Abstract
In situ hibridizasyon bütün montaj (WMISH) ilgili (örneğin, bir embriyo veya larva gibi) bir "bütün montaj 'doku terkibi olan bir nükleik asit molekülü (genellikle mRNA'lar) uzamsal çözünürlük veya gelişimsel aşamada sağlayan bir tekniktir. önemli ölçüde karmaşık metazoan genomları fonksiyonel karakterizasyonu, yeni nesil dizi verilerinin tufan ile bir darboğaz haline gelmektedir bir meydan okuma katkıda bulunabilir çünkü WMISH son derece güçlüdür. çok zaman genellikle yeni model sistemler için WMISH deneylere doğasında çeşitli parametrelerini optimize için gereken tekniğin kavramsal basitliğine rağmen; doku tipleri ve gelişim aşamaları arasındaki hücresel ve biyokimyasal ince farklar tek WMISH yöntemi tüm durumlar için uygun olmayabilir anlamına gelir. Biz tutarlı üretmek ve yeniden ortaya çıkan gastropod modeli Lymnaea stagnalis için WMISH yöntemler kümesi geliştirdikgenlerin ve tüm gelişim aşamaları arasında bir aralık için açık WMISH işaretleri. Bu yöntemler, bir ontogenetik pencereye bilinmeyen kronolojik yaş larva atama, onların yumurta kapsüllerden verimli embriyoların kaldırılmasını ve larvaları, her ontogenetik pencere için uygun bir proteinaz-K tedavisinin uygulanmasını ve hibridizasyon sonrası hibridizasyon ve İmmuno dahil adımlar. Bu yöntemler, belirli bir RNA transkripti için ortaya çıkan sinyal prob özel ayarlamalar (öncelikle konsantrasyon ve melezleme sıcaklığı prob) ile daha da rafine olabilen bir zemin oluşturmaktadır.
Introduction
Yumuşakçalar bilimsel disiplinlerin geniş bir çeşitlilik ilgi tutmak hayvanların bir grup vardır. Morfolojik çeşitlilik 1 rağmen, tür, 3 ticari tıbbi 4 ve bilimsel konularda 5-8 geniş bir yelpazede ve alaka (tür sayısı 2 bakımından sadece Arthropodlara ikinci) zenginliği, iddia edebilir görece az sayıda yumuşakça türü vardır iyi donanımlı bilimsel model ve laboratuar ortamında bakımı kolay hem olacak. Çok böyle nörobiyoloji 9, ekotoksikoloji 10 ve daha yakın evrimsel biyoloji 11,12 olarak disiplinler tarafından kullanılan bir yumuşakça, öncelikle çünkü yaygın dağıtım ve bakım aşırı kolaylığı, Lymnaea stagnalis olduğunu. Bir 'model' organizma olarak popülerlik ve L. mevcut gelişimsel biyologlar 13-19, moleküler araçlar aralığı ve güç kullanımı onun uzun geçmişine rağmen stagnalis bilimsel topluluk çok daha geleneksel hayvan modellerinde (Drosophila, fare, deniz kestanesi, nematodlar) o arkasında yatıyor.
Bir moleküler modeli kabuk oluşumunu rehberlik moleküler mekanizmalar bir ilgi kaynaklanıyor gibi bizim arzu Lymnaea geliştirmektir. Bu Lymnaea 'ın gelişimi sırasında gen ifadesinin, verimli, tutarlı ve duyarlı görselleştirme için izin verecek teknikleri bir dizi rafine bizi motive etti. In situ hibridizasyon bütün montaj (WMISH) yaygın model organizmaların çeşitli kullanılır ve 40 yılı aşkın 20 kullanımda olmuştur. Farklı guises, ISH mekansal kromozomlar, rRNA, mRNA ve mikro-RNA'lar belirli loci lokalize etmek için kullanılabilir.
Zorluklardan biri, önceki L. için WMISH yöntemi rafine hitap için gerekli stagnalis nazikçe ve etkin ayıklanması embriyo ve t değişen aşamaları larvalarının sorun olduO depolandıkları yumurta kapsüller. Bu özütleme, ya da 'kapsülden çıkarma', yeterli malzeme toplamak için etkili bir şekilde elde edilmesi gerekmektedir, aynı zamanda, morfolojik ve hücresel bütünlüğü muhafaza edilirken, in situ deneyde verilen. Diğer model organizmalar da kapsüllü gelişime tabi iken, elimizde bu türler için bildirilen yöntemlerden hiçbiri başarılı L. istihdam edilebilir stagnalis.
