The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
सीटू संकरण में पूरे माउंट (WMISH) एक तकनीक है कि ब्याज की (जैसे एक भ्रूण या लार्वा के रूप में) न्यूक्लिक एसिड अणुओं (अक्सर mRNAs) के स्थानिक संकल्प एक 'पूरे माउंट' ऊतक तैयारी के भीतर, या विकास मंच के लिए अनुमति देता है। WMISH अत्यंत शक्तिशाली है क्योंकि यह काफी जटिल metazoan जीनोम के कार्यात्मक विशेषताओं, एक चुनौती है कि अगली पीढ़ी के अनुक्रम डेटा की बाढ़ के साथ एक टोंटी के अधिक होता जा रहा है करने के लिए योगदान कर सकते हैं। तकनीक में ज्यादा समय अक्सर उपन्यास मॉडल प्रणाली के लिए WMISH प्रयोगों के लिए निहित विभिन्न मापदंडों का अनुकूलन करने की जरूरत है की वैचारिक सादगी के बावजूद; प्रकार के ऊतकों और विकास के चरणों के बीच सेलुलर और जैव रासायनिक गुणों में सूक्ष्म अंतर का मतलब यह है कि एक ही WMISH विधि सभी परिस्थितियों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता। हम फिर से उभरते gastropod मॉडल Lymnaea stagnalis कि लगातार पैदा करते हैं और के लिए WMISH तरीकों का एक सेट विकसित किया हैएक सीमा के जीन की है, और सभी विकास के चरणों भर के लिए स्पष्ट WMISH का संकेत है। इन तरीकों में एक व्यष्टिविकास खिड़की के पास अज्ञात कालानुक्रमिक उम्र के लार्वा का काम है, उनके अंडा कैप्सूल से भ्रूण के कुशल हटाने और लार्वा, प्रत्येक व्यष्टिविकास खिड़की के लिए एक उपयुक्त Proteinase कश्मीर उपचार के आवेदन, और संकरण, बाद संकरण और immunodetection शामिल कदम। इन तरीकों में एक नींव है जिस से एक दिया शाही सेना प्रतिलेख के लिए परिणामस्वरूप संकेत जांच विशिष्ट समायोजन (मुख्य रूप से एकाग्रता और संकरण तापमान जांच) के साथ आगे परिष्कृत हो सकता है प्रदान करते हैं।
मोलस्क जानवरों है कि वैज्ञानिक विषयों की एक व्यापक विविधता के हित पकड़ के एक समूह रहे हैं। उनकी रूपात्मक विविधता 1 के बावजूद, प्रजातियों (दूसरा केवल Arthropods प्रजातियों नंबर 2 के संदर्भ में) और प्रासंगिकता वाणिज्यिक 3, 4 और चिकित्सा वैज्ञानिक मुद्दों 5-8 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए समृद्धि, वहाँ अपेक्षाकृत कुछ मोलस्का की प्रजाति है कि करने के लिए दावा कर सकते हैं दोनों वैज्ञानिक मॉडलों और एक प्रयोगशाला वातावरण में बनाए रखने के लिए आसान अच्छी तरह से सुसज्जित हो। एक सीप है कि ज्यादा इस तरह के तंत्रिका जीव विज्ञान 9, ईकोटोकसीकोलौजी 10 और अधिक हाल ही में विकासवादी जीव विज्ञान 11,12 के रूप में विषयों से इस्तेमाल किया है, मुख्य रूप से अपने बड़े पैमाने पर वितरण और रखरखाव के चरम आसानी के कारण, Lymnaea stagnalis है। एक 'मॉडल' जीव के रूप में इसकी लोकप्रियता और विकासात्मक जीव 13-19, रेंज और आणविक उपकरणों की शक्ति एल के लिए उपलब्ध द्वारा प्रयोग के अपने लंबे इतिहास के बावजूद stagnAlis वैज्ञानिक समुदाय में कहीं अधिक परंपरागत पशु मॉडल (ड्रोसोफिला, माउस, समुद्री साही, नेमाटोड) के पीछे निहित है।
हमारी इच्छा Lymnaea विकसित करने के लिए एक आणविक मॉडल है कि खोल गठन मार्गदर्शन आणविक तंत्र में रुचि की वजह से उपजी है। यह तकनीक है कि Lymnaea के विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति की, कुशल संगत और संवेदनशील दृश्य के लिए अनुमति होगी के एक सेट को परिष्कृत करने के लिए हमें प्रेरित किया। सीटू संकरण में पूरे माउंट (WMISH) व्यापक रूप से मॉडल जीवों की एक किस्म के लिए कार्यरत है और 40 से अधिक वर्षों 20 के लिए उपयोग में किया गया है। अपनी अलग guises में, ईश स्थानिक गुणसूत्रों, rRNA, mRNA और माइक्रो आरएनए पर विशेष लोकी स्थानीयकरण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
चुनौतियों में से एक हम एल के लिए एक WMISH विधि को परिष्कृत करने से पहले संबोधित करने की जरूरत stagnalis धीरे से और कुशलता से निकालने भ्रूण और टी से अलग-अलग चरणों के लार्वा का मुद्दा थावह अंडा कैप्सूल जिसमें वे जमा कर रहे हैं। यह निकासी, या 'decapsulation', आदेश के लिए पर्याप्त सामग्री इकट्ठा करने में कुशलता हासिल करने की जरूरत है एक, सीटू प्रयोग में दी गई है, जबकि एक ही समय में रूपात्मक और सेलुलर अखंडता को बनाए रखने। जबकि अन्य मॉडल जीवों को भी समझाया विकास से गुजरना है, हमारे हाथ में तरीकों उन प्रजातियों के लिए सूचना का कोई भी सफलतापूर्वक एल में नियोजित किया जा सकता stagnalis।
इस विधि के समग्र लक्ष्यों इसलिए कर रहे हैं: एल निकालने के लिए stagnalis भ्रूण और एक उच्च throughput फैशन में अपने कैप्सूल, लार्वा से पूर्व संकरण उपचार है कि WMISH संकेत अनुकूलन, इमेजिंग के लिए संतोषजनक WMISHsignals के साथ भ्रूण और लार्वा तैयार करने के लिए लागू करने के लिए।
विधि यहाँ वर्णित Lymnaea stagnalis के सभी विकास के चरणों के भीतर अभिव्यक्ति के स्तर शायद बदलती के साथ शाही सेना टेप के कुशल दृश्य के लिए अनुमति देता है। उनकी कैप्सूल से भ्रूण और लार्वा को दूर करने के लिए हम ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम DFG परियोजना # JA2108 / 2-1 के माध्यम से DJJ को धन के द्वारा समर्थित किया गया।
Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |