Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Regolamento di abbondanza di proteine ​​è fondamentale per praticamente ogni processo cellulare. Proteina abbondanza riflette l'integrazione delle aliquote di sintesi proteica e la degradazione delle proteine. Molti saggi di relazioni su abbondanza di proteine ​​(per esempio, in tempo unico punto western blotting, citometria a flusso, microscopia a fluorescenza, o saggi di crescita giornalista-based) non consentono la discriminazione degli effetti relativi di traduzione e proteolisi sui livelli di proteine. Questo articolo descrive l'uso di cycloheximide caccia seguita da Western blotting per analizzare specificamente degradazione delle proteine ​​nel modello eucarioti unicellulari, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito). In questo procedimento, cellule di lievito vengono incubate in presenza di cicloesimide inibitore traduzionale. Aliquote di cellule vengono raccolte subito dopo e in punti temporali specifici seguenti aggiunta di cicloesimide. Le cellule sono lisate, e lisati sono separati da gel di poliacrilammide for analisi Western Blot di abbondanza di proteine ​​in ogni punto. La procedura cicloeximide chase permette la visualizzazione della cinetica di degradazione della popolazione stato stazionario di una varietà di proteine ​​cellulari. La procedura può essere utilizzata per studiare i requisiti genetici per e influenze ambientali sulla degradazione delle proteine.

Introduction

Le proteine ​​svolgono funzioni cruciali praticamente in ogni processo cellulare. Molti processi fisiologici richiedono la presenza di una specifica proteina (o proteine) per un determinato periodo di tempo o in particolari circostanze. Organismi quindi controllare e regolare l'abbondanza di proteine ​​per soddisfare le esigenze cellulari 1. Ad esempio, cicline (proteine ​​che controllano la divisione cellulare) sono presenti in specifiche fasi del ciclo cellulare, e la perdita di livelli di ciclina regolamentati è stata associata con la formazione di tumore maligno 2. Oltre a regolare i livelli di proteine ​​per soddisfare le esigenze cellulari, le cellule utilizzano meccanismi di controllo della qualità degradativi di eliminare mal ripiegate, non montati, o in altro modo aberranti molecole proteiche 3. Controllo di abbondanza di proteine ​​comporta regolazione sia la sintesi macromolecolari (trascrizione e traduzione) e la degradazione (RNA decadimento e proteolisi). degradazione delle proteine ​​deteriorate o eccessivo contribuisce a molteplici patologie, Tra cui il cancro, fibrosi cistica, malattie neurodegenerative, disturbi cardiovascolari e 4-8. Meccanismi proteolitici rappresentano quindi bersagli terapeutici promettenti per una serie di malattie 9-12.

L'analisi delle proteine ​​in un unico punto di tempo (ad esempio, da Western Blot 13, citometria a flusso 14, o microscopia a fluorescenza 15) fornisce un'istantanea di costante abbondanza di proteine ​​stato senza rivelare i relativi contributi di sintesi o degradazione. Allo stesso modo, le analisi giornalista di crescita a base riflettono costanti i livelli di proteina stato più di un periodo di tempo prolungato senza discriminazioni tra le influenze di sintesi e degradazione 15-20. È possibile dedurre il contributo dei processi degradativi a livelli proteici stato stazionario confrontando abbondanza prima e dopo inibendo componenti specifici del meccanismo degradativa (ad esempio, dal farmacologicamente inattivando la proteasome 21 o buttare giù un gene ipotizzato per essere necessari per la degradazione 13). Un cambiamento nei livelli di proteina regime permanente dopo inibendo percorsi degradativi fornisce una forte evidenza per il contributo della proteolisi per il controllo delle proteine ​​dell'abbondanza 13. Tuttavia, una tale analisi ancora non fornisce informazioni per quanto riguarda la cinetica del turnover proteico. Chase Cycloheximide seguita da western blotting supera queste debolezze, consentendo ai ricercatori di visualizzare la degradazione delle proteine ​​nel tempo 22-24. Inoltre, poiché la rilevazione delle proteine ​​seguente cycloheximide Chase è in genere eseguita da western blotting, isotopi radioattivi e passaggi immunoprecipitazione lunghi non sono necessari per cycloheximide caccia, a differenza di molte tecniche di inseguimento di impulso comunemente utilizzate, che sono anche eseguite per visualizzare la degradazione delle proteine ​​25.

Cycloheximide è stato identificato come un composto anti-fungine correttalegami prodotte dai Streptomyces batterio gram-positivo griseus 26,27. Si tratta di una molecola cellula-permeabile che inibisce specificamente citosolico eucariote (ma non organelli) Traduzione alterando ribosomiale traslocazione 28-31. In un esperimento cicloesimide chase, cycloheximide viene aggiunta alle cellule, e aliquote di cellule vengono raccolti immediatamente e in punti temporali specifici seguenti aggiunta del composto 22. Le cellule sono lisate, e l'abbondanza di proteine ​​in ogni punto viene analizzato, in genere western blot. Diminuisce in abbondanza di proteine ​​dopo l'aggiunta di cycloheximide può essere tranquillamente attribuita alla degradazione delle proteine. Una proteina instabile diminuirà in abbondanza nel tempo, mentre una proteina relativamente stabile esporrà piccolo cambiamento in abbondanza.

Meccanismi di degradazione delle proteine ​​selettivo sono state altamente conservata in tutta Eukarya. Molto di ciò che si conosce la degradazione delle proteine ​​primo è stato appreso inil modello eucariote unicellulare, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito) 25,32-36. Studi con il lievito sono suscettibili di continuare a fornire spunti nuovi ed importanti nella degradazione delle proteine. Un metodo per cicloesimide inseguimento in cellule di lievito seguita da Western blot di abbondanza di proteine ​​è presentato qui.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. La crescita e Harvest delle cellule di lievito

  1. Se non analizzando la cinetica di degradazione di una proteina endogena lievito, trasformare ceppo di lievito desiderato (s) con un plasmide codificante la proteina di interesse. Metodi affidabili per il lievito di trasformazione sono stati precedentemente descritