i 1 minut. Fortynd 10 pi perler i 990 ul Hedeselskabet ₂ O. løsningen i mørke ved 4 ° C Opbevar og bruge denne 1: 100 fortynding som stamopløsningen til yderligere fortynding i 1:40.
Forberedelse løsning for Sample kammer
1. I et 100 ml bægerglas mix 38,2 ml E3-medium uden methylenblåt, 0,8 ml 10 mM N -phenylthiourea og 1 ml 0,4% MS-222. Det er gavnligt at bruge filtreret E3-medium for at undgå små partikler af støv eller uopløste krystaller flyder i prøvekammeret senere.
Fluorescerende Fish Embryo Selection
1. I dagene forud for forsøget, forberede embryoner, der udtrykker fluorescerende proteiner. Lige før forsøget, sortere embryoner under fluorescerende stereoskop for ønskelig styrke af fluorescerende signal. Tag 5-10 sunde fostre og dechorionate dem ved hjælp af en pincet.
  BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til 16-72 timer gammelembryoner.

2. Opsætning af Sample Afdeling

Montering af Three Afdeling Windows
1. Der er 4 vinduer i prøvekammeret, en for formålet og tre, som skal forsegles med dækglas (18 mm diameter, der er udvalgt tykkelse 0,17 mm). Gemme disse dækglas i 70% ethanol. Tør dem rene før brug med ether: ethanol (1: 4).
2. Sæt dækglasset i vinduet ved hjælp fine pincet og sørg for at det passer ind i mindste rille. Dæk den med 17 mm gummi diameter O-ring og skru belysningen adapterring hjælp kammeret vinduet værktøj. Gentag processen for de to andre vinduer.
Montering af Resterende Chamber Parts
1. Skrue adapter til et passende mål ind i den fjerde resterende side af kammeret. Sæt 15 mm diameter O-ring ind i midten af adapteren.
2. Skrue i den hvide Luer-Lock adapter i nederste højre åbning i chamber og det grå drain stik i øverste venstre åbning. Bloker alle de tre resterende åbninger med de sorte blindpropper.
3. Fastgør Peltier blokken og metal svalehale slide kammerets bund ved hjælp af en unbrakonøgle. Fastgør slangen med 50 ml sprøjte til Luer-Lock-adapter. Indsæt temperatursonden ind i kammeret.
Isætning af Mål og salen i mikroskop
1. Kontroller under Stereoskopet at alle målene er rene. Brug 10X / 0,2 belysning målsætninger og detektion målsætning Plan-Apochromat 20X / 1.0 W, og sørg for, at dets brydningsindeks korrektion krave er sat til 1,33 for vand. Skru afsløring mål ind i mikroskopet, og samtidig holde de lysende mål dækket.
2. Fjern plastbeskyttelseshætterne dækker lysende mål. Skub forsigtigt kammeret ind i mikroskopet og stram den med sikring skruen.
3. Tilslut temperatur provære og Peltier blok med mikroskopet.
  BEMÆRK: De to rør, der cirkulerer kølevæsken for Peltier blokken er forenelige med begge stik. De danner en fungerende kredsløb uanset orienteringen af forbindelsen.
4. Fylde kammeret gennem sprøjten med opløsningen fremstillet i trin 1.2 op til den øverste kant af kammeret vinduer. Kontroller, at kammeret ikke er utæt.
5. Start mikroskop, udrugning og de kontrollerende og opbevaring computere. Start mikroskopet-drift software og indstille inkubationstemperaturen til 28,5 ° C.
  BEMÆRK: Det vil tage en time til helt ligevægt. Forbered prøven i mellemtiden.

3. Prøvefremstilling

Forberedelse af Agarose Mix
1. 15 min før Agarosens mix, smelte en 1 ml prøve af 1% agarose med lavt smeltepunkt (opløst i E3-medium) i en varmeblok indstillet til 70 ° C. Når agarose er helt molti, overføre 600 pi i et frisk 1,5 ml rør, tilsættes 250 pi E3-medium, 50 pi 0,4% MS-222 og 25 pi hvirvelbehandlet bead stamopløsning.
  BEMÆRK: Dette gør 925 pi af blandingen, mens yderligere 75 pi beregnes for den tilsatte senere sammen med embryonerne væske.
2. Hold røret i en anden opvarmning blok ved 38-40 ° C eller sikre, at agarose er meget tæt på sin geldannende punkt, før du sætter prøve embryoner i den.
Montering af Embryoner
1. Tag fem glas kapillærer på 20 pi volumen (med et sort mærke, ~ 1 mm indvendig diameter) og indsæt de matchende Teflon tip stempler ind i dem. Tryk stemplet gennem kapillarrøret, således at teflon spids er i bunden af kapillæren.
2. Transfer fem embryoner (et nummer, der kan monteres på en gang) med et glas eller plastik pipette ind i røret af hvirvelbehandlet 37 ° C varm agarose mix.
  BEMÆRK: Prøv at overføre et minimum volumen af væske sammen with embryonerne.
3. Sæt kapillar ind i blandingen og suge en embryo inde ved at trække stemplet op. Sørg for, at lederen af fosteret ind i kapillarrøret før halen. Undgå luftbobler mellem stemplet og prøven. Der bør være ± 2 cm af agarose over embryo og ± 1 cm under det. Gentag for de resterende embryoner.
4. Vent til agarose størkner helt, hvilket sker inden for et par minutter, og derefter gemme prøverne i E3 medium, ved at stikke dem til væggen i et bæger med modellervoks eller tape. Bundåbningen af kapillæren bør hænge frit i opløsningen tillader gasudveksling til prøven.
  BEMÆRK: En tilsvarende protokol til afsnittene 3.1 og 3.2 kan også findes på OpenSPIM wikisiden http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

4. Prøve Positionering

Prøve Holder Assembly
1. Sæt 2 plast ærmer i den rigtige størrelse (sort)mod hinanden ind i prøveholderen stilken. Deres opskårne sider nødt til at vende udad. Fastgør klemmen skrue løst ved at dreje den 2-3 runder. Sæt kapillar gennem klemmen skrue og presse det igennem holderen, indtil den sorte farve band bliver synlig på den anden side. Undgå at røre ved stemplet.
2. Spænd klemme skrue. Skub overskydende 1 cm agarose under foster ud af kapillære og klippe det. Sæt stilken i prøveholderen disken.
3. Bekræft i den software, mikroskopbordet er i fyldestilling. Brug førerskinnerne at glide hele holderen med prøven lodret nedad ind i mikroskopet. Vend den, så de magnetiske holder disk låser på plads.
Lokalisering af Kapillær
1. Fra nu af, kontrollere prøven positionering af softwaren. På fanebladet Find vælger Find kapillær option og placere kapillær ix, y og z i fokus lige over afsløring objektive linse. Brug den grafiske repræsentation i prøven navigator for vejledning.
2. Skub embryo forsigtigt ud af kapillarrøret, indtil den er foran pupillen i afsløring mål.
  BEMÆRK: "Find kapillar 'er den eneste trin i de resterende protokol, i hvilken den øvre låg af mikroskopet skal åbnes, og prøven skubbet ud.
Lokalisering af Sample
1. Skift til "Find prøve 'og ved 0,5 zoom bringe zebrafisk øjet ind i midten af synsfeltet. Drej embryo, således at lyset ark ikke vil passere gennem enhver stærkt refraktive eller absorberende dele af prøven før den når øjet. Ligeledes udsendte fluorescens behov en klar vej ud af prøven. Klik på 'Set Udgangsposition «.
2. Åbn hoveddøren af mikroskopet og satte plastkappe med en 3 mm åbning på toppen af kammeret for at undgå fordampning.
  BEMÆRK: Hvis væskeniveauet falder til underimaging niveau, vil forsøget blive kompromitteret.
3. Kontroller hjerteslag af fosteret som en proxy for den generelle sundhed. Hvis det er for langsom, bruge en anden prøve (sammenlignet med ikke-monteret kontroller; specifikke værdier afhænger af udviklingsstadiet). Skift til den endelige zoom indstilling og justere positionen af embryoet.

