The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.
In situ hibridizasyon bütün montaj (WMISH) ilgili (örneğin, bir embriyo veya larva gibi) bir "bütün montaj 'doku terkibi olan bir nükleik asit molekülü (genellikle mRNA'lar) uzamsal çözünürlük veya gelişimsel aşamada sağlayan bir tekniktir. önemli ölçüde karmaşık metazoan genomları fonksiyonel karakterizasyonu, yeni nesil dizi verilerinin tufan ile bir darboğaz haline gelmektedir bir meydan okuma katkıda bulunabilir çünkü WMISH son derece güçlüdür. çok zaman genellikle yeni model sistemler için WMISH deneylere doğasında çeşitli parametrelerini optimize için gereken tekniğin kavramsal basitliğine rağmen; doku tipleri ve gelişim aşamaları arasındaki hücresel ve biyokimyasal ince farklar tek WMISH yöntemi tüm durumlar için uygun olmayabilir anlamına gelir. Biz tutarlı üretmek ve yeniden ortaya çıkan gastropod modeli Lymnaea stagnalis için WMISH yöntemler kümesi geliştirdikgenlerin ve tüm gelişim aşamaları arasında bir aralık için açık WMISH işaretleri. Bu yöntemler, bir ontogenetik pencereye bilinmeyen kronolojik yaş larva atama, onların yumurta kapsüllerden verimli embriyoların kaldırılmasını ve larvaları, her ontogenetik pencere için uygun bir proteinaz-K tedavisinin uygulanmasını ve hibridizasyon sonrası hibridizasyon ve İmmuno dahil adımlar. Bu yöntemler, belirli bir RNA transkripti için ortaya çıkan sinyal prob özel ayarlamalar (öncelikle konsantrasyon ve melezleme sıcaklığı prob) ile daha da rafine olabilen bir zemin oluşturmaktadır.
Yumuşakçalar bilimsel disiplinlerin geniş bir çeşitlilik ilgi tutmak hayvanların bir grup vardır. Morfolojik çeşitlilik 1 rağmen, tür, 3 ticari tıbbi 4 ve bilimsel konularda 5-8 geniş bir yelpazede ve alaka (tür sayısı 2 bakımından sadece Arthropodlara ikinci) zenginliği, iddia edebilir görece az sayıda yumuşakça türü vardır iyi donanımlı bilimsel model ve laboratuar ortamında bakımı kolay hem olacak. Çok böyle nörobiyoloji 9, ekotoksikoloji 10 ve daha yakın evrimsel biyoloji 11,12 olarak disiplinler tarafından kullanılan bir yumuşakça, öncelikle çünkü yaygın dağıtım ve bakım aşırı kolaylığı, Lymnaea stagnalis olduğunu. Bir 'model' organizma olarak popülerlik ve L. mevcut gelişimsel biyologlar 13-19, moleküler araçlar aralığı ve güç kullanımı onun uzun geçmişine rağmen stagnalis bilimsel topluluk çok daha geleneksel hayvan modellerinde (Drosophila, fare, deniz kestanesi, nematodlar) o arkasında yatıyor.
Bir moleküler modeli kabuk oluşumunu rehberlik moleküler mekanizmalar bir ilgi kaynaklanıyor gibi bizim arzu Lymnaea geliştirmektir. Bu Lymnaea 'ın gelişimi sırasında gen ifadesinin, verimli, tutarlı ve duyarlı görselleştirme için izin verecek teknikleri bir dizi rafine bizi motive etti. In situ hibridizasyon bütün montaj (WMISH) yaygın model organizmaların çeşitli kullanılır ve 40 yılı aşkın 20 kullanımda olmuştur. Farklı guises, ISH mekansal kromozomlar, rRNA, mRNA ve mikro-RNA'lar belirli loci lokalize etmek için kullanılabilir.
Zorluklardan biri, önceki L. için WMISH yöntemi rafine hitap için gerekli stagnalis nazikçe ve etkin ayıklanması embriyo ve t değişen aşamaları larvalarının sorun olduO depolandıkları yumurta kapsüller. Bu özütleme, ya da 'kapsülden çıkarma', yeterli malzeme toplamak için etkili bir şekilde elde edilmesi gerekmektedir, aynı zamanda, morfolojik ve hücresel bütünlüğü muhafaza edilirken, in situ deneyde verilen. Diğer model organizmalar da kapsüllü gelişime tabi iken, elimizde bu türler için bildirilen yöntemlerden hiçbiri başarılı L. istihdam edilebilir stagnalis.
Bu yöntemin genel amaçları bu nedenle: L. ayıklamak için stagnalis yüksek verimli bir şekilde kendi kapsüller, embriyolar ve larvalar görüntüleme için tatmin edici bir WMISHsignals embriyo ve larvaları hazırlamak için, WMISH sinyali iyileştirir ön hibridizasyon tedaviler uygulamak.
Burada tarif edilen yöntem, Lymnaea stagnalis tüm gelişim aşamalarında olan muhtemelen farklı sentezleme seviyelerine sahip RNA transkriptlerinin etkin olarak gösterebilir. Onların kapsüller embriyolar ve larvaları çıkarmak için diğer encapsulated- için bildirilen kimyasal, ozmotik şok ve fiziksel tedaviler çeşitli trialed model organizmalar geliştirmek. Ancak, bizim elimizde biz burada açıklamak yöntemi embriyolar ve larvaları zarar vermeden sert kapsül zarı kaldırır sadece …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma DFG projesi # JA2108 / 2-1 ile DJJ için fon tarafından desteklenmiştir.
Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION – May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION – CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION – ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION – Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION – Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION – CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION – Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION – Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION – May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION – Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION – May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION – May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION – Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION – May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |