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Biology

Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Regulamento da abundância de proteína é crucial para praticamente todos os processos celulares. abundância proteína reflecte a integração das taxas de síntese de proteínas e a degradação da proteína. Muitos ensaios de relatórios sobre a abundância de proteínas (por exemplo, em tempo único ponto de transferência de Western, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, ou os ensaios reporter baseados em crescimento) não permitem discriminação dos efeitos relativos de tradução e proteólise nos níveis de proteína. Este artigo descreve a utilização de ciclo-heximida perseguição seguido de western blotting para analisar a degradação de proteínas especificamente no eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de germinação). Neste procedimento, as células de levedura são incubadas na presença do inibidor de ciclo-heximida translacional. Alíquotas de células são recolhidas e imediatamente depois em pontos de tempo específicos seguintes adição de ciclo-heximida. As células são lisadas e os lisados ​​são separados por electroforese em gel de poliacrilamida for análise de Western blot de proteínas de abundância em cada ponto de tempo. O procedimento de ciclo-heximida perseguição permite a visualização da cinética de degradação da população do estado estacionário de uma variedade de proteínas celulares. O procedimento pode ser utilizado para investigar os requisitos para genéticos e influências ambientais sobre a degradação da proteína.

Introduction

Proteínas executar funções cruciais em praticamente todos os processos celulares. Muitos processos fisiológicos requerem a presença de uma proteína específica (ou proteínas) por um período de tempo definido, ou sob circunstâncias particulares. Organismos, portanto, monitorar e regular a abundância de proteína para atender às necessidades celulares 1. Por exemplo, as ciclinas (proteínas que controlam a divisão celular) estão presentes em fases específicas do ciclo celular, e a perda dos níveis de ciclina regulamentados tem sido associada com a formação do tumor maligno 2. Além de regular os níveis de proteína para satisfazer as necessidades celulares, células empregam mecanismos de controlo de qualidade degradativas para eliminar deformadas, as moléculas de proteína não montadas, ou de outro modo aberrantes 3. Controle de abundância de proteína envolve regulação tanto a síntese macromolecular (transcrição e tradução) e degradação (decomposição RNA e proteólise). a degradação da proteína deficiente ou excessiva contribui para várias patologias, Incluindo o cancro, fibrose cística, doenças neurodegenerativas, e desordens cardiovasculares 4-8. Mecanismos proteolíticas, portanto, representam alvos terapêuticos promissores para uma série de doenças 9-12.

Análise de proteínas em um único ponto do tempo (por exemplo, por western blot 13, citometria de fluxo 14, ou microscopia de fluorescência 15) fornece um instantâneo da abundância de proteína em estado estacionário, sem revelar as contribuições relativas de síntese ou degradação. Da mesma forma, ensaios repórter baseada em crescimento reflectem os níveis de proteína em estado estacionário durante um período de tempo prolongado sem discriminar entre as influências de síntese e degradação 15-20. É possível inferir a contribuição dos processos de degradação para os níveis de proteína em estado estacionário, comparando abundância antes e depois de inibir componentes específicos do mecanismo de degradação (por exemplo, por farmacologicamente inactiva o proteasome 21 ou batendo para fora um gene a hipótese de ser necessário para a degradação 13). Uma alteração nos níveis de proteína em estado estacionário após a inibição das vias degradativas proporciona forte evidência para a contribuição de proteólise para o controlo da abundância de proteína 13. No entanto, essa análise ainda não fornece informações sobre a cinética de retorno da proteína. Chase Cycloheximide seguida por western blot supera essas deficiências, permitindo que os investigadores para visualizar a degradação da proteína ao longo do tempo 22-24. Além disso, porque a detecção da proteína seguinte perseguição ciclo-heximida é tipicamente realizada por Western blotting, isótopos radioactivos e passos morosos imunoprecipitação não são necessários para a perseguição ciclo-heximida, ao contrário de muitas técnicas de pesquisa por pulso habitualmente utilizados, que são também realizados para visualizar a degradação da proteína de 25.

Ciclo-heximida foi pela primeira vez identificado como um composto com anti-fúngica adequadalaços produzidos por Streptomyces bactéria gram-positiva griseus 26,27. É uma molécula de células-permeável que inibe especificamente citosólica eucariótica (mas não organelar) por tradução ribossomal prejudicando translocação 28-31. Numa experiência cicloheximida Chase, ciclo-heximida é adicionado às células, e as alíquotas de células são recolhidas e imediatamente em pontos de tempo específicos após a adição do composto 22. As células são lisadas, e a abundância de proteína em cada ponto de tempo é analisado, tipicamente por western blot. Diminuições na abundância de proteínas após a adição de ciclo-heximida pode ser com confiança atribuídos a degradação da proteína. Uma proteína instável vai diminuir em abundância ao longo do tempo, enquanto que uma proteína relativamente estável irá apresentar pouca mudança em abundância.