Bu yöntemin genel amaçları bu nedenle: L. ayıklamak için stagnalis yüksek verimli bir şekilde kendi kapsüller, embriyolar ve larvalar görüntüleme için tatmin edici bir WMISHsignals embriyo ve larvaları hazırlamak için, WMISH sinyali iyileştirir ön hibridizasyon tedaviler uygulamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıdaki adımlar L. embriyonik ve larva aşamaları situ deneyde bir iletken için bir yöntem özetlemektedir Bir adım, bu kelime 'DİKKAT' ve tüm uygun güvenlik prosedürleri ile gösterilir tehlikeli kimyasal kullanımını içerir stagnalis. benimsenmelidir. Tehlikeli kimyasallar için temsili MSDS yaprak Linkler Ek Dosya 1'de verilmiştir. Tüm reaktifler için Tarifler Ek Dosya 2'de verilmektedir.
Kapsülden çıkarma Aparatı 1. Meclis
- Bunu yapmak için, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, bir uygun uzunlukta bir P1,000 ucu kesilmiş kullanılarak (1 mm'lik bir iç çap ve 3 mm arasında bir dış çapa sahip) silikon boru, bir 20 ml'lik atılabilir bir şırınga bağlayın.
- ters bir büyük Petri kabı standart bir mikroskop lamı bantlayın. Şekilde gösterildiği gibi bir mikroskop lamı hemen bitişik silikon boru bantlayın60, 2C ve 2D.
- Mikroskop lamı üzerine çekilmiş bir cam iğne istirahat ve hafifçe iğnenin ucu boru iç çapı boyunca bir şekilde yaklaşık% 20 çıkana kadar silikon tüp içine yerleştirin (Şekil 2C ve 2D bakınız). İğne Petri kabı pozisyon bant aşağı getirildikten sonra.
- silikon boru serbest ucu Decapsulated malzeme toplayacak bir Petri kabındaki dinlenmeye bırakın.
2. Örnek Toplama, Fiksasyon ve kapsülden çıkarma
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilmektedir.
- Dikkatle bir akvaryum duvarlarında yumurta dizeleri toplamak. Bunu yapmak için, substrat kapalı yumurta dize kazımak için bir spatula olarak esnek plastik düz bir parça kullanımı ve suyun dışında yüzen yumurta dize balık plastik çay süzgeci kullanın. Sahne ve Şekil sağlanan kılavuzunu kullanarak bir mikroskop altında malzeme sıralamak1.
- Bir kağıt havlu üzerine yumurta dize yerleştirin ve tüy forseps kullanarak yumurta kütlesi boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak. Yumurta dize dışında yumurta kapsüllerini rulo ve tüy forseps kullanarak kağıt havlu etrafında onları iterek, her kapsül mümkün olduğunca jöle malzeme kadar kaldırın.
- tüy forseps kullanarak, musluk suyu 5 ml içeren bir Petri kabı içine yumurta kapsülleri aktarın. Bu yemeğin içine istenen gelişim evreleri de-jöleli yumurta kapsülleri toplamaya devam. Planlanan WMISH Deney daha sonra bir sonraki adıma geçin için tüm gelişim aşamalarında yeterince kapsüller toplayın.
- daha gelişmiş larva çalışırken tespitin önce onları uyuşturan (5 gün ilk bölünme (dpfc) ve eski sonrası).
NOT: Bu çok zor in situ boyanma yorumunu yapan taahhüt kasları önleyecektir.- kendi capsu ise hala (larva Sakinönceden tespit için 30 dakika • 6H 2 O MgCl2% 2 w / v solüsyonda Les).
- fiksatif çözüm kendi yumurta kapsüller içinde hala birkaç larva süre daldırarak ve mikroskop altında tepki izleyerek 30 dakika sonra gevşeme derecesini değerlendirmek. tamamen rahat larvaları yanıt vermez ise eksik rahat larvaları, kendi kabukları içine çekilecektir. Bu larvalar rahat edildikten sonra bir sonraki adıma geçin.
- Yumurta kapsül hacminin 10 katı sağlayan bir kapatılabilir bir tüp içine geniş delikli pipet ile yumurta kapsüller aktarın (örn., Yerleşmiş kapsüller 1 ml 10 + ml tüp gerektirir).
- Aspire kadar borunun mümkün sıvı ve yerleşmiş yumurta kapsül hacmi 10 kat olan sabitleyici çözeltisinin bir hacmi ile değiştirin. Yavaşça her gelişim aşamasında (Şekil 1 e bakınız) için uygun bir süre için oda sıcaklığında sabitleyici yumurta kapsüller döndürün.
- Discontinue rotasyon ve kapsüller lavabo ve uygun bir atık kabına fiksatif solüsyonu aspire izin verin.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Tween-20 (PBTw) Fosfat Tamponlu Tuz çözeltisi sabitleyici değiştirilmesi ve döndürerek yumurta kapsüller yıkayın. PBTw aspire ve iki kez tekrarlayın.
- Embriyoların ve aparatları kullanarak kapsüllerden larvaları çıkarın tüp aracılığıyla ve cam iğne dışarı içine geçmiş kapsül tüp takmak ve daha sonra gidermek. Şekil 2'de gösterilmiştir (ayrıntılar için bakınız bölüm 1) 20 ml şırınga içine kapsül çizin toplama çanak.
NOT: Normalde, her kapsül çoğunluğu (>% 90) cihaz üzerinden tek bir geçiş gerekir gerekir. Birçok durumda kapsül zarı hasar, ancak embriyo ve larva rüptüre kapsülün içinde kalır. sadece şırınga içine hazırlanması ve tekrar dispelling bu malzemeyi yeniden işleyin. - bir mikrofon kullanarak bir 1.5 ml tüp içine decapsulated embriyolar ve larvaları toplayınropipette (0 için P20 - 3 gün eski larva, ve bahşiş sonunda yaşlı larva P200 kesti).
NOT: Bu aşamada yapılabilir protokolde (birkaç ay kadar için) bir duraklama. Eğer bu gerekli ise, decapsuled malzemenin depolanması için 1.5 ml'lik bir tüp (bir sonraki adıma) içine alınmalıdır. Aksi takdirde Protokolün 3 hemen devam ediyor. - Embriyolar ve larvalar tüpün dibine çöker ve süpernatant aspire izin verin. PBTw% 33 Etanol (EtOH) ile değiştirin ve 5 bekletin - 10 dk. PBTw% 66 EtOH ve% 100 EtOH ile tekrar edin. Oda sıcaklığında% 100 EtOH içinde iki kez larvaları yıkayın. % 100 EtOH içinde -20 ° C'de malzemenin saklayın.
- 10 dakika - hazır devam zaman, yeniden hidrat% 100 EtOH kaldırılması ve PBTw% 66 EtOH ile değiştirerek numuneler, 5 bekletin. 10 dakika - 5 bekletin, PBTw% 33 EtOH ile tekrarlayın. Son olarak, tüm EtOH kaldırılır sağlamak için PBTw 3x 5 dk yıkama ile yıkayın.
3. Proteinaz-K, TEA ve Post-fifiksasyon
NOT: Biz hızlı bir şekilde zaman kritik çözümler alışverişi için bir örgü zemin ile en verimli ve nazik bir yöntem küçük sepetlerde aşağıdaki adımları uygulayarak bulabilirsiniz. Bu ev yapılabilir, biz INTAVIS InSituPro -Vsi sıvı taşıma robotu (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc) ile uyumlu sepetleri (orta boy) kullanın. Bu sepet, hızlı ve kolay değişimi çözeltiler için bir 12 yuvalı doku kültürü çanağı (TCD) oyuklarına arasında hareket edebilir, veya çözelti de bir pipet kullanılarak aspire edilebilir. Alternatif olarak, tüm çözüm borsaları sadece larva süpernatant aspire bu sepet olmadan yapılabilir. Bu durumda, hafif bir girdap hareketi yüzer de kenarından kaldırılacak sağlayan çanağın merkezine tüm embriyolar ve larvaları yoğunlaşacaktır. Aşağıdaki kullanıcı çözüm alışverişi için sepetleri istihdam olduğunu varsayar.
- bir pipet kullanılarak, PBTw 2 ml ile 12 kuyu TCD oturan bir sepet içine embriyo transferi ve larva.
NOT:. Eklenen gelişim aşamasına bağlıdır olabilir embriyoları ve / veya larva sayısı ancak başparmak genel bir kural embriyolar / larvaların (yani serbest taban alanı en az 25% muhafaza etmektir, araştırılmaktadır, yok ) sepeti fazla kalabalık. - Uygun proteinaz-K çözeltisi (Şekil 1 e bakınız), 2 ml, 2 mi% 0.2 glisin her biri başka bir 2 kuyucuklu de bitişik hazırlayın. Proteinaz-K iyi içeren uygun konsantrasyonda her bir sepet taşımak ve hemen zamanlama başlar.
- 10 dakika sonra iyi olarak ihtiva eden% 0.2 Glisin her bir sepet taşımak ve 5 dakika için inkübe edilir. Daha sonra% 0.2 glisin ile ikinci oyuk her bir sepet taşımak ve 5 dakika için inkübe edilir. 3 ml PBTw 3x 5 dk alışverişi ile Glisin yıkayın.
- PBTw çözüm çıkarın ve taze hazırlanmış Triethanolamine (TEA) sol ile bir kez numune tedavi5 dk DİKKAT Katkı! tahrik etmeyin. 5 dakika için taze hazırlanmış çay çözeltisine 3 ml değiştirin. karıştırılmaz. numune çay çözeltisine çoğunluğu aspire. Asetik Anhidrit (TEAAA) çözümü ile taze hazırlanmış trietanolamin ekleyin ve 5 dakika. DİKKAT boyunca inkübe! Tahrik etmeyin.
- İSTEĞE BAĞLI - Yukarıdaki adım kuluçka iken, TEAAA çözümün başka taze bir parti hazırlamak ve yukarıdaki adımı tekrarlayın.
Not: TEAAA bu ikinci tedavi isteğe bağlıdır ancak tamamen arka üretilmesi eğilimli problar tüm arka plan ortadan kaldırmak için yararlı olabilir. - kuyudan o aspire TEAAA çözeltisi çıkarın ve PBTw 3 ml ile değiştirin. karıştırılmaz. PBTw çıkarın ve PBTw içinde% 3.7 formaldehit 3 ml uygulanır. Yavaşça 30 dakika inkübasyon sırasında zaman zaman girdap.
- kuyudan o aspire Fiksatif çıkarın ve PBTw 3 ml ile değiştirin. 1.5 ml tüp içine malzemeyi aktarın. Rhibridizasyon tampon maddesi ile PBTw eplace ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe - dikkatli olun.
- Oda sıcaklığında sıcak bir blok içine tüpler yerleştirin ve istenen hibridizasyon sıcaklığı sıcaklığını ayarlamak.
NOT: melezleme sıcaklığı belirli prob ve ampirik optimize edilmesi gerekecektir, ancak biz 55 ° C iyi bir sıcaklık başlangıçta deneme için buluyorum. Blok melezleme sıcaklığına gelmesi ve numuneler yaklaşık 15 dakika boyunca önceden melezleşme izin izin (yani, daha uzun, riboprobes hazırlamak için gereken süre gerekli değildir). Yeterli hacimleri seyreltilmiş riboprobes (normalde 100 ul) hazırlayın. Biz ilk aralık olarak 100 ve 500 ng / ml arasında, genellikle test prob konsantrasyonu. Biz 12'ye göre riboprobes hazırlar. - örneklerden hibritleme tamponu çıkarın ve örnekleri hibridizasyon tamponu içinde probu ekleyin. 100 ul (ya da yeterli miktarda Overlay melezleştirme Buffe üzerinde bir faz oluşturmak içinr) Mineral yağ elde edilmiştir.
NOT: Mineral yağ uzun hibridizasyon adımı sırasında oluşturacak kapsamlı yoğunlaşmayı önler. Kapsamlı yoğunlaşma önemli ölçüde hibridizasyon çözüm kimyasını ve prob konsantrasyonu hem de değiştirecektir. - prob ve 10 dakika boyunca 75 ° C'ye kadar numunelerin ısıtılmasıyla hedef RNA'yı denatüre, daha sonra arzu edilen melezleştirme sıcaklığına ısısını düşürür. (- 48 saat 24) melezleştirme 12 saat (O / N) ya da daha fazla en az devam etmesine izin verir.