5. Opsætning af en flerdimensionel Acquisition

Erhvervelse Parametre
1. Skift til fanen 'Acquisition'. Definer strålegangen herunder laserlinjer, afsløring mål, laser blokerer filter, beam splitter og kameraerne.
2. Aktivér afkrydsningsfeltet pivot scanning. Definer de andre erhvervelse indstillinger som bitdybden, billedformat, lys pladetykkelse og vælge enkeltsidet belysning.
3. Tryk »vedvarende« og afhængigt af intensiteten af det opnåede billede ændre lasereffekten og kamera eksponeringstid.
  BEMÆRK: Til justering af alle billeddiagnostiske indstillinger bruger less laser effekt (0,5% af 100 mW laser, 30 msek eksponeringstid), end for selve forsøget på at undgå unødig foto skaden på prøveemnet.
Let justering Sheet
1. Skift til "Dual-sidet Illumination 'og aktivere 'Online Dual Side Fusio'n afkrydsningsfeltet. Start 'Lightsheet Auto-justering guiden ". Følg anvisningerne trin for trin.
  BEMÆRK: Guiden bevæger lyset ark i brændplanet af påvisning mål, og sikrer, at det ikke vippes, og dens talje i midten af synsfeltet. Efter at have afsluttet den automatiske justering, er placeringen af de venstre og højre lys ark opdateres automatisk i softwaren. En forbedring af billedkvaliteten skulle nu være indlysende. Aktivér afkrydsningsfeltet 'Z-stack'.
2. Check lyspladen justering ved at inspicere symmetrien i punktspredningsfunktionen (PSF) givet ved de fluorescerende perler i xz og yz ortho visning. Hvis det ikket symmetrisk, manuelt justere lyset ark parameter position op og ned, indtil opnåelse af en symmetrisk timeglas formet PSF (figur 1A).
Flerdimensionale Acquisition Indstillinger
1. Definer z-stakken med "First Slice" og "Sidste Slice 'indstillinger og sæt z trin til 1 um.
  BEMÆRK: lyspladen i dette mikroskop er statisk og z sektionering opnås ved at bevæge prøven gennem. Brug altid "Bildsekvenser 'muligheden for hurtigere erhvervelse af z-stakke.
2. Aktiver afkrydsningsfeltet "Time Series '. Definer det samlede antal tidspunkter og intervallet mellem dem.
3. Aktivér afkrydsningsfeltet 'Multiview «. Tilsæt aktuelle visning i multiview listen, hvor x, y, z og vinkel information lagres. Brug scenen controller til at rotere kapillære og definere de andre ønskede synspunkter. Opsæt en z-stak på hver visning og tilføje dem til multiview listen.
  BEMÆRK:software sorterer visninger i en seriel måde, således at kapillarrøret er slået ensrettet, mens billedet er erhvervet.
Drift Rettelse og Start af Experiment
1. Når købet oprettet er færdig, skal du vente 15-30 min før du starter den egentlige eksperiment.
  BEMÆRK: Prøven oprindeligt driver nogle få mikrometer i x, y og z, men skal stoppe inden for 30 min. Hvis prøven holder drivende i længere tid, bruge en anden prøve eller remount.
2. Skift til fanen 'Vedligehold' og i 'streaming' option definere, hvordan data skal gemmes, f.eks en fil pr tidspunkt eller separat fil for hver visning og kanal. Gå tilbage til fanen 'Acquisition', tryk på 'Start Experiment "og definere filnavnet, placering, hvor det skal gemmes, og filformatet (brug .czi).
3. Overhold erhvervelsen af det første tidspunkt at bekræfte, at alt kører fejlfrit. Umiddelbart gå videre med registreringenog fusion af det første tidspunkt, som beskrevet i trin 6 og 7, for at bekræfte, at det vil være muligt at behandle hele datasættet.

6. Multiview Registrering

Multiview Genopbygning Application
1. Ved slutningen af det billeddannende samling, overføre data fra datalagringsenheden computer på mikroskopet til en databehandling computer. Brug 'MultiView ReconstructionApplication ^'20,21,31 implementeret i Fiji ³² til databehandling (figur 1B).
Definer datasæt
1. Opdater Fiji: Fiji> Hjælp> Opdater ImageJ og Fiji> Hjælp> Opdater Fiji. Brug vigtigste ImageJ og Fiji opdatere sites.
2. Overfør hele datasættet i én mappe. Resultaterne og mellemliggende filer af behandlingen vil blive gemt i denne mappe. Start MultiView Genopbygning Anvendelse: Fiji> Plugins> Multiview Genopbygning> Multiview Genopbygning Application.
3. Vælg 'definere en ny datasæt «. Som type datasæt vælge meu option "Zeiss Lightsheet Z.1 datasæt (LOCI Bioformats)" og skabe et navn for .xml-fil. Vælg derefter den første .czi fil af datasættet (dvs. fil uden indeks). Den indeholder billeddata samt metadata af optagelsen.
  BEMÆRK: Når programmet åbner den første .czi fil, er metadata indlæst i programmet.
4. Bekræft, at antallet af de vinkler, kanaler, illuminationer og observere voxelstørrelsen fra metadata. Ved at trykke på OK, observere tre separate vinduer åbne (Figur 1C): en log vindue, som viser forløbet af behandlingen og dens resultater, den 'ViewSetup Explorer' og en konsol, der viser fejlmeddelelser i Fiji.
  BEMÆRK: "ViewSetup Explorer 'er en brugervenlig grænseflade, der viser hver visning, kanal og belysning og giver mulighed for valg af filer af interesse. Derudover 'ViewSetup Explorer' giver mulighed for styring af alle procestrin.
5. Vælg de filer, der skal bearbejdes, og tryk på højre museknap i explorer. Overhold et vindue åbent med forskellige procestrin (Figur 1C).
6. Ved at definere datasættet, konstatere, at en .xml fil i mappen med de data er oprettet.
  BEMÆRK: Denne fil indeholder metadata, der blev bekræftet før.
7. I øverste højre hjørne observere to knapper 'info "og" gem ". Ved at trykke "info" viser en oversigt over indholdet af .xml-fil. Ved at trykke "gem" vil spare de behandlinger resultater.
  BEMÆRK: Mens forarbejdning i 'MultiView Genopbygning Application' de forskellige forarbejdningstrin skal gemmes i .xml før lukning Fiji.

OAD / 53.966 / 53966fig1.jpg "/>
Figur 1: Multiview Genopbygning workflow og interesse punkt detektion (A) Lys ark tilpasning baseret på fluorescerende perle billeddannelse.. Systemet er justeret (i midten), når perlen billedet har en symmetrisk timeglas form i XZ og YZ fremskrivninger. Eksemplerne på skævt lys ark i begge retninger, er vist på venstre og højre. De maksimale fremskrivninger af en 500 nm perle i xz intensitet, vises YZ og xy akser. Bemærk, at forholdet mellem intensiteten af den centrale top af den Airy disken (i xy) til sidesløjferne er større, når lightsheet er korrekt justeret i forhold til den skævt situation. Billeder blev taget med 20X / 1,0 W mål på 0,7 zoom. Scale søjle repræsenterer 5 um. (B) Datasættet er defineret, og derefter gemmes igen i HDF5 format. Perlerne segmenteret og derefter registreret. For en tidsserie hvert tidspunkt registreres på en referencetid punkt. Dataene er endelig fusioneret til enenkelt isotropisk volumen. (C, øverst) Den ViewSetup Explorer viser de forskellige tidspunkter, vinkler, kanaler og belysning sider af datasættet. (C, venstre nederste hjørne) The BigDataViewer vindue viser, at der er valgt i ViewSetup Explorer. (C, midterste højre) Højreklik i ViewSetup Explorer åbner behandlingsmuligheder. (C, højre nederste hjørne) Forløbet og resultaterne af behandlingen vises i logfilen. (D og E) Formålet med påvisningen er at segment så mange interesse punkter (perler) med så lidt påvisning i prøven som muligt her vist som skærmbilleder fra interaktive bead segmentering. (D og E, øverste venstre hjørne) Segmenteringen er defineret ved to parametre, Forskellen-of-Gauss Værdier for Sigma 1 og Threshold. (D) Et eksempel på en succesfuld påvisning med et forstørret billede af en korrekt detekteret vulst. (E) Segmentering med for mange falske positiver og flere påvisninger af en enkelt perle. Scale bar i (C) repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Gem datasæt i HDF5 format
1. At gem hele datasættet, vælge alle filer med Ctrl / Apple + a og højreklik. Vælg derefter gem datasæt og som HDF5.
2. Et vindue vises vise en advarsel om, at alle synspunkter i den aktuelle datasæt vil blive gemmes igen. Tryk ja.
  BEMÆRK: Programmet vil fortsætte med at gem de .czi filer til hdf5 ved at åbne hver fil og resaving de forskellige opløsning niveauer i hdf5 format. Det vil bekræfte med "gjort" efter afslutningen. Resaving usually tager et par min pr tidspunkterne (se tabel 1).
  BEMÆRK: Da filerne i hdf5 format kan indlæses meget hurtigt, er det nu muligt at se den uregistrerede datasæt med "højreklik" ind i explorer og skifte "display i BigDataViewer (on / off)«. En BigDataViewer vindue vises med den valgte visning (figur 1C). De centrale funktioner BigDataViewer ³³ er forklaret i tabel 2 og http://fiji.sc/BigDataViewer.
Detect Renter Points
1. Vælg alle tidspunkter med Ctrl / Apple + a og højreklik vælg opdage interesse punkter.
2. Vælg Forskel-of-Gauss ³⁴ for type af interesse point detektion. Da perle-baserede registrering anvendes her, typen "perler" i feltet for etiketten interesse punkter. Aktiver 'nedsampling billeder før segmentering «.
3. I det næste vindue, observere itIndstillinger fdeling. For 'subpixel lokalisering »brug« 3-dimensionelle kvadratisk fit' ³⁴ og at bestemme forskellen-of-Gauss værdier og radius for perle segmentering anvendelse "interaktive" i i'nterest punkt specifikation «.
4. For 'downsample XY »brug« Match Z Opløsning (mindre nedsampling) «og for» downsample Z' brug 1 ×. Z trin størrelse er større end xy pixelstørrelse, således blot ned prøveudtagning xy at matche z opløsning er tilstrækkelig. Vælg 'compute på CPU (JAVA) «. Tryk på 'OK'.
5. I et pop up vindue, skal du vælge en visning for at teste parametrene fra drop down menuen. Når se belastninger, justere lysstyrke og kontrast i vinduet med Fiji> Billede> Juster> Lysstyrke / Kontrast eller Ctrl + Shift + C. Tick boksen 'look for maksima (grøn) "for perle detektion.
6. Overhold segmenteringen i "viewSetup 'grønne ringe, rundtd de fund, når de søger maksima og rød for minima. Segmenteringen er defineret ved to parametre, Forskellen-of-Gauss Værdier for Sigma 1 og tærsklen (Figur 1D). Juster dem at segmentere så mange perler rundt om prøven og så få falsk positive opdagelser inden prøven som muligt (Figur 1D). Detektere hver perle kun én gang og ikke flere gange (figur 1E). Efter bestemmelse af de optimale parametre, tryk på 'udført'.
  BEMÆRK: Påvisning starter ved at indlæse de enkelte udsigt over tidspunkt og segmentere perlerne. I logfilen, programmet udlæser antal perler det detekterede per view. Påvisningen bør ske i nogle få sekunder (se tabel 1).
7. Tryk gem, når mængden af fund er passende (600 til flere tusinde per view).
  BEMÆRK: En mappe vil blive oprettet i data mappen, som vil indeholde INFORMATIOn om koordinaterne for de fundne kugler.
Registrer Brug Renter Points
1. Vælg alle tidspunkter med Ctrl / Apple + a, højreklik og vælg 'Register hjælp Renter Points ".
2. Brug 'hurtige 3d geometriske hashing (rotation invariant) "for perle detektion som" registrering algoritme «.
  BEMÆRK: Denne algoritme forudsætter ingen forudgående viden om orientering og placering af de forskellige synspunkter i forhold til hinanden.
3. For registrering af visninger på hinanden, skal du vælge 'registrere tidspunkter individuelt «som» type registrering «. For 'interesse punkter "i den valgte kanal, skal den tidligere angivne mærke for den interesse punkter nu være synlige (dvs." perler ").
4. I det næste vindue, skal du bruge pre indstillede værdier til registrering. Fastgør den første visning ved at vælge 'Fix fliser: Fix første flise og brug Må ikke kortlægge back "(bruge dette hvis to thees er ikke fast) i feltet 'Kort tilbage fliser' sektionen.
5. Brug en "affin transformation model" med "lovliggørelse".
  BEMÆRK: Den tilladte fejl for RANSAC bliver 5px og "betydning for en deskriptor match 'vil være 10. For» regularisering' anvende 'rigid model "med en lambda på 0,10, hvilket betyder, at omdannelsen er 10% hård og 90 % affine ^35. Tryk på OK for at starte registreringen.
  BEMÆRK: Som vist i logvinduet, først hver visning er matchet med alle de andre synspunkter. Så stikprøven konsensus (RANSAC) ³⁶ tester korrespondancer og udelukker falske positiver. For en robust registrering, bør RANSAC værdien være højere end 90%. Når der findes et tilstrækkeligt antal sande kandidater svarende mellem to visninger, er en transformation model beregnet mellem hver kamp med den gennemsnitlige forskydning i pixels. Så den iterative globale optimering udføres, og alle synspunkter registreres på den faste visning. Med succesfuld registrering, er en transformation model beregnes og vises med sin skalering og forskydning i pixels. Den gennemsnitlige fejl bør være optimalt under 1 px og skalering af transformationen tæt på 1. registrering er udført i sekunder (se tabel 1).
6. Bekræft, at der ikke er noget skift mellem forskellige visninger, som observeret på fine strukturer i prøven, fx cellemembraner. Gem derefter omdannelsen for hver visning i .xml-fil.
  BEMÆRK: Nu registrerede visninger overlapper hinanden i BigDataViewer (figur 2A) og perle billeder skal overlejre samt (figur 2B).
7. Fjern transformationer ved at vælge tidspunkter højreklikke på dem og vælge Fjern Transformations> Seneste / nyeste Transformation derefter.