Os mecanismos de degradação de proteínas selectiva têm sido altamente conservadas ao longo da Eukarya. Muito do que se sabe sobre a degradação das proteínas foi aprendido pela primeira vez emo eucariota unicelular modelo, Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) 25,32-36. Estudos com levedura tendem a continuar fornecendo insights novos e importantes para a degradação de proteínas. Um método para a perseguição de ciclo-heximida em células de levedura, seguido de análise Western blot de proteínas de abundância é aqui apresentada.

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Protocol

1. Crescimento e colheita de células de levedura

  1. Se não análise cinética de degradação de uma proteína de levedura endógena, transformar a estirpe (s) desejado levedura com um plasmídeo que codifica para a proteína de interesse. Métodos fiáveis ​​para a transformação de leveduras foram previamente descrito 37.
  2. Inocular levedura em 5 ml de meio apropriado (por exemplo, definida SD) meio selectivo sintético (para manutenção de plasmídeo de células transformadas, ou de meio de levedura não selectivo-extracto de peptona-dextrose (YPD) para células não transformadas). Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação.
    NOTA: 30 ° C é a temperatura de crescimento óptima para típica de tipo selvagem estirpes de levedura de laboratório 38. No entanto, porque algumas estirpes de leveduras mutantes não crescem optimamente a 30 ° C e algumas proteínas sofrem degradação dependente da temperatura, as temperaturas utilizadas para o crescimento de células de levedura e Chase cicloheximida deve ser determinada empiricamente 39.
  3. Meça the a densidade óptica a 600 nm (OD600) de cada cultura durante a noite.
    NOTA: As células podem estar em fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deve ter minimamente atingiu uma densidade que vai permitir que a diluição para um OD 600 = 0,2 em 15 ml de meio fresco.
  4. Dilui-se as culturas durante a noite para um valor de DO 600 de 0,2 em 15 ml de meio fresco.
  5. Incubar levedura a 30 ° C, agitando até que as células atingem a fase de crescimento meio-logarítmica (ie, uma OD 600 entre 0,8 e 1,2).
  6. Durante o crescimento de células de levedura, faça o seguinte, em preparação para o procedimento cicloheximida perseguição:
    1. Definir um bloco de calor que pode acomodar tubos de 15 mL cónicos de 30 ° C durante a incubação das células na presença de ciclo-heximida. Adicionar água para os poços da placa de aquecimento para permitir a distribuição de calor eficiente para as culturas. Adiciona-se água a cada poço de tal modo que um tubo de 15 ml fará com que o nível da água suba para, mas não transbordar, o lábio do poço.
    2. Definir um segundo bloco de aquecimento que pode acomodar tubos de 1,5 ml de microcentrífuga a 95 ° C para a desnaturação de proteínas após a lise celular.
    3. meio de crescimento fresco pré-aquecido (1,1 ml por ponto de tempo por cultura a ser testada) a 30 ° C.
    4. Adicionar 50 ul 20x Parar Mix de pré-rotulados microtubos (um tubo por tempo ponto por cultura a ser testada). Coloque os tubos em gelo.
      CUIDADO: A azida de sódio, um ingrediente em 20x Parar Mix, é tóxico por ingestão oral ou por contacto dérmico. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear azida de sódio. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante.
  7. Quando as células atingiram crescimento meio-logarítmica, recolher 2,5 OD 600 unidades de cada cultura por ponto de tempo a ser testada (por exemplo, 7,5 unidades de OD 600 para analisar a abundância da proteína em três pontos de tempo). Centrifugar as células recolhidas em tubos de 15 ml em 3,0 cónicas00 xg à temperatura ambiente durante 2 min.
    NOTA: Uma unidade DO600 é igual à quantidade de levedura presente em 1 ml de cultura a uma DO 600 de 1,0. O volume de cultura (em ml) necessária para a colheita X OD 600 unidades (V) pode ser determinada usando a seguinte equação: V = X OD 600 unidades / DO600 medido. Por exemplo, para a colheita de 7,5 OD 600 unidades de cultura de células de levedura a uma DO 600 de 1,0, recolher 7,5 OD 600 unidades / 1,0 = 7,5 ml de cultura de levedura.
  8. Ressuspender cada pelete de células em 1 ml de 30 ° C (pré-aquecido) por meio de crescimento fresco com 2,5 OD 600 unidades de células (por exemplo, 3 ml de 7,5 OD 600 unidades).

2. Cycloheximide perseguição

  1. Equilibrar as suspensões de células de levedura por incubação durante 5 min no bloco de calor a 30 ° C.
  2. Prepare um temporizador para contar até de 0:00.
  3. Para começar a perseguição cicloheximida, pressione "Start" no temporizador. rapidamente,mas com cuidado, execute os seguintes passos:
    1. Adicionar ciclo-heximida a uma concentração final de 250 ug / mL à suspensão de células de levedura primeiro (por exemplo, adicionar 37,5 ul de estoque de 20 mg de ciclo-heximida / ml a 3 ml de suspensão de células), e agitar com vortex para misturar brevemente.
      CUIDADO: Ciclo-heximida é um irritante dérmico e é tóxico por ingestão oral. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear cicloheximida. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante.
    2. Imediatamente após a adição de ciclo-heximida e vórtex, transferir 950 ul (~ 2,4 OD 600 unidades) da suspensão de células de levedura com ciclo-heximida adicionado a um tubo de microcentrífuga de pré-marcado contendo 50 ul de mistura de 20x paragem gelada. Vortex o tubo de microcentrífuga e colocar no gelo até que todas as amostras foram coletadas.
    3. Retorno da suspensão de células de levedura a 30 ° C.
  4. Repita os passos 2.3.1 através de 2.30,3 para cada um dos restantes suspensões de células de levedura, a intervalos de tempo regulares (por exemplo, a cada 30 seg, de tal modo que a ciclo-heximida é adicionado à amostra # 1 a 0:00, Amostra # 2 a 0:30, a Amostra # 3 a 1:00 , etc.).
  5. Em cada momento posterior, as suspensões de células de levedura vortex e de transferência de 950 ul a tubos de microcentrífuga rotulado contendo 50 ul pré-refrigerado 20x Parar Mix. Vortex e células lugar recolhido no gelo. Retornar 15 ml tubos cônicos de bloco de calor a 30 ° C.
    1. Por exemplo, para a recolha de células de 30 minutos após a adição de ciclo-heximida (assumindo 30-sec intervalos entre a adição de ciclo-heximida a suspensões de células de levedura, no início do curso de tempo), de vórtice e remover 950 ul de suspensão celular a partir da amostra # 1 a 30:00 . Repita o procedimento para Amostra # 2 em 30:30, e assim por diante.
      NOTA: Para evitar a sedimentação de levedura, as suspensões de células de vórtice em tubos de 15 mL cónicos aproximadamente a cada 5 min durante todo o curso da perseguição. Alternativamente, a suspensão de células de leveduras podem ser mantidos num banho de água agitando continuamente durante o período da experiência cicloheximida perseguição.
  6. Quando todas as amostras terem sido recolhidas, as células recolhidas pelete por centrifugação a 6500 xg à temperatura ambiente durante 30 seg. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. As células estão agora prontos para lise alcalina. Alternativamente, snap-congelar as células peletizadas em azoto líquido e armazenar a -80 ° C.

3. Pós-alcalina extração de proteínas (Modificado de 16,40)

  1. Adicionar 100 ul de água destilada a cada sedimento de células. Ressuspender pipetando cima e para baixo ou vórtex.
  2. Adicionar 100 uL de NaOH 0,2 M a cada amostra. Misturar por pipetagem cima e para baixo ou vórtex.
  3. Incubar as células em suspensão, à temperatura ambiente durante 5 min. Nesta fase, as células de levedura não foram lisadas e as proteínas não tenham sido introduzidos 40.
  4. células de pelotas por centrifugação a 18.000 xg no temperamento quartotura durante 30 segundos. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração.
  5. Para lisar as células, adicionar 100 ul de tampão de amostra de Laemmli a cada sedimento de células. Ressuspender pipetando cima e para baixo ou vórtex.
    NOTA: incubação sequencial de células com proteínas de NaOH e tampão de amostra Laemmli liberta de uma forma compatível com dodecilsulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando um sistema tampão de corrida Tris-glicina.
  6. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturar proteínas totalmente.
    NOTA: A incubação a 95 ° C pode não ser adequado para análise de proteínas que são propensos a agregação (por exemplo, proteínas com vários segmentos transmembranares). Estas proteínas podem tornar-se insolúvel quando incubada a temperaturas elevadas 41. Assim, para a análise de tais proteínas, lisados ​​devem ser incubados a temperaturas mais baixas (por exemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 minutos, tal como determinado empiricamente.
  7. lisados ​​centrifugar a 18.000 xg à room temperatura durante 1 min para sedimentar o material insolúvel. O sobrenadante (solubilizado proteína extraída) está pronta para a separação por SDS-PAGE e subsequente análise de Western blot. Alternativamente, armazenar os lisados ​​a -20 ° C.

4. Representante SDS-PAGE e Western Blotting Procedimento (Adaptado de 16)

  1. Carga de proteína padrões de peso molecular e de volume determinada empiricamente de lisados ​​num gel de SDS-PAGE.
    NOTA: Escolha a percentagem de acrilamida e bis-acrilamida no gel de SDS-PAGE com base no peso molecular da proteína de interesse. Em geral, os géis percentuais mais baixos são mais adequados para a resolução de proteínas de maior peso molecular.
  2. Executar gel a 200 V até a frente do corante atingiu a borda inferior do gel.
  3. Transferir as proteínas do gel para fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana por transferência húmida a 20 V durante 60 - 90 min a 4 ° C.
  4. Bloquear membrana por incubação em tampão Tris-salino tamponado (TBS) contendo 5% de leite desnatado, de balanço, à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4 ° C durante a noite.
    NOTA: Para evitar o crescimento microbiano na presença de uma membrana é incubada durante a noite, recomenda-se a incluir azida de sódio na solução de bloqueio numa concentração final de 0,02%.
  5. Incubar membrana com anticorpo primário específico para a proteína de interesse em TBS com 0,1% de Tween-20 (TBS / T) e 1% de leite desnatado, de balanço, à temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
  7. Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
    NOTA: Os fluoróforos são sensíveis à luz. Portanto, as diluições de anticorpos conjugados com fluoróforos deve ser preparado no escuro, e a incubação de membranas na presença de anticorpos conjugados com fluoróforos e os passos de lavagem subsequentes devem ocorrer em prova de luz (por exemplo, embrulhado em papel alumínio) containers.
  8. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
  9. membrana imagem usando LI-COR Odyssey CLx e software de imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), seguindo as recomendações do fabricante.
  10. Após a aquisição de imagem de membrana, a membrana incubar com um anticorpo primário específico para uma proteína de controlo de carga em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
  11. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
  12. Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado em TBS / T com leite desnatado a 1% à temperatura ambiente durante 1 h, de balanço.
  13. Lavar membrana à temperatura ambiente, 3 x 5 min com TBS / T, de balanço.
  14. membrana imagem como no passo 4.9.

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Representative Results

Para ilustrar cicloheximida metodologia perseguição, a estabilidade de Deg1 -Sec62 (Figura 1), uma degradação -associated (ERAD) substrato modelo de levedura retículo endoplasmático (ER), foi analisada 42-44. Em ERAD, de controlo de qualidade enzimas ubiquitina ligase covalentemente atribuem cadeias da pequena proteína de ubiquitina para as proteínas aberrantes localizadas à membrana do RE. Tais proteínas polyubiquitylated são subsequentemente removidos do ER e degradado pelo proteassoma, um grande, protease citosólica 45. A proteína Deg1 -Sec62 é alvo de degradação depois de persistente e aberrante envolve o translocon, um canal que facilita a translocação de proteínas no lúmen ER ou membrana 43. Da mesma forma, a apolipoproteína B de mamífero, um componente de proteína das lipoproteínas de baixa densidade, persistentemente engata a translocon ER e, subsequentemente, sofre degradação por um mecanismo relacionado quando o seu lábioparceiros de ligação id estão ausentes 46-48. Assim, análises de degradação Deg1 -Sec62 em células de levedura pode produzir insights sobre a degradação de proteínas que persistentemente ou aberrante envolver o translocon, provisoriamente denominado ERAD-T (para-translocon associado) substratos 43.