- melezleme sırasında, ısı bloğu tek bir tüp kaldırmak yağ fazının bozmadan larvaları askıya başparmak ve işaret parmağı arasında hızla döndürün ve ısı bloğu değiştirin. 12 saat ya da öylesine - bu kez her 6 tekrarlayın.
4. Sıcak Yıkayıcı ve İmmuno
Not: aşağıdaki adımlar için bir sıvı kotarma robotu kullanımı da, bu da kolayca manuel olarak yapılabilir. Bu durumda, embriyolar ve larvalar ShoULD. onlar hibritlenmiştir 1.5 ml tüpler içinde tutulması Bütün takip eden çözelti, Değişimleri aspire edildi ve bir P1,000 pipet ile eklenir. elle yapıldığında aşağıdaki adımlardan her biri, her çözeltinin 1 ml istihdam etmelidir.
- Isı ile yeterli miktarda 4x, 2x (3 mi, her numune için her biri) ve hibridizasyon sıcaklığı 1x yıkama çözeltileri.
- melezleştirme sıcaklığında 15 dakika her biri için tüm örnekler 4x yıkama tamponunda üç kez yıkayın. melezleştirme sıcaklığında 15 dakika her biri için tüm örnekler 2x yıkama tamponu içinde üç kez yıkayın. melezleştirme sıcaklığında 15 dakika her biri için tüm örnekler 1x yıkama tamponu içinde üç kez yıkayın.
- melezleştirme sıcaklığında 1x Sodyum Klorür sodyum sitrat tamponu +% 0.1 Tween (SSC +% 0.1 Tween) ile bir kez tüm örnekler yıkayın. Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- W MAB tekrar Maleik asit tampon maddesinde (mAb) ile 1 x SSC çözeltisi yerine 15 dakika boyunca 1 x SSC +% 0.1 Tween iki kez tüm örnekler yıkayın ve 10 dakika bekletinkül. Blok çözeltisi ile MAB takın ve 1.5 saat süre ile inkübe edilir.
- (1: blok çözeltisi içinde antikorun 10,000 seyreltme) antikor çözeltisi blok çözeltisi değiştirin ve yumuşak çalkalama ile oda sıcaklığında 12 saat (O / N) inkübe edilir.
5. Renk Gelişimi ve Montaj
- Antikor çözeltisi aspire edilir ve 10 dakika için her PBTw 15 kez yıkayın. 1x Alkalen Fosfataz Tampon (AP) ile PBTw değiştirin ve 10 dakika inkübe edilir.
- DİKKAT - Yukarıdaki inkübasyon adım ilerler, AP boyama çözüm hazırlarken (Ek Dosya 2'ye bakınız). iyi bir TCD içine malzemeyi aktarın ve AP boyama solüsyonu ile 1x AP çözüm değiştirin. süre renk reaksiyonu kaydedilebilir için yer alır, böylece artık zaman not edin. Arka plan oranı sinyal optimum kadar boyanma paterni gelişimini izlemek.
- renk gelişimini durdurmak için, uygun idin içinde elden (1x AP boyama çözüm kaldırmake konteyner) ve PBTw 2 ml uygulamak ve şimdi zamanı not edin. 5 dakika her biri için iki kez daha PBTw ile durulayın. 1.5 ml tüp içine malzemeyi aktarmak için, bu durulama birini kullanabilirsiniz.
- (Bu, O / N yapılabilir) PBTw çıkarın ve PBTw% 3.7 formaldehit 1 ml uygulamak ve ajitasyon ya da oda sıcaklığında en az 30 dakika döndürün.
- PBT 3 yıkama (uygun bir atık konteynerine atık fiksatif elden) ile fiksatif yıkayın. deiyonize su içinde, 50 ° C 'de numuneler 3 kez yıkayın.
NOT: Bu yıkar takas ve görselleştirme adımları sırasında görünür hale gelebilir tuzlarının çökelmesini ortadan kaldırır. - Benzil Alkol (BB: Ayrıca Murray Clear olarak bilinen BA) veya gliserol örnekleri benzil benzoat monte edilmelidir karar verir.
NOT: Daha güçlü temizleme maddesi BB tercih: BA L. olarak stagnalis embriyolar biraz opak. Numuneler BB monte edilmek üzere: BA ilk bir etanol serisi ile susuz gerekecektir. Numuneler,% 60 monte edilecek olangliserol hemen monte edilebilir. - Bir pipet kullanarak: (BA veya% 60 gliserol BB) montaj çözelti içine örnekleri aktarın.
BB monte ederken: NOT BA bu iyi bir bardak yapılmalıdır (BB: BA polikarbonat plastik eriyecek). - 10 dakika ve daha sonra ayırıcılar olarak yığılmış lamelleri uygun sayıda (örneklerin <1 dpfc, numuneler için 2 lamelleri> 1 dpfc için 1 lamel) kullanarak bir slayt üzerine takar - numuneler için 5 temizlemek için izin verin.
NOT: Tüm bağlar artık DIC optik ile bileşik mikroskobu kullanılarak görüntülü olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3'te gösterildiği gibi Örnek WMISH boyanma, yukarıda tarif edilen teknik kullanılarak üretilebilir, ve kabuk oluşumu arasında değişen moleküler bir dizi işlem katılan genlerin mekansal ekspresyonu, çeşitli yansıtırlar (yeni bir gen, 1, 2, 3 ve 4), gelişim aşamaları bir dizi genelinde transkripsiyon regülasyonu (Brachyury) hücre-hücre sinyal (DPP) için. Biz onlar da olur bekliyoruz bu genlerin ifade seviyelerini sayısal değil iken bizim yöntem çeşitli düzeylerde tüm gelişim evrelerinde ifade gen ürünlerinin geniş bir çeşitlilik karşı uygulanabilir olduğunu belirten önemli ölçüde değişir. Burada sadece sunulan genin (DPP) biri daha önce L'de tarif edilmiştir stagnalis 21,22. Burada mevcut sonuçları büyük ölçüde bu daha önceki raporlarda ile tutmak, ancak önemli ölçüde daha yüksek uzaysal Reso ile dökülmesinden. Brachyury uzaysal ekspresyon paterni tadıdır 23 tarif edilmiştir ve 24 limpet ve L. bulmak gibi her iki durumda da manto hücrelerinde tespit ettik; stagnalis (Şekil 3F). Şirketinden kabuk oluşumunda rol oynayan gen ürünlerini tespit için tasarlanmış proteomik ekrandan 4 (ve böylece kabuk bezinin (Şekil 3A ve B) veya kabuk alan (Şekil 3C ve D ile ilişkili uzamsal ekspresyon modelleri) - biz yeni genlerin 1 izole kabuk oluşturan fonksiyonları ile tamamen uyumlu. Bu sonuçlar, biz yumurta kapsül embriyolar ve larvaları kaldırılması için geliştirdiğimiz yüksek kapasiteli tekniği ve sonraki aşama özgü permeabilization tedavileri, in situ boyama kaliteli verecektir bütün montaj örnekleri oluşturmak olduğunu göstermektedir embriyonik ve larva gelişim tüm aşamaları için genlerin çeşitli desenleri.
ove_content "fo: keep-together.within sayfa =" 1 ">
Şekil 1. Özet Lymnaea stagnalis ve Bireyoluş ve Sorumlu Fiksasyon ve proteinaz-K Tedaviler. Gelişiminin ilk 7 gün embriyo ve larva Temsilcisi görüntüleri bir boyuta (satır 1) belirgin bir artış ve morfolojik karmaşıklığını göstermek (satırlar 2 ve 3) . Bu gelişimsel değişiklikler büyük uygun sabitleme zaman farklılıkları ve optimal WMISH sinyalleri üretmek Proteinaz-K konsantrasyonları çevirmek. WMISH tüm aşamaları kendi yumurta kapsül içinde yavaşça sallanarak oda sıcaklığında PBS içinde% 3.7 formaldehit sabit olmalıdır. Tüm aşamalar daha sonra 10 dakika boyunca uygun bir proteinaz-K konsantrasyon ile tedavi edilmelidir. bizim ilgili kaynaklı proteinaz-K aktivitesinde belirgin arası parti değişimi dikkate unutmayın. Bu varyasyon performi tarafından hesaba katılmalıdırng, yeni proteinaz-K aktivitesi ampirik bir biçimde tespit 