re 2 "src =" / files / ftp_upload / 53.966 / 53966fig2.jpg "/>

Figur 2:. Resultater af genopbygningen multiview (A) Overlaid registrerede visninger, hver i en anden farve for at demonstrere overlapning mellem dem. (B) Forstørret viser overlapningen på vævede perler afbildet fra de forskellige synspunkter. (C) Nærbillede af en perle efter fusion, PSF er et gennemsnit af de forskellige synspunkter. (D) PSF af samme perle som i (C) efter multiview udfoldning viser, at PSF kollapser ind i et enkelt punkt. (E) xy sektion og (F) yz afsnit af en enkelt afbildning af en optisk vesikel, hvori membraner er mærket med GFP viser nedbrydning af signalet i z dybere i vævet. (G) xy sektion og (H) yz afsnit af samme opfattelse efter vejet gennemsnitlig fusion af 4 visninger cirka 20 grader fra hinanden med lidt flere Degraded xy opløsning samlede men øget z-opløsning. (I) xy sektion og (J) yz afsnit af de samme data efter multiview udfoldning, viser en betydelig stigning i opløsning og kontrast af signalet både i xy og z. Billeder i (EJ) er enkelte optiske skiver. Scale søjle repræsenterer 50 um (A, B, EJ) og 10 um (C, D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Time-lapse Registrering
1. Vælg hele tiden bortfalder, højreklik og vælg 'Register bruge Renter Points "for at stabilisere time-lapse over tid.
2. I "Grundlæggende Registrering Parametre vinduet vælge Match mod en henvisning tidspunkt (ingen global optimering) for type af registrering«. Ke ep t han andre indstillinger er de samme som i registreringen af de enkelte tidspunkter.
3. I den næstevinduet, skal du vælge den tid, der skal bruges som reference, typisk et tidspunkt i midten af time-lapse. Sæt kryds i boksen "overveje hvert tidspunkt som stiv enhed«, da de individuelle synspunkter inden hvert tidspunkt allerede er registreret på hinanden.
4. Sæt kryds i boksen for 'Vis Timeseries statistikker «. andre parametre Registreringen forbliver som før herunder legalisering. Tryk på OK.
  BEMÆRK: I logvinduet, vil det samme output blive vist som i det enkelte tidspunkt registrering. Hvis registreringen for de enkelte tidspunkter var en succes og robust, at RANSAC er nu 99-100%, og den gennemsnitlige, minimum og maksimum fejl er normalt under 1 px. Gem denne registrering, før du fortsætter.

7. Multiview Fusion

BEMÆRK: De resulterende transformationer fra trin registreringskravene bruges til at beregne en sammensmeltet isotropisk stak ud af de mange synspunkter. Denne stak has øget antal z skiver sammenlignet med de oprindelige data, fordi z afstand er nu lig med den oprindelige pixelstørrelse i xy. Sammensmeltningen kan udføres ved enten en indholdsbaseret multiview fusion ^21,31 eller Bayesian-baserede multiview dekonvolution ^31, som begge er implementeret i ansøgningen multiview genopbygning.

afgrænsningsramme
BEMÆRK: Fusion er et beregningsmæssigt dyr proces (se tabel 1), hvilket reducerer mængden af data ved at definere en afgrænsningsramme øger hastigheden af behandlingen.
1. Vælg alle tidspunkter højreklik og vælg Definer 'Afgrænsningsramme «. Brug 'Definér med BigDataViewer "og vælge et navn til afgrænsningsrammen.
2. Flyt skyderen for "min" og "max" i hver akse til at bestemme området af interesse og tryk derefter på 'OK'. Parametrene for afgrænsningsrammen vises.
  BEMÆRK: afgrænsningsrammen vil indeholde alt indenforden grønne boks, der er belagt med et gennemsigtigt magenta lag.
Content-baserede Multiview Fusion
BEMÆRK: Content-baserede multiview fusion ²¹ tager billedet kvalitetsforskelle over stakken (dvs. nedbrydning af signalet i z) i betragtning og anvender højere vægte for bedre billedkvalitet i stedet for at bruge en simpel gennemsnit.
1. Vælg tidspunkt (er), der skal fusioneres i "ViewSetup Explorer ', højreklik og vælg' billede Fusion / Dekonvolution«.
2. I Billed Fusion vinduet, skal du vælge 'Vægtet gennemsnit fusion "fra drop down menuen og vælge' Brug foruddefineret Afgrænsningsramme for Afgrænsningsramme«. For produktionen af smeltet billedet vælge 'Føj til aktuelle XML-projektet', der skriver nye hdf5 filer til de allerede eksisterende hdf5 filer og gør det muligt at bruge de registrerede ikke-fusionerede synspunkter og smeltet billedet sammen. Tryk på 'OK'.
3. Så i "Pre-definere Afgrænsningsramme & #39; pop up vindue vælge navnet på den tidligere definerede afgrænsningsrammen og tryk 'OK'.
4. Overhold parametre afgrænsningsrammen i det næste vindue. For hurtig fusion, anvende en ned prøvetagning på smeltet datasæt.
  BEMÆRK: Hvis smeltet stakken er over en vis størrelse, vil programmet anbefaler at bruge en mere hukommelse effektiv 'ImageLib2 containe'r. Skift fra 'ArrayImg' til 'PlanarImg (store billeder, let at vise) eller CellImg (store billeder)' container, der tillader behandling af større data. Ellers bruger de foruddefinerede indstillinger og anvende "blending og indholdsbaseret fusion«. Fortsæt ved at trykke på 'OK'.
5. Overhold indstillingerne hdf5 i det næste vindue. Brug foruddefinerede parametre og starte fusionsprocessen. Sørg for, at Fiji har tildelt nok hukommelse i Rediger> Valg> Hukommelse & Threads.
Multiview Dekonvolution
BEMÆRK: Multiview Dekonvolution ³¹ er anothendes type multiview fusion. Her desuden til fusionen, er PSF af billeddannende system tages i betragtning med henblik på at deconvolve billedet og udbyttet øget opløsning og kontrast af signalet (sammenlignet i figur 2C-J, figur 5 og Movie 3).
1. Vælg tid (er), der skal udfoldede, højreklik og tryk på 'billede Fusion / Dekonvolution «.
2. Vælg 'Multiview Dekonvolution "og brug" pre-definerede afgrænsningsrammen og tilføje til det aktuelle XML-projektet «. Vælg afgrænsningsrammen og fortsætte.
  BEMÆRK: De foruddefinerede parametre for udfoldning er et godt udgangspunkt. For den første retssag brug '20 iterationer "og vurdere konsekvenserne af udfoldning ved at bruge" Debug mode '. Endelig indstiller compute på i 512 x 512 x 512 blokke.
3. I det næste vindue, skal du bruge de foruddefinerede indstillinger. Indstil "debug mode 'for at vise resultaterne hver» 5 iterationer '.
  BEMÆRK: Udgangen af udfoldningen er 32-bit data, men BigDataViewer øjeblikket kun understøtter 16-bit data. For at tilføje output fra udfoldning til den eksisterende hdf5 datasæt, skal det konverteres til 16-bit.
4. Til omdannelsen, køre 'Brug min / max på det første billede (muligvis mætte intensiteter over tid) «.
  BEMÆRK: udfoldning vil så starte med at indlæse billederne og forberede dem til udfoldning.
BigDataServer
1. For at dele de meget store XML / HDF5 datasæt bruge http server BigDataServer ^33. En introduktion til hvordan setup og oprette forbindelse til en sådan server kan findes på http://fiji.sc/BigDataServer.
2. Sådan tilsluttes til en eksisterende BigDataServer åben Fiji> Plugins> BigDataViewer> BrowseBigDataServer.
3. Indtast URL'en herunder havnen i vinduet.
  BEMÆRK: De er beskrevet i denne publikation film er tilgængelige via denne annoncekjole: http://opticcup.mpi-cbg.de:8085
4. Overhold et vindue, der tillader at vælge de tilgængelige film. Dobbelt klik for at åbne vinduet BigDataViewer og se data, som tidligere beskrevet.

Supplerende: Tjekliste for Materiale Needed før du starter

zebrafisk embryoner / larver udtrykker fluorescerende proteiner (Hold embryonerne i zebrafisk E3 medium uden methylenblåt. For etaper ældre end 24 timers modvirke pigmentering ved at tilføje PTU til en endelig koncentration på 0,2 mM.)
fluorescerende stereoskop
kapillærer (20 pi volumen, med et sort mærke) og passende stempler (Genbrug ikke kapillærerne. Stemplerne, på den anden side, kan genbruges i flere eksperimenter.)
1,5 ml plast rør
skarpe pincet
glas (brand poleret) eller plast pipetter (plast kan anvendes i 24 timer og ældre embryoner)
glas eller plastskåle diameter 60 mm (plastik kan værebruges i 24 timer og ældre embryoner)
to 100 ml bægre
50 ml Luer-Lock sprøjte med 150 cm forlængerslange til infusion (Slangen og sprøjten skal holdes helt tørt i mellem eksperimenter for at undgå forurening med mikroorganismer.)
modellervoks
lavt smeltepunkt (LMP) agarose
E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM _CaCl2, 0,33 mM _MgSO4)
MS-222 (tricaine)
phenylthiourea (PTU)
fluorescerende mikrokugler (her benævnt perler)
dobbelt destilleret _H2O (Hedeselskabet ₂ O)

Representative Results

LSFM er en ideel metode til billeddannelse udviklingsprocesser på tværs skalaer. Flere ansøgninger opgøres her viser både kort og lang sigt billeddannelse af intracellulære strukturer, såvel som celler og hele væv. Disse eksempler viser også, at LSFM er et nyttigt værktøj på forskellige stadier i øjet udvikling fra optisk kop dannelse til neurogenese i nethinden. Movie 1 tjener som en illustration af den generelle LSFM tilgang, først viser et zoomet billede af en intakt foster i indlejring agarose cylinder i lysfelt og senere viser et detaljeret billede af nethinden i fluorescenskanalen.

Movie 1
Film 1:. LSFM af zebrafisk nethinden at illustrere LSFM tilgang, denne film viser først i lysfelt, at fosteret afbildes intakt inde i engarose cylinder før du skifter til fluorescens. Senere er det vist, at den store synsfelt muliggør observation af hele nethinden. Dernæst filmen viser en forstørret lille område af nethinden til at fremhæve den gode subcellulære opløsning. En Ath5: gap-GFP ³⁷ transgene zebrafisk embryo blev anvendt til billeddannelse. Dette transgen etiketter forskellige neuroner i nethinden (hovedsagelig ganglieceller og fotoreceptorer prækursorer). Den fluorescens del af filmen blev fanget som en enkelt visning optagelse med dobbelt sidet belysning ved hjælp af 40X / 1.0 W målsætning med 5 min intervaller. Den maksimale projektion af en 30 um tyk lydstyrke vises. Klik her for at downloade denne fil.

Movie 2 viser, hvor meget hurtige intracellulære begivenheder kan fanges med høj opløsning; i dette tilfælde væksten af mikrotubuli vedderes plus ender i de retinale neuronale progenitorceller. Oplysningerne i filmen giver mulighed for sporing og kvantificering af mikrotubuli plus ende vækst.

Movie 2
Movie 2:. Mikrotubulusdynamik i en enkelt celle Denne film fanger voksende plus tips af mikrotubuli mærket af plus tip markør protein EB3-GFP ^38. Proteinet udtrykkes i en enkelt retinal progenitorcelle. Mikrotubuli vokser overvejende i retningen fra apikale til basal (top til bund). Den gennemsnitlige hastighed af EB3 kometer blev målt som 0,28 ± 0,05 pm / sek. Den lyse plet på den apikale side af cellen udviser høje mikrotubuli nukleationsteori aktivitet er centrosom. Vildtype embryo blev injiceret med hsp70: EB3-GFP plasmid-DNA. Filmen blev erhvervet 4 timer efter varmechok (15 min ved 37 ° C) på omkring 28 hrpost gødning, plantebeskyttelse ogtion (HPF) som en enkelt visning optagelse med enkeltsidet belysning ved hjælp af de 63X / 1.0 W mål og 1 sek tidsintervaller. Enkelt celle blev beskåret fra et synsfelt, der dækker størstedelen af nethinden. Den maksimale projektion af to skiver er vist. Klik her for at downloade denne fil.

Figur 3 viser, hvordan intracellulære strukturer kan følges over mange timer. Her er centrosom inden translokere retinale ganglieceller (RGC'er) fanget.

Figur 3
Figur 3:. Centrosom lokalisering under retinal ganglion celle translokation Denne montage af en tidsforskudt eksperiment viser positionen af centrosom hele retina ganglieceller (RGC) modning.I de neuronale progenitorceller den centrosom er lokaliseret i selve spidsen af den apikale fremgangsmåde (01:00). Under celledelingen, de to centrosomer tjene som pæle til mitosespindelen (02:25). Denne opdeling resulterer i en datter celle, der differentierer til en RGC og en anden datter celle, der bliver en fotoreceptor celle forløber. Efter deling, cellelegemet af RGC translokerer til det basale side af nethinden, mens den apikale proces forbliver fæstnet på den apikale side. Når RGC når den basale side, dens apikale proces løsner og centrosom rejser med det (06:15). Den centrosom kan følges, mens gradvist trækkes tilbage sammen med den apikale proces (06:50, 07:20, 08:10). I den sidste ramme (08:55) ganglion celle vokser en axon fra dens basale side, mens centrosom stadig er lokaliseret apikalt. Den mosaik ekspression blev opnået ved plasmid-DNA injektion i vildtype embryo på en celle stadium. Cellerne visualiseres ved den Ath5: GFP-CAAX (grøn) construct, hvilke etiketter RGC'er og andre neuroner. De centrosomer (pilespidser) mærkes af Centrin-tdTomato ²⁹ ekspression (magenta). Den apikale side af nethinden er øverst af billedet og den basale side ved bunden. Den maksimale projektion af en 30 um tyk lydstyrke vises. Billederne blev beskåret fra en film, der dækker hele nethinden. Filmen starter ved omkring 34 timer efter befrugtning (HPF). En z stak blev erhvervet hver 5 min med 40X / 1.0 W mål. Tiden er vist i tt: mm. Scale søjle repræsenterer 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

I figur 4 vises det, hvordan enkelt celle adfærd kan ekstraheres fra datafangst hele væv, såsom i Movie 1. Translokation af en RGC let kan spores, og dens apikale og basale proceses følges.

Figur 4
Figur 4:. Translokation af en enkelt retinal ganglion celle The RGC translokation fra apikal til basal side af nethinden finder sted efter det terminale mitose som beskrevet i figur 3 RGC er mærket ved ekspression af det Ath5:. Hul-GFP ³⁷ transgen. Den maksimale projektion af en 30 um tyk lydstyrke vises. Billederne blev beskåret fra en film, der dækker hele nethinden. Filmen starter ved omkring 34 HPF. En z stak blev erhvervet hver 5 min med 40X / 1.0 W mål. Tiden er vist i tt: mm. Scale søjle repræsenterer 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 viser evnen hos multiview LSFM at fange væv scale morfogenetiske processer med cellulær beslutning om eksemplet med optisk kop morfogenese, hvor optisk vesikel forvandler en optisk kop. Billedkvaliteten kan blive drastisk forbedret med MultiView billedbehandling, når det endelige billede er kombineret fra oplysninger ud af 5 forskellige synspunkter (i dette tilfælde) i en z stak med isotrop opløsning. Denne figur illustrerer den forbedrede billedkvalitet efter vejet gennemsnitlig fusion og yderligere gevinst i billedet kontrast og opløsning efter multiview udfoldning. Figuren viser to optiske skiver i forskellige orienteringer gennem datasættet. Derudover en montage fra udfoldede datasæt viser den optiske kop morfogenese over tid. Alle tidspunkter derefter vist i Movie 3.

Figur 5
Figur 5: Sammenligning af billedkvalitet mellem enkelt visning og to metoder til multiview fusion. (A) En optisk skive enkelt visning viste data fra lateral visning og (B) dorsale udsigt. Stripe artefakter og nedbrydning af signalet dybere inde i prøven er tydelige. Også en del af billedet synlig i de fusionerede data (CF) blev ikke fanget i dette synspunkt. (C) Den samme optiske skive, nu som Multiview smeltet data vist fra lateral visning og (D) dorsale udsigt. Bemærk at stribe artefakter undertrykkes og strukturer dybt i prøven er bedre løst. (E) Det samme optiske skive nu som multiview udfoldede viste data fra lateral visning og (F) dorsale udsigt. Bemærk den øgede kontrast og opløsning, så de enkelte cellemembraner og kerner kan være godt fornemme. Resolutionen ikke forringes især dybere inde i prøven. Datasættet blev erhvervet med dobbelt sidet belysning fra 5 visninger cirka 20 grader fra hinanden. Z stakke af abud 100 um med 1,5 um trin størrelse blev erhvervet ved hver visning i 10 min intervaller i 10 timer med 20X / 1.0 W mål. Input billeder til multiview fusion og udfoldning blev ned udtaget 2 × at fremskynde behandlingen billedet. 15 iterationer af multiview deconvolution blev kørt. (G) Montagen viser en beskåret område af dorsale udsigt fra udfoldede data til at fremhæve de morfogenetiske begivenheder i den tidlige øje udvikling fra optikken vesikel til den optiske kop scenen. De to lag af den optiske vesikel, som oprindeligt lignende søjleformet epitel, differentierer til distinkte cellepopulationer. Den distale lag tæt på epidermis bliver retinal neuroepithelium (RN) og den proksimale lag tæt neuralrøret bliver det retinale pigment epitel (RP). Cellerne i RN langstrakte og invaginate til dannelse af den optiske kop (1:40 til 5:00); samtidig RP celler fladere. Overfladen ektoderm induceres til dannelse af en linse (01:40), whICH invaginates senere (5:00). Filmen starter ved 17 HPF. Tiden er vist i tt: mm. Alle de cellulære membraner er mærket af β-actin: ras-GFP transgen og alle kernerne er mærket af hsp70: H2B-RFP transgen. Scale bar repræsenterer 30 um. FB forhjerne, LE linse, OP olfaktoriske placode, RN retinal neuroepithelium, RP retinal pigment epitel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 3
Movie 3: Optic kop morfogenese vist med enkelt visning og to metoder til multiview fusion Den time-lapse film illustrerer hele processen med optisk kop morfogenese fra optikken vesikel til den optiske kop scenen.. Det viser en enkelt optisk skive fra sidebillede (øverst) og en enkelt optisk skive fra den dorsale visning (nederst). Cellerne i den udviklende optiske vesikel undergår komplekse omlejringer for endelig at danne den halvkugleformede optiske kop med den indre nethinde neuroepithelium og ydre retinal pigment epitel. En linse er dannet fra overfladen ektoderm. Det invaginates sammen med neuroepithelium og sidder i den optiske kop. Alle cellulære membraner er mærket ved ekspression af β-actin: ras-GFP (grønt) transgenet og kernerne er mærket med hsp70: H2B-RFP (magenta). Filmen starter ved omkring 17 HPF. Datasættet blev erhvervet med dobbelt sidet belysning fra 5 visninger cirka 20 grader fra hinanden og az stakke af omkring 100 um blev erhvervet hver 10 min med 20X / 1.0 W mål. Tiden er vist i tt: mm. Scale søjle repræsenterer 50 um. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

1. Kritiske trin og fejlmelding af datafangst

De typiske imaging indstillinger for et GFP og RFP udtrykkende prøve kan ses i tabel 3. I den beskrevne mikroskop setup lyspladen er statisk, dannet af en cylindrisk linse. De to belysning formål er luft linser og afsløring målet er en vand-dypning linse. Ind 1,0 med 20X / 1.0 eller 40X / 1.0 mål giver 230 nm og 115 nm pixelstørrelse og et synsfelt på 441 x 441 um eller 221 x 221 um henholdsvis. Det anbefales at bruge standard lys pladetykkelse med center til grænsen forholdet 1: 2. For 20X / 1.0 svarer denne tykkelse til 4,5 um og for 40X / 1.0 til 3.2 um i midten. Hvis billeddannelseshastighed ikke er den primære prioritet, anvende separate spor i tilfælde af en flerfarvet prøve at undgå krydstale af fluorescensemission mellem kanalerne. Den højeste hastighed for erhvervelsen er begrænset til 50 msek pr z trin afbevægelseshastighed z-driver. Hvis målet er at opnå den maksimale imaging hast i tilfælde af fx to spor med dobbelt sidet belysning, eksponeringstiden skal indstilles således, at summen af alle de billeder taget pr z skridt er under 50 ms. På den anden side, hvis erhverves kun en enkelt billede pr z trin, er det ikke fordelagtigt at indstille eksponeringstiden kortere end 50 msek.

1920 x 1920 billedstørrelse

16-bit

Pivot scan på

Dobbelt sidet belysning med online fusion

10X / 0,2 belysning målsætning

20X / 1.0 W Plan-Apochromat målsætning afsløring

Spor 1: Excitation 488 nm typisk 2% af 100 mW laser, 550 nm SP emissionsfilter

Spor 2: Excitation 561 nm typisk 3% på 75 mW laser, 585 nm LP emission filter

Eksponering tid op til 100 ms

Z stak tykkelse 50-100 um

1-1,5 um z skridt størrelse i kontinuerlig z-drev tilstand

Inkubation ved 28,5 ° C

Tabel 3: Billedbehandling Indstillinger.

Eftersyn af prøven efter forsøget

Det er vigtigt at sikre, at prøven er stadig sundt ved slutningen af eksperimentet. Som et første udlæsning, kontrollere hjerteslag af prøven under en Stereoskopet. Med et par skarpe pincet prøven kan tages ud af agarose og flyttede til inkubatoren til at udvikle yderligere for at kontrollere, om det var påvirket af billeddannelse. Alternativt kan det fastsættes for antistof-farvning.

Montering og drift

Det er vigtigt at holde osmolariteten af kammeret solution tæt osmolariteten af indlejringen agarose, ellers hævelse / krympning af agarose og efterfølgende ustabilitet af prøven vil forekomme. Brug derfor den samme løsning (E3 medium uden methylenblåt) for at fylde kammeret og forberede en% agarose med lavt smeltepunkt portioner. Derudover ikke forlader agarose i 70 ° C varme blok i mere end 2 timer, da det kan miste sine geleringsegenskaber.

Må ikke indlejre fisken i for varmt agarose, da dette kan føre til varme chok reaktion eller død af embryoet. Hvis du er usikker om effekten af varme agarose på embryoner, kontrollere, at halen ikke bøje og at pulsen ikke bremse. Hvis dette sker, skal du bruge en anden foster til eksperimentet.

Hold samlede længde af agarose kolonne med prøven kort (ca. 2 cm) og monter zebrafisk med hovedet orienteret mod stemplet spids. Ligeledes agarose cylinder ekstruderes fra capillAry bør holdes så kort som muligt. Disse foranstaltninger skal sikre stabiliteten af prøven gennem hele filmen. Samtidig skal agarose kolonnen være lang nok til, at glasset kapillær selv ikke når ind i strålegangen, da dette ville medføre store brydning og refleksion.

Den indledende drift af prøven skyldes ændringerne i selve agarose cylinder volumen. Glidning af stemplet er ikke årsagen til den. Derfor hjælper det ikke at fastsætte stemplet med modellervoks eller neglelak. Embryonet kan ændre sin position under filmen på grund af sin naturlige vækst også. Det er derfor tilrådeligt at centrere området af interesse i midten af synsfeltet og holde nogle plads ved kanterne til at rumme disse bevægelser.

Reduceret mængde indlejring medium i lysvejen

Orientering prøven korrekt bidrager til at opnå den bedst mulige billedkvalitet ^15. Generally, bør excitation og emission lys rejser gennem så lidt væv og montering medier som muligt. Den optimale løsning er agarose-fri montering. Dette blev opnået for eksempel i en opsætning af Arabidopsis lateral root billeddannelse ^14, hvori hovedroden var monteret i phytagel og de laterale rødder blev efterfølgende lade vokse ud af gelen kolonnen fuldstændigt. Agarose-fri montering blev også udviklet til afbildning af det komplette embryogenese af Tribolium beetle over to dage ^12. Billedkvalitet forbedring var ikke en primær motivation i denne sag. Tribolium embryoner simpelthen ikke overleve inde i agarose længe nok. En absolut indlejring medie-fri montering ikke er opnået for langsigtet billeddannelse i zebrafisk. Alligevel kan vi drage fordel af det faktum, at når agarose størkner, er de fleste embryoer anbragt diagonalt i kapillaret med det ene øje ligger dybt i agarose og andet øje bliver tæt på overfladen af indlejring kolonnen. Than øje tættere på overfladen giver overlegen billedkvalitet og bør derfor afbildes fortrinsvis.

Agarose koncentration og langsigtet imaging

Koncentrationen af agarose til montering er et kompromis mellem stabilitet af prøven og den mulighed for at rumme væksten af embryonet og diffusion af oxygen til det. Der er ingen ekstra gevinst i stabiliteten af prøven ved brug af agarose koncentrationer højere end 1%. Som udgangspunkt for optimering forsøgene anbefaler vi 0,6% agarose, som også er egnet for embryoner yngre end 24 HPF, der er for fine til at blive monteret i 1% agarose. For at bedøve ældre embryoner og larver, kan MS-222-koncentration hæves til 200 pg / ml uden bivirkninger ^13.

I tilfælde udvikle embryoner afbildet i mere end ± 12 timer, agarose montering ikke anbefales, da det begrænser væksten af fosteret og causes hale deformation. Dette problem blev løst for zebrafisk ved at montere embryoner i FEP polymer rør med brydningsindeks lig vands ^13,39. Musefostre, på den anden side, kan immobiliseres i hule agarose cylindre ⁴⁰ eller i huller af en akryl stang fastgjort til en sprøjte ^41. FEP rør montering ikke anbefales som standard metode selv, fordi væggen af røret bryder lyset lidt mere end agarose.

Lys ark alignment

For god billedkvalitet er det vigtigt at udføre den automatiske lys ark opretning før hvert forsøg. Især hvis zoom-indstillinger blev ændret, blev de mål taget ud, eller en anden væske blev anvendt i kammeret.

Belysning

Den drejelige scanning af lyset arket skal altid være aktiveret. For store spredning prøver, er det nødvendigt at anvende den dobbelte dobbeltsidet belysning med online fusion at opnå ensartet belysning tværs af synsfeltet. Dobbelt sidet belysning mindsker også et specifikt problem i øjet billedbehandling, som er brydning af det indkommende lys ark ved linsen af embryoet. Mindre, mindre spredning prøver effektivt kan filmede med enkeltsidet belysning, hvilket forkorter imaging tid til det halve, og kan resultere i lidt bedre billedkvalitet i forhold til dobbelt sidet belysning. Dette skyldes de lette veje for de to belysning arme er altid forskellige og mere effektiv one kan vælges. Derudover to lette plader fra hver side er aldrig perfekt i et plan, der forårsager mild sløring efter fusionen. For meget hurtige intracellulære begivenheder, ligesom de voksende mikrotubuli (Film 2), den dobbelte dobbeltsidet belysning er ikke hensigtsmæssigt, da billederne med belysning fra venstre og højre er erhvervet sekventielt, hvilket kan resultere i motion blur.

fotoblegningog fototoksicitet

Mindre fluorofor fotoblegning nævnes ofte som en stor fordel ved LSFM. Vi vil hævde, at målet bør være nogen fotoblegning overhovedet. Hvis der er mærkbar fotoblegning i live-imaging eksperiment, prøven er sikkert allerede ud af dets fysiologiske område af tolereret laser eksponering. Når billeddannelse de zebrafisk embryoner i spinding skive mikroskop, vores erfaring, kan høj fototoksicitet stall embryo udvikling endnu før de fluorescerende signal blegemidler markant. Derfor bør indstillingerne for imaging i LSFM indstilles således, at der observeres lille eller ingen fotoblegning. Selvom LSFM er blid til prøven, er det klogt at bruge kun så meget lasereffekt og eksponeringstid efter behov for at opnå et signal til støj-forhold tilstrækkeligt til den efterfølgende analyse af data.

Z-stack, tidsintervaller og data størrelse

De filer genereret af LSFM er normalt meget store; undertiden i terabyte rækkevidde. Det er ofte nødvendigt at foretage et kompromis mellem billedkvalitet og data størrelse. Dette er især tilfældet for z afstand af stakke og intervaller i købene time-lapse. At definere z intervaller, bør ideelt set anvendes Optimal knap i fanen Z-stack værktøj, især hvis datasættet vil blive udfoldede senere. Den beregner afstanden for at opnå 50% overlap mellem nabolande optiske skiver. Stadig, noget større z intervaller er sædvanligvis acceptable. De reducerer den nødvendige tid til at erhverve z stakken samt den endelige filstørrelse. Den optimale tid prøveudtagning afhænger processen af interesse. For den samlede øje udvikling 5-10 min intervaller er normalt acceptable. Hvis nogle strukturer skal automatisk spores, skal de efterfølgende tidspunkter være tilstrækkelig stor.

fluorescerende kugler

Fluorescerende perler tjener primært som referencemærker markører til registrering forskellige visningeraf en multiview datasæt på hinanden. vortexes altid perle løsninger grundigt før brug. Opvarm ikke perlerne, da dette kan føre til tab af det fluorescerende farvestof. Den optimale perle koncentration for multiview registrering skal bestemmes eksperimentelt. Den beskrevne plugin virker bedst med omkring 1000 fundne perler hele hver visning. Større (500 nm eller 1000 nm) perler detekteres mere robust end mindre (mindre end 500 nm) perler. Dette skyldes større perler er lysere og er lettere at segment uden falske positive påvisninger af strukturer i prøven. Ulempen ved de større perler er, at de er meget fremtrædende i den endelige smeltet og udfoldede billede. For hver ny fluorescerende markør, en passende perlestørrelse og fluorescensemission skal optimeres. For at give et eksempel på prøve fra figur 5 og Movie 3, 100 nm grøn emission perler gav alt for mange falske positive opdagelser i membranen-GFP kanal, men 1000 nm rød emission perler blev robust detekteret i H2B-RFP kanal med meget få positive detektioner inde i prøven. Hvis perlen registreringen mislykkes i kanalen med den fluorescerende markør, kan en separat kanal kun indeholder perler erhverves, men dette er ikke særlig praktisk. De sub-opløsning mellemstore perler giver en direkte udlæsning af punktspredningsfunktionen (PSF) af mikroskopet, der kan bruges til udfoldning (Figur 2C-D). Hvis registreringen og fusion fungerer bedre med større perler (f.eks 1000 nm), kan et separat billede af PSF erhverves med sub-opløsning, fx 100 nm perler. Brug flerfarvet perler er nyttige under registrering af multikanal erhvervelse og for at kontrollere, at kanalerne overlay perfekt.

Tilsætning af fluorescerende perler er ikke nødvendigt, når billeddannelse fra en enkelt visning uden efterfølgende MultiView registrering og fusion. Men selv i de tilfælde perler kan være nyttig under initial lyset ark justering for at kontrollere for kvaliteten af lyset ark og generelt at afsløre optiske aberrationer. Sådanne optiske aberrationer kan stamme fra forskellige kilder som beskadigede eller snavsede mål, beskidte vinduer i kammeret eller inhomogenitet i agarose. Perler kan også anvendes til drift korrektion med multiview registrering Fiji plugin ^20.

Multiview

For multiview genopbygning formål, er det bedre at erhverve et ulige antal visninger 3, 5 og så videre, der ikke modsatrettede hinanden. Dette forbedrer udfoldning da vævede afbildes fra forskellige retninger. Det er også vigtigt at bekræfte ved begyndelsen af tidsforløbet erhvervelse, at der er tilstrækkelig overlapning mellem de synspunkter. Dette gøres bedst empirisk, dvs. umiddelbart bekræfter, at synspunkter i det første tidspunkt held kan registreres. Når målet for erhvervelsen multiview er at øge opløsningenaf et billede på en stor scattering prøve, er det ikke tilrådeligt at billedet hele prøven i hver visning, men at stoppe omkring midten af prøven, hvor signalet forringes. Købet lav kvalitet fra anden halvdel af prøven vil ikke tilføje nyttige oplysninger til genopbygningen multiview.

2. Kritiske trin og fejlmelding af databehandlingen

I øjeblikket findes der flere muligheder for behandling i Multiview data fra en lys plade mikroskop, der er veldokumenterede og relativt let at træffe. Vi bruger multiview genopbygning ansøgning, som er et open source-software implementeret i Fiji ³² (Stephan Preibisch upubliceret, Link 1a og Link1b i Listen over Materials). Dette plugin er en stor redesign af den tidligere SPIM registrering plugin ^20, revideretaf Schmied et al. ^42, integrere BigDataViewer og XML og HDF5 format ³³ med SPIM registrering arbejdsgang (figur 1B, Link 2 , Link 3 ). Dette program kan også tilpasses til high performance computing klynge, som i væsentlig grad fremskynder behandlingen ^43. Denne applikation multiview registrering aktivt videreudvikles og holder bedre. I tilfælde af problemer eller funktioner anmodninger om den beskrevne software, skal du indsende spørgsmål på de respektive GitHub sider ( Link 4 for Multiview Genopbygning og Link 5 for BigDataViewer).