Estudos anteriores indicaram que os ER residente ubiquitina ligase funções Hrd1 com a enzima de conjugação de ubiquitina Ubc7 para catalisar a degradação de Deg1 -Sec62 16,42-44. A proteína transmembranar Cue1 Ubc7 ancora à membrana do RE e activa a enzima 49-51. No entanto, um requisito para Cue1 na degradação de Deg1 -Sec62 não foi directamente investigada. Para testar a hipótese de que Cue1, como Hrd1 e Ubc7, é necessário para a degradação eficientes do Deg1 -Sec62, de tipo selvagem e mutantes de células de levedura que expressam Deg1 -Sec62 foram submetidos a perseguição e ciclo-heximida Wesanálise de mancha de andorinha (Figura 2A). A proteína Deg1 -Sec62 migra em SDS-PAGE como múltiplas espécies. Isto é consistente com estudos anteriores que indicam extensa modificação pós-tradução da proteína 43,44,52. Em células de levedura de tipo selvagem, Deg1 -Sec62 foi prontamente degradada. Como observado anteriormente, a perda de qualquer Hrd1 ou Ubc7 estabilizou substancialmente a proteína Deg1 -Sec62 42-44. Como previsto, Deg1 -Sec62 foi estabilizado na ausência de Cue1 (numa extensão semelhante como na ausência de Ubc7), confirmando um papel para a proteína que interage em Ubc7-ERAD-T.

A proporção de proteína Deg1 -Sec62 restante em cada ponto de tempo foi quantificada e está representada na Figura 2B. Notamos que a taxa aparente de desaparecimento de Deg1 -Sec62 em células do tipo selvagem pode ser uma subestimação da taxa de degradação da nascente Deg1 -Sec62(Isto é, meia-vida da proteína, que pode ser mais directamente determinada por análise de pesquisa por pulso 43). Por causa do tipo selvagem de levedura activamente degradar a proteína Deg1 -Sec62 antes da adição de ciclo-heximida, abundância constante estado de Deg1 -Sec62 é substancialmente reduzida nestas células (em comparação com as células em que a degradação é diminuída). Isto pode ser apreciado por comparação da abundância de Deg1 -Sec62 nos pontos de tempo iniciais para cada estirpe na Figura 2A. Além disso, qualquer degradação subpopulação resistente à da proteína de substrato (por exemplo, se a proteína acumula-se no piscinas intracelulares a partir da qual é impedido de degradação) podem aparecer relativamente estável em células de tipo selvagem ao longo do tempo da experiência.

figura 1
Figura 1. Modelo de Degradação de Deg1 -Sec62 Seguinte aberrante Contratação de translocon (A) Representação esquemática do Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 é constituído pelos seguintes elementos, em sequência:.. Deg1 (os 67 aminoácidos amino-terminais da levedura repressor da transcrição MATα2), uma bandeira (F) epitopo, da proteína 2-transmembranar sec62, e duas cópias do Staphylococcus aureus proteína a (PRA). (B) após a inserção de co-traducional normal dos seus dois segmentos transmembranares para a membrana do retículo endoplasmático (ER), uma associação persistente de Deg1 -Sec62 com o translocon desencadeia, Deg1 dependente, envolvimento translocon pós-translacional anormal. Uma porção do terminal amino citosólica e entra-aberrante provavelmente permanece dentro translocon-o. (C) Seguindo acoplamento translocon, a ubiquitina-ligase Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 é assistida pela enzima de conjugação de ubiquitina LBC7, que está ancorada na membrana ER por Cue1. Ub, os monómeros de proteína ubiquitina. (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 é extraído a partir da membrana ER e degradada pelo proteassoma, alívio da obstrução translocon. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Cycloheximide perseguição seguido por Western Blotting Indica que Cue1 é necessária para uma eficiente Degradação Deg1 -Sec62. (A) células de levedura da genótipos indicados foram transformadas com um plasmídeo de levedura que codifica centromérica Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) e sujeitas a análise de ciclo-heximida perseguição. Proteínas a partir de cada ponto de tempo (equivalente a 0,125 OD 600 unidades) foram separados num gel de SDS-PAGE a 8% e detectados por Western blotting com anticorpos secundários de coelho anti-rato, que se ligam directamente os epitopos de proteína A do terminal C do Deg1 - sec62 proteína de fusão. Como um controlo de carga, a membrana foi subsequentemente incubada com anticorpos específicos para PGK1. Este experimento foi replicado três vezes; Os resultados representativos são representados. (B) Quantificação dos dados em (A) foi realizada usando software de imagiologia (ver Tabela de Materiais). A intensidade de fluorescência de uma área envolvendo a proteína Deg1 -Sec62 foi determinada para cada amostra. Fundo da intensidade de fluorescência para cada amostra foi extrapolada a partir da intensidade de fluorescência média de pixels próximos da proteína Deg1 -Sec62. Este extrapolada intensidade de fluorescência de fundo foi subtraída a intensidade total de fluorescência ajustado para produzir fluoresintensidade cia para cada amostra. quantificações similares para o total de fundo, e intensidades de fluorescência ajustadas foram realizadas para PGK1, uma proteína de controlo de carga cuja abundância não varia nas condições ensaiadas. Para comparar a abundância de proteína Deg1 -Sec62 entre amostras, uma proporção das intensidades de sinal é ajustada de Deg1 -Sec62 para PGK1 foi determinada para cada amostra. A proporção Deg1 -Sec62 / PGK1 foi definida como 100% para o primeiro ponto de tempo (isto é, imediatamente após a adição de ciclo-heximida) para cada estirpe em estudo. A quantidade de Deg1 -Sec62 restante em pontos de tempo subsequentes (ou seja, os rácios Deg1 -Sec62 / PGK1) foi calculado como uma porcentagem da relação Deg1 -Sec62 / PGK1 no primeiro ponto de tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Synthetic Definido (SD) Medium Yeast Minimal 2% de dextrose, 0,67% de base azotada de levedura sem aminoácidos, 0,002% de adenina, 0,004% de uracilo, 0,002% de arginina, 0,001% de histidina, 0,006% isoleucina, 0,006% de leucina, 0,004% de lisina, 0,001% de metionina, 0,006% de fenilalanina, 0,005 % treonina, triptofano 0,004%. Por meio sólido (placa), incluir 2% de agar. 1. meio selectivo é preparado por omitindo ácido apropriado (s) amino ou bases azotadas.
2. Por razões de conveniência, estes ingredientes podem ser mantidas como soluções stock concentradas como se segue. Os aminoácidos podem ser mantidas como 100x solução estoque contendo todos os aminoácidos desejados. base de azoto de levedura pode ser mantido numa solução estoque 20x (13,4%). Dextrose pode ser mantida numa solução de 40%. Adenina e uracilo podem ser mantidas como soluções de reserva a 1% em NaOH a 0,1 M.
3.Esterilizar meio em autoclave.
Extracto de levedura-peptona dextrose (YPD) meio rico levedura 1% de extracto de levedura, 2% de peptona, 2% de dextrose (Opcional: 0,002% de adenina). Por meio sólido (placa), incluir 2% de agar. 1. Para evitar que o crescimento lento e coloração vermelha característica de estirpes de leveduras particulares laboratório na ausência (ou baixa abundância) de adenina, adenina pode ser adicionado ao meio de crescimento de YPD.
2. Por conveniência, alguns ingredientes podem ser mantidas como soluções stock concentradas como se segue. Dextrose pode ser mantida numa solução de 40%. Adenina pode ser mantido como uma solução stock de 1% em NaOH 0,1 M.
3. Esterilizar meio em autoclave.
20x Mix Parar 200 mM de azida de sódio, 5 mg / ml de albumina de soro bovino A azida sódica é tóxica por ingestão oral ou por contacto dérmico. siga fabricanterecomendações ao preparar, armazenar e manusear azida de sódio. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante.
20 mg / ml de cicloheximida 1. Preparar, em etanol. Armazenar a -20 ° C.
2. Ciclo-heximida é um irritante dérmico e é tóxico por ingestão oral. Siga as recomendações do fabricante ao preparar, armazenar e manusear cicloheximida. Em caso de exposição acidental, consulte a folha de dados de segurança fornecido pelo fabricante.
0,2 M de hidróxido de sódio Prepare-se com água. Hidróxido de sódio reage com o vidro. Por conseguinte, para armazenamento a longo prazo, de hidróxido de sódio 0,2 M deve ser mantido em recipientes de plástico.
Tampão de amostra de Laemmli 2% de SDS, 10% glicerol, 5% &# 946; -mercaptoetanol, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% de azul de bromofenol 1. Tampão de amostra de Laemmli é frequentemente preparada por diluição de um material mais concentrado (por exemplo, 5x).
2. O corante azul de bromofenol pode ser adicionado a intensidade desejada. Um "pinch" (muito pequena quantidade roscado a partir da extremidade de uma espátula) é tipicamente suficiente.
Laemmli Correr Buffer (5x) Tris 125 mM, glicina 960 mM, SDS a 0,5% Para preparar 1 L de tampão de corrida 1x Laemmli, dilua 1: 5 em dH2O
Tris-Acetato de SDS Tampão de Transferência (5x) 125 mM de Tris acetato (pH 8,8), glicina 960 mM, 0,05% de SDS Para preparar 20 L de 1x Tris-Acetato de SDS Tampão de Transferência, combinar 4 L de estoque de 5x, 4 L de metanol, e 12 L de dH2O
10x Tris-Buffered Saline (TBS) Tris 500 mM, NaCl 1,5 M; pH ajustado para 7,5 Para preparar 1 L de 1x TBS, diluir 1:10 em dH 2 O. 1x TBS pode ser suplementado com o detergente Tween-20 e leite magro em pó, como apropriado.