'kalibre' WMISH deneylerin yuvarlak olduğu. Şekilde belirtilen Proteinaz-K konsantrasyonları bu nedenle bir başlangıç rehber, gelişim evreleri arasında ancak göreli konsantrasyonları olarak tedavi edilmelidir. Ayarlanır (örneğin 2 gün eski embriyolar günden daha yüksek 3 kez 1 embriyo proteinaz-K konsantrasyon gerektiren) Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Decapsule L. için kullanılır Şekil 2. Aparatı stagnalis embriyolar. (A) verimli L. kaldırabilirsiniz aparatın bir bakış kendi kapsüllerden stagnalis embriyolar ve larvalar. (B) büyütülmüş görünümsarı kutulu alan (A). Keskin bir cam iğne ucu boru boşluk içine bir şekilde yaklaşık% 20 çıkıntı (iç çap 1 mm, dış çapı 3 mm), öyle ki, silikon tüp içine mikroskop lamı üzerine yerleştirildi ve sokulur. Cam iğne sonra da mikroskop lamı ve Petri kabı bantlanmış. (C) sabit embriyolar ve larvaları içeren A. Yumurta kapsül sarı kutulu bölümünün şematik 'planın' görünümü ilk 20 ml şırınga kullanılarak toplanır. şırınga silikon boruya bağlı olan ve kapsüller boru boyunca ve iğnenin son atılır. Yumurta kapsül membranlar iğne ile parçalanmış ve serbest embriyonik ve larva malzeme bir mikropipet kullanarak toplama çanak alınabilir. (D) A. sarı kutulu bölümünün şematik 'kesit' görünümü mikroskop lamı sağlar iğne doğru yükseklikte silikon tüp girer.
L. bir Aralığı itibaren Genlerin bir Variety karşı WMISH İfade Desenler Şekil 3. Temsilcisi Görüntüler BA (Murray temizle). yukarıdaki metodda anlatılana, BB monte edilmiştir ve görüntülü edilmiş olarak, burada açıklanan yöntem ile üretilen stagnalis Gelişim aşamaları bütün gelişim safhaları işlenmiştir. Yaklaşık yaş için belirtilmiştirHer bir panel ve yönlendirme p, sağ alt gösterilir. Gen orthology (bilinen zaman) her panelin sol alt gösterilir. Kısaltmalar: Kabuk bezi (SG); Kabuk alan (sf); manto (mt); ayak (ft); Decapentaplegic (DPP); dpfc (gün ilk bölünme sonrası). Tüm ölçek çubukları 20 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen yöntem, Lymnaea stagnalis tüm gelişim aşamalarında olan muhtemelen farklı sentezleme seviyelerine sahip RNA transkriptlerinin etkin olarak gösterebilir. Onların kapsüller embriyolar ve larvaları çıkarmak için diğer encapsulated- için bildirilen kimyasal, ozmotik şok ve fiziksel tedaviler çeşitli trialed model organizmalar geliştirmek. Ancak, bizim elimizde biz burada açıklamak yöntemi embriyolar ve larvaları zarar vermeden sert kapsül zarı kaldırır sadece yüksek verimli bir tekniktir. kapsülden çıkarma sonrasında, malzeme ya da saklanabilir veya proteinaz-K bir aşamada belirli bir rejim ile muamele edildi ve daha sonra riboprob hibridize. (Tipik prob konsantrasyonu ve hibridizasyon sıcaklığı odaklı) İlave ampirik optimizasyon çalışmaları her sonda / hedef için gerekli olabilir. (Sabitleme rejimi ve proteinaz-K tedavilere ek olarak) Bu parametreler tipik olarak en etkili parametrelerdirYerinde deneyde herhangi bir (sabit malzemenin kalitesi ve RNA probu yüksek standartta olduğunu varsayarak).