Den anden mulighed er at bruge den kommercielle software til rådighed sammen med mikroskopet. Denne løsning fungerer godt og beskæftiger det samme princip om anvendelse af fluorescerende perler til at registrere de forskellige synspunkter. Men mangler, det mulighed for at visualisere hele datasæt hurtigt ligesom med BigDataViewer. Også softwaren ikke kan tilpasses til klyngen og endvidere de behandlinger blokerer mikroskop for andre brugere, medmindre ekstra licens til softwaren er købt.

Den tredje mulighed, som også er en open source-software, blev for nylig offentliggjort af Keller lab ⁴⁴ og giver en omfattende ramme for behandling og nedstrøms analyse af lyset datablad. Denne software anvender information fra i prøven til at udføre multiview fusion, derfor ikke kræver tilstedeværelse af fluorescerende perler rundt prøven. Men på samme tid, det forudsætter ortogonal orientering af de billeddannende visninger (mål), så det kan ikke bruges til data indhentet fra vilkårlige vinkler ^44.

krav Hardware

ntent "> Den hardware, der anvendes til forarbejdning kan findes i tabel 4. Der skal være tilstrækkelig lagerkapacitet og en klar rørledning til databehandling rådighed, før det faktiske eksperiment. Erhvervelse af billederne er hurtigere end efterfølgende analyse og det er let at få oversvømmet med uforarbejdede data. Det er ofte urealistisk at gemme alle de rå billeder, men snarere en beskåret udgave eller forarbejdede billeder som fusionerede visninger, maksimale projektioner intensitet eller kugleformede fremspring ^45.

Processor	To Intel Xeon Processor E5-2630 (Six Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / sek)
Hukommelse	128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM
Harddisk	4 × 4 TB 3.5inch Serial ATA (7.200 rpm) Hard Drive
HDD Controller	PERC H310 SATA / SAS Concontroller til Dell Precision
HDD-konfiguration	C1 SATA 3.5 tommer, 1-4 harddiske
Grafik	Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 kort m / 2 DP og 1 DVI-I hver) (2 DP-DVI & 2 DVI-VGA adapter) (MRGA17H)
Netværk	Intel X520-T2 Dual Port 10 GbE Network Interface Card

Tabel 4: Hardwarekrav.

Databehandling hastighed

Den nødvendige til databehandling afhænger dimensionerne af og om den anvendte hardware. I tabel 1, giver vi et overblik over den tid, der kræves til de vigtigste skridt i behandlingen af et eksempel 8,6 GB multiview datasæt, der bestod af en tidspunkt med 4 visninger og 2 kanaler.

Behandling sTEP	Tid	protokol trin
Gem som HDF5	6 min 30 sek	6.3
Detect Renter Points	20 sek	6.4
Registrer bruger interesse punkter	3 sek	6.5
Content-baserede MultiView fusion	4 timer	7.2
Multiview udfoldning (CPU)	8 timer	7.3
Multiview udfoldning (GPU)	2 timer	7.3

Tabel 1: Data Processing Time.

Input dataformater til MultiView genopbygning

Den Fiji Plugin Multiview Genopbygning kan støtte .czi, .tif og ome.tiff formater. På grund af datastrukturen af .czi format, diskontinuerlige datasæt er ikkeunderstøttet uden forbehandling. Usammenhængende betyder, at optagelsen skulle genstartes (f.eks at justere positionerne på grund glide af prøven). I dette tilfælde skal gemmes igen som .tif de .czi filer. For .tif filer hver visning og belysning retning skal gemmes som en separat fil.

Kalibrering af pixelstørrelse

Mikroskopet-drift software beregner kalibreringen for xy pixelstørrelse baseret på det valgte mål. Imidlertid er pixelstørrelsen i z defineres selvstændigt i trinstørrelsen. Hvis en forkert mål er angivet i softwaren xy til z-forholdet er forkert, og registreringen vil mislykkes.

Første registrering

Efter at have defineret datasættet antallet af registreringer vil være 1, og antallet af relevante punkter vil være 0 i ViewSetup Explorer. Den første registrering repræsenterer kalibrering af datasættet. Både antallet of registreringer og interesse punkter vil stige under behandlingen.

Ned prøvetagning til påvisning af interesse punkter

Brug ned prøvetagning anbefales, da læsning af filerne og segmenteringen vil være meget hurtigere. Det er dog vigtigt at bemærke, at detektionsparametre vil ændre sig afhængigt af ned prøvetagning, således at overføre indstillinger afsløring mellem forskellige ned prøve indstillinger er ikke mulig.

Påvisning af interesse punkter

Det er tilrådeligt at segmentere så mange sande perler som muligt i hver visning, selv på prisen for at opnå nogle falske positive opdagelser, fordi de ikke hindrer registreringen betydeligt. Falske opdagelser, hvis få i antal, er udelukket under registreringen (se Registrering af interesse punkter). Men udgøre et problem for algoritmen massive falske positive opdagelser. Det reducerer ikke kun ydeevne til påvisning ogregistreringen, da det tager meget længere tid at segmentere billede samt sammenligne disse perler mellem de synspunkter, men det reducerer også nøjagtigheden af registreringen. Dette kan løses ved hjælp af strengere detektionsparametre. Derudover løbet segmentering af perlerne (dvs. flere detektioner på en perle Figur 1E) er til skade for registrering og bør undgås.

Registrering af interesse punkter

For at registrere visninger på hinanden, er placeringen af hver perle i hver visning beskrives af sin position i forhold til sine tre nærmeste nabolande perler. Disse konstellationer danner en lokal geometrisk deskriptor og tillader at sammenligne hver perle mellem visningerne. Perler med matchende deskriptor mellem to visninger derefter betragtes som kandidat korrespondancer. Bemærk at dette virker kun for tilfældigt fordelte perler, for hvilke lokale deskriptorer typisk unik for hver perle.Man kan bruge andre strukturer såsom kerner i prøven til registrering. Men for at opdage kerner, som er fordelt ikke tilfældigt i prøven, andre metoder gælder, ^20,21.

Kandidat- korrespondancer testes derefter mod RANSAC ³⁶ for at udelukke falske positive. Hver korrespondance antyder en transformation model for overlejre udsigt til hinanden. Sande korrespondancer ville sandsynligvis enige om én transformation model, mens outliers ville hvert punkt til et andet. De sande korrespondancer anvendes derefter til at beregne en affin transformation model mellem de to sammenlignede visninger. En global optimering med en iterativ optimering algoritme udføres derefter, hvorunder alle visningerne er registreret på den første visning med henblik på minimal forskydning mellem visningerne ^20,21.

registrering Time-lapse

Grundet flytteling af agarose og upræcise motor bevægelse af objektbordet, positionen af hver stabel varierer moderat over tid. Ud fra følgende betragtninger registreringen af det enkelte tidspunkt fjerner forskellen mellem de synspunkter, dette tidspunkt, den time-lapse skal også være registreret som en helhed. Til dette formål er hvert enkelt tidspunkt registreret på henvisningen tidspunkt.

Henvisning tidspunkt

Hvis en tidsserie med mange tidspunkter er behandlet, er en repræsentativ tidspunkt valgt som reference sædvanligvis fra midten af tidsserier eftersom perle intensiteter kan nedbrydes med tiden på grund af blegning. På denne reference, kan bestemmes parametrene for renter punkt afsløring, registrering, afgrænsningsrammen og fusion. Disse parametre er derefter anvendt på hele tidsforløbet at beregne en specifik transformation model for hver enkelt tidspunkt. Under time-lapse registrering er også REGIST alle andre tidspunkterob- rumligt på denne reference tidspunkt. Således afgrænsningsrammen parametre for hele optagelsen er afhængigt af denne specifikke tidspunkt.

Multichannel registrering

Når billeddannelse flere kanaler, ideelt samme fluorescerende perler skal være synlig i alle afbildede kanaler. Detekteringen og registrering kan derefter udføres på hver kanal individuelt, som tager højde for indflydelsen af de forskellige lysbølgelængder på transformation. Ofte er dette ikke muligt, fordi perlerne er ikke synlige i alle kanaler eller perlerne dominerer billedet for meget i den ene kanal og er for svagt i den anden kanal (er). Den typiske løsning er at bruge perler synlige kun i én kanal til påvisning og registrering og den erhvervede transformation model (dvs. efter afsløring, registrering og time-lapse registrering) anvendes derefter på de andre kanaler, som Fiji> Plugins> Multiview Reconstruction> Batch Processing> Værktøj> Identiske Transformations. I drop down menuen for Påfør transformation af vælge en kanal til andre kanaler. I det følgende vindue vælge XML og klik OK. Vælg derefter den kanal, der indeholder perlerne som Kilde kanal og som Target kanal vælge den kanal (er) uden perler. For Duplicate som transformationer bruger Udskift alle transformationer og tryk på OK. De transformationer derefter kopieres til alle andre kanaler og gemmes i XML. For at se de nye forandringer i ViewSetup Explorer, skal du genstarte MultiView Genopbygning Application.

afgrænsningsramme

Sammensmeltningen af flere visninger er beregningsmæssigt meget intensiv. Imidlertid er store billeder typisk erhvervet til at rumme ikke kun prøvematerialet, men også perlerne omkring det. Når parameter registreringens ekstraheres fra perlerne, de ikke længere anvendelige som en del af billedet. Derfor, for at øge effektiviteten af fusionen, kun de dele af billedet stakke indeholdende prøven smeltes sammen. En region af interesse (afgrænser boks) bør defineres til at indeholde prøven og så lidt af det omgivende agarose som muligt. For eksempel i figur 2 et vægtet gennemsnit fusion på hele volumen med 2229 × 2136 × 2106 px ville kræve 38,196 MB RAM, mens volumen med en afgrænsningsramme er reduceret til 1634 × 1746 × 1632 px og krav til hukommelse reduceres til 17.729 MB.