Tabela 1. soluções utilizadas neste estudo.

Nome Strain aliás genótipo relevante Referências
VJY42 MHY501 MATa Chen et al., 1993
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
Gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATa Jungmann et al., 1993; Rubenstein et al., 2012
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
Gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATa Biederer et al., 1997; Ravid et ai., 2006
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
Gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATa Este estudo
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
Gal2
hrd1Δ :: kanMX4

Tabela 2. Cepas de levedura utilizada neste estudo. Todas as estirpes são congênica com MHY500 53. VJY42, VJY47, e VJY56 foram descritos anteriormente 49,53,54. Uma geração detalhada tensão e estratégia de confirmação para VJY172 (preparado para este estudo) está disponível mediante solicitação.

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Discussion

Neste trabalho, um método para a análise cinética de degradação da proteína é apresentada. Esta técnica pode ser facilmente aplicado a uma variedade de proteínas degradadas por uma variedade de mecanismos. É importante notar que os ensaios de ciclo-heximida chase informar sobre a cinética de degradação de piscina de estado estacionário de uma dada proteína. Outras técnicas podem ser usadas para analisar a cinética de degradação de populações específicas de proteínas. Por exemplo, o destino de degradação de polipeptídeos nascentes podem ser rastreados por análise de perseguição de pulso 55. Em tais experiências, as proteínas nascentes são brevemente pulso-marcada (por exemplo, com aminoácidos radioactivos). Alterações na abundância das proteínas nascentes marcado (que pode ou não pode espelhar mudanças na abundância de proteína em estado estacionário) pode ser rastreado ao longo do tempo.

Perseguição ciclo-heximida é apropriado para analisar a estabilidade da proteína durante um curso de tempo relativamente curto (isto é, até duas horas). Mais de um tempo mais longo courses (isto é, duas horas ou dias), ciclo-heximida, um inibidor da tradução mundial, é tóxico para as células, provavelmente devido à depleção de ubiquitina 56. Além disso, análises de estabilidade das proteínas ao longo de cursos de tempo mais longos são mais susceptíveis de ser comprometida pelos efeitos indirectos da síntese de proteínas deficientes globalmente sobre a degradação da proteína de interesse (por exemplo, a degradação de uma proteína de curta duração envolvidas na degradação da proteína de interesse). Outras técnicas, tais como a pesquisa por pulso experiências de marcação metabólica, são, portanto, mais adequado para estudar a degradação de proteínas de longa duração e podem ser realizados para confirmar os resultados obtidos em experiências com ciclo-heximida Chase.

O tempo de adição de ciclo-heximida e a recolha das células é uma consideração importante no presente processo. A precisão é especialmente importante para a análise de proteínas de vida muito curta, tal como pequenos desvios no tempo decorrido a partir de ciclo-heximida adição para a colheita de células pode ter um impacto substancial na cinética de degradação aparentes. Além disso, sem um plano claro para a execução destes passos sensíveis ao tempo, um experimento pode transformar-se rapidamente em caos e frustração. Por esta razão, recomenda-se adicionar cicloheximida para culturas em intervalos regulares, planeados. intervalos de 30 seg são sugeridas neste protocolo, mas o tempo pode ser ajustado para coincidir com o nível de conforto e destreza do investigador. investigadores novatos podem achar que é útil para escrever um cronograma de horários de coleta de amostra antes de iniciar o experimento e atravessar fora cada coleta programada como ele ocorre.