In situ deneyde bir nihai sonuç için uygun bir proteinaz-K tedavisinin önemi L. çok önemlidir stagnalis. Bu (0 ug / ml ila 500 ug / mL arasında değişen) farklı gelişimsel aşamalarında gerektirdiği proteinaz-K konsantrasyonları geniş yansıtılır. Bir ontogenetik pencereye belirli bir yumurta dize atamak edebilmek için önemlidir. Bu amaçla, biz Şekil 1'de sağlayan kılavuz bilinmeyen yaş gelişimsel malzemenin evreleme için izin verir (bu rakam bir baskı dostu sürüm kullanıcıları malzeme evreleme zaman mikroskopta olması yararlı bulabileceği Ek Dosya 3 mevcuttur) . Bu WMISH için gastropodlar proteinaz-K tedavilerin diğer türler için ya develo geniş bir aralığı için sabit tutulabilir dikkatpmental 8,25,26 aşamaları veya tamamen 27 ihmal edilebilir. Bu L. durumun tezat olduğunu stagnalis. Ayrıca, diğer araştırma grupları, daha önce L. çeşitli genler için WMISH ekspresyonu rapor varken Biz burada açıklamak stagnalis larvaları (22,28,29 bakınız) yöntemi anlamlı olarak daha yüksek uzaysal çözünürlüğü kalıplarını verir. Son olarak, bizim ilgili kaynaklı proteinaz-K aktivitesinde belirgin arası parti değişimi gözlenmiştir. Bu varyasyon, yeni proteinaz-K aktivitesi ampirik olarak belirlenir 'kalibre' WMISH deneylerin bir yuvarlak yaparak hesaba katılmalıdır. bu partiden proteinaz-K alikotları ile sonraki deneyler sonra serbest gerçekleştirilebilir.
Daha önce L. için alternatif bir yöntem tarif WMISH stagnalis embriyolar ve larvalar başka bir yerde 12. Bu yöntem, mucolyt kullanımını ayrıntılıIC madde N-asetil-L-sistein (NAC), ditiotreitol (DTT) ve sodyum dodesil sülfat ile bir ön hibridizasyon işlemine (SDS) gibi bir indirgeme maddesi. Biz bazı gelişimsel aşamaları için bazı genlerin boyama desenleri geliştirilmiş olan tedaviler bulundu. (Kendi kapsül içinde larvaları tespit) biz son zamanlarda geliştirilen ve burada açıklamak tespit stratejisi kolaylaştırır ve yerinde deneyde bir için malzeme hazırlamak için gereken adımları hızlandırır, ve görünüşe göre ampirik NAC, DTT ile ek optimum ön melezleme tedavileri belirlemek için gereksinimini ortadan kaldırır veya SDS. Burada rapor tekniğe gelecek arıtmalar (daha önce 30 rapor standart WMISH protokollere değişiklikler aşağıdaki) microRNA görselleştirme, mRNA ikili ya da üçlü etiketleme 31 hedef ve WMISH sinyallerinin 32 floresan görselleştirme içerebilir. Tartışmalı tekniğin en büyük kısıtı da collectin gitmek için gereken zaman genel uzunluğug malzeme, belirli bir gen ekspresyon modelini temsil eden bir dijital görüntüye karşılık. Ötürü, bu gibi bir işlemi sırasında yer almalıdır biyokimyasal ve biyofiziksel olayların doğası bu in situ hibridizasyon protokolleri en doğal bir özelliğidir.
Lymnaea son derece model organizmaların açısından eksik temsil olduğu Hayvanların içinde konuma sahiptir. Bir temsilci Spiralian olarak, Lymnaea gibi kabuk oluşumu 12 ve vücut ellilik 33-35 gibi farklı morfolojik özellikler evrim içgörü getirmek ve aynı zamanda değerli bir nöroetoloji 36 ve nörofizyoloji modeli 9,37 olduğunu olabilir. Bu etkin bir in situ gen ekspresyonu görselleştirmek yeteneği gibi güçlü teknikler model organizma olarak Lymnaea işlevselliğini artırır ve gidermek için kullanılabilir sorular çeşitli genişletmektedir. Bir anda zaman büyük dizi dat nesilasets (tam transcriptomes ve hatta genomları) nispeten rutin, bu tür yöntemler, modellerden dizi verilerinin sel yorumlamak isteyen araştırmacılara daha uygun hale gelecektir olduğunu. Lymnaea nispeten türetilmiş gastropod 38 ve diğer model organizmalar (1.22 Gb 39) ile karşılaştırıldığında büyük bir genom düşünülebilir ne sahip iken, çekici bir model sistem yapmak çok pratik ve ilginç özelliklere sahiptir. Biz burada açıklamak yöntemleri Lymnaea mevcut araç kutusu genişletmek ve geliştirme kapsüllü tabi diğer türlere yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma DFG projesi # JA2108 / 2-1 ile DJJ için fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
- World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
- Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
- Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
- Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
- Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
- Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
- Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
- Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
- Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
- Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
- Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
- Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
- Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
- Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
- Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).
- Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
- Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).
- Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
- Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).
- Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
- Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
- Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
- Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).
- Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).