Content-baserede MultiView fusion

Udfordringen i at fusionere multiview data er, at de synspunkter som regel ender brat og ikke indeholder det samme billede kvalitet for de samme voxels. Enkel gennemsnitsberegning af de synspunkter vil derfor føre til blanding artefakter og unødvendig billede nedbrydning. Content-baserede multiview fu nen tager begge disse problemer i betragtning. For det første blander de forskellige synspunkter, hvor et billede ender og den anden begynder, og det andet, det vurderer den lokale billedkvalitet og anvender højere vægte højere billedkvalitet i fusion ^21. Sammenlignet med en enkelt visning der en forbedring af opløsningen i z med en svag forringelse af signalet i xy (Figur 2E-H, figur 5A-D).

Multiview udfoldning

Multiview udfoldning er en anden tilgang til at opnå fusion af de synspunkter. Med denne metode er taget også vævede de forskellige synspunkter i betragtning med henblik på at genvinde det billede, der er blevet foldet af optikken i mikroskop. Denne metode drastisk forbedrer billedkvaliteten ved at fjerne billedsløring og stigende opløsning og kontrast af signalet ³¹ (Figur 2C-D, figur 2I-J, figur 5E-G, Movie 3).

ve_content "> Dekonvolution er beregningsmæssigt meget intensiv (se tabel 1), og dermed bruge en GPU til forarbejdning øger hastigheden af denne proces. Det kan også være nødvendigt at udføre udfoldning på ned samplede data. Til ned prøve, bruge Fiji> Multiview Genopbygning > Batch Processing> Værktøj> Anvend Transformations. Dette vil anvende en ny transformation model på de synspunkter, der vil blive gemt i .xml-fil.

HDF5 filformat til BigDataViewer og BigDataServer

Den BigDataViewer ³³ giver let visualisering af terabyte-størrelse data. Sådan styrer BigDataViewer er opsummeret i tabel 2. En screencast af den grundlæggende betjening af programmet er også tilgængelig som et supplement i sin oprindelige publikation ^33. Den BigDataViewer er centreret om en .xml-fil, der indeholder metadata, og en hdf5 fil, der indeholder billeddata. De billeddata er present i hdf5 i flere opløsning niveauer i 3D-blokke. De mange opløsning niveauer giver mulighed for at visualisere data hurtigere med lavere opløsning, før den fulde opløsning er indlæst. Individuelle blokke kun indlæses i hukommelsen efter behov. , Hdf5 billede format giver således direkte og hurtig visualisering af data via BigDataViewer ^33. Det også fremskynder behandlingen, da læsningen af filerne udføres mere effektivt. Derfor anbefaler vi resaving datasættet ind i dette format, selv om det ikke er strengt nødvendigt for behandlingen. For yderligere forklaring af dataformatet henvises til Link 3 . Derudover kan de datasæt deles med samarbejdspartnere eller offentligheden ved hjælp af BigDataServer ³³ ( Link 6 ).

effekt

nøgle
F1	viser Hjælp med en kort beskrivelse af BigDataViewer og dens grundlæggende betjening
<> Eller musehjulet	bevægelse i z
op og pil ned	zoome ind og ud
højreklik og træk	bevæger prøve i fremviseren
venstre klik og træk	roterer prøve omkring markøren
skyderen i bunden af beskueren eller Tab og venstre eller højre pil	bevæger sig på tidsaksen
derudover trykke shift	hurtigere bevægelse eller rotation langs enhver akse
x og derefter venstre og højre pil	roterer omkring x-aksen
y og derefter til venstre og højre pil	roterer omkring y-aksen
z og derefter til venstre og højre pil	roterer omkring z-aksen
skift og x	orienterer langs x-aksen
skift og y	orienterer langs y-aksen
skift og z	orienterer langs z-aksen
jeg	skifter mellem de forskellige interpolation tilstande (dvs. nærmeste nabo og trilineære)
s eller Indstillinger> Lysstyrke og kontrast	ændrer farven af kanaler, lysstyrke og kontrast
F6 eller Indstillinger> Synlighed og gruppering	ændrer de viste grupper, gør det muligt for gruppering til overlejring forskellige grupper og kalder grupperne via taltasterne
F10 eller Værktøjer> Record Movie	erhverver en tidsserie af den aktuelt viste skive

Tabel 2: Big data Viewer.

3. Begrænsninger af den beskrevne implementering af LSFM

lav gennemløb

I et typisk LSFM eksperiment kun én prøve pr eksperiment afbildes. Stadig, i vores erfaring, en masse nyttige oplysninger kan uddrages af den enkelt prøve. Høj overførselshastighed billeddannelse af flere fostre er for nylig blevet opnået i hjemmet bygget LSFM opsætninger ^46-48, selvom typisk på bekostning af frihed prøve positionering og rotation.

Utilstrækkelig penetration dybt ind i væv

Selvom zebrafisk embryoner er gennemsigtige, er det opnåede billedkvalitet forværres hurtigt, når afbildning dybere i vævet på grund af spredning og absorption. Delvist dette er en effekt af spredning og absorption af den udsendte fluorescens af prøven og kan ikke korrigeres i den aktuelle opsætning. En anden kilde til den ujævne billedkvaliteten er den uregelmæssige belysning. Than lys ark er indfaldende fra venstre eller højre side og eventuelle genstande i sin vej bryder det, hvilket resulterer i stribe artefakter og sløring. Den dobbelte sidet belysning og multiview fusion kan mindske artefakter i det endelige billede. Endelig billedkvaliteten tendens til at være lidt dårligere mod randen af synsfeltet som følge af den naturlige geometri lyspladen, som bliver tykkere mod kanterne.

Begrænset kemisk manipulation

Brugen af narkotika eller inhibitorer er udbredt i zebrafisk forskning. I denne mikroskop brug af stoffer er begrænset på grund af den store volumen af prøvekammeret og overvejelser af andre brugere af instrumentet, der deler den samme kammer. Brug af en ekstra kammer dedikeret til narkotika eksperimenter kan løse dette problem. Fyldning af kammeret delvist med glasperler reducerer det væskevolumen, der kræves.

ingen billedmanipulation

Currently er der ingen mulighed for lokaliseret optisk manipulation ligesom fotokonvertering eller laserablation i dette mikroskop. Ikke desto mindre kan hjemme bygget opsætninger anvendes til sådanne specifikke applikationer.

4. Betydning og fremtidige applikationer

LSFM er den bedste metode til rådighed til dato for hurtig billeddannelse af store mængder af levende embryoer. De fleste af eksperimenterne tænkelige på et konfokalt mikroskop kan også udføres på en lys ark mikroskop med nævnte fordele. I tilfælde af billeddannelse af øjet udvikling, hastigheden af LSFM er ikke den afgørende parameter. I stedet den lave fototoksicitet og fleksibilitet i prøven positionering er de afgørende fordele.

De LSFM data har en høj SNR, som hjælper med at opnå gode udfoldning resultater og er også gavnligt for automatiseret billedanalyse og objekt tracking. Afslutningsvis LSFM er et fantastisk værktøj til at generere kvantificerbare data på fosterudviklingen og Overall celle og væv egenskaber til efterfølgende modellering og fysiske beskrivelser af processerne pågældende.

Disclosures

Offentliggørelse af denne video-artikel er støttet af Zeiss.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 microscope	Carl Zeiss Microscopy
Low melting point agarose	Roth	6351.1
Low melting point agarose	Sigma	A4018 or A9414
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)	Sigma	E10521
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629
500 nm red fluorescent beads F-Y 050	Millipore (Estapor)	80380495
20 μl (1 mm inner diameter, marked black) capilllaries	Brand	701904	sold as spare part for transferpettor
Teflon tip plungers for 20 μl capillaries	Brand	701932	sold as spare part for transferpettor
Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm	Thermo scientific (Menzel-Glaser)
O-rings for chamber windows 17×1.5 mm	Carl Zeiss Microscopy
Tweezers, style 55	Dumont	0209-55-PO
50 ml Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	300865
150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes	Becton Dickinson	397400
Links
Link 1 Multiview reconstruction application			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction
Link 2 BigDataViewer			https://github.com/bigdataviewer
Link 3 BigDataViewer			http://fiji.sc/BigDataViewer
Link 4 Multiview reconstruction application-issues			https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues
Link 5 BigDataViewer-issues			https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues
Link 6 BigDataServer			http://fiji.sc/BigDataServer