Nos passos 1.7 e 1.8 do protocolo aqui descrito, as culturas de células de levedura estão concentrados na redução dos volumes de meio de crescimento para facilidade de manipulação durante o processo de ciclo-heximida perseguição subsequente. No entanto, a centrifugação de células de levedura induz rapidamente determinadas respostas de stress celular (por exemplo, vias de sinalização quesão ativados pela privação de glicose) 57,58. Os investigadores estão, portanto, advertiu contra a longos períodos de centrifugação. Quando se analisa a estabilidade de proteínas que podem ser sensíveis a centrifugação, os investigadores podem desejar adicionar cicloheximida directamente a culturas de fase mid-log sem prévia centrifugação. Em tais casos, a ciclo-heximida deve ser adicionado à mesma concentração final (250 ug / ml), e as amostras de células de levedura podem ser recolhidas por metodologias que não necessitam de um passo de centrifugação inicial (por exemplo, filtração rápida) 57. Além disso, nos Passos 2,3-2,5, as amostras recolhidas em cada ponto de tempo são transferidos para uma solução que contém azida de sódio e colocadas em gelo. Estas condições inibem continuou a degradação de proteínas durante o período da perseguição. Deve notar-se que a azida reduz a concentração celular de ATP 59, inibindo assim especificamente a actividade de proteases dependentes de ATP. Enquanto temperatura reduzida deve umlso reduzir a taxa na qual a função proteolítica processos não dependente de ATP, os investigadores que estudam proteínas degradadas por tais mecanismos pode, alternativamente, optar por ajustar-congelamento sedimentos de células em azoto líquido à medida que cada amostra seja colhida.

Um protocolo de exemplo para a lise celular e um protocolo representativo para western blot incluídos neste manuscrito foram adaptados a partir de relatórios anteriores 16,40. No método de lise alcalina descrito pós-aqui, NaOH pré-tratamento aumenta a extracção de proteínas de levedura após a subsequente adição de tampão de amostra Laemmli. O mecanismo pelo qual essa melhoria ocorre é mal caracterizada 40. No entanto, polissacáridos, tais como aqueles encontrados em paredes de células de levedura são solubilizados em condições alcalinas 60. Por conseguinte, é tentador especular que a incubação na presença de NaOH parcialmente ou completamente esferoplastos células de levedura (ou seja, remove componentes da parede celular), tornando-os mais Sensitivde e para o detergente SDS presente no tampão de amostra Laemmli. Porque as proteínas são libertados sob condições altamente desnaturantes, os inibidores da protease não necessitam de ser incluídos no tampão de amostra Laemmli. O método específico de lise celular pode ser modificada conforme apropriado para uma dada experiência. Por exemplo, o método de lise alcalina pós-pode não ser adequado para as proteínas de baixa abundância ou proteínas que são pobremente detectados por Western blot. Em tais casos, os métodos que incluem um passo de precipitação de ácido tricloroacético a concentrar-se amostras de proteína pode ser mais apropriado 61. Além disso, várias considerações importantes sobre a seleção de anticorpos, Carregando controlo escolha e meios alternativos de detecção (por exemplo, transferência de western quimiluminescente usando sistemas de filme ou imagem digital) ter sido discutido recentemente 16. A quantificação da abundância de proteínas ciclo-heximida a seguir ao tratamento podem ser efectuados. Muitos sistemas de imagem são vendidos com pacotes de software que facilitamesta análise.

Cicloheximida perseguição pode ser implementado para analisar a degradação de uma variedade de proteínas de levedura e pode ser adaptado para estudar a estabilidade da proteína em outras células eucarióticas. Tal como descrito no presente protocolo, o tratamento com ciclo-heximida é seguido por lise de células e detecção da abundância de proteína por análise de Western blot. Dependendo da aplicação, no entanto, a abundância de proteínas ciclo-heximida a seguir ao tratamento pode ser avaliada por uma variedade de técnicas, conforme apropriado para objectivos de investigação. Por exemplo, se o tamanho da proteína não é um factor relevante para a análise, os lisados ​​celulares podem ser sujeitos a análise dot blot ou ligado a enzima ensaio imunoabsorvente (ELISA), que informam sobre a abundância de proteínas, mas não aparente peso molecular 62. Para as proteínas na superfície celular (ou fluorescente interna proteínas marcadas com internos), citometria de fluxo pode ser utilizado para quantificar a abundância de proteínas de amostras em momentos diferentes após a adição de ciclo-heximida 51. Fluomicroscopia rescência tratamento após cicloheximida iria fornecer informações tanto a abundância de proteínas e localização 18. A gama de substratos, organismos e aplicações a jusante passíveis de perseguição cicloheximida torna a técnica um meio altamente versáteis e informativos de estudar a degradação de proteínas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

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Biochemistry 110 Edição, A brotação de levedura os mutantes a degradação associada ao retículo endoplasmático degradação de proteínas perseguição cicloheximida translocon sistema ubiquitina-proteassoma
Cicloheximida Análise perseguição de degradação da proteína em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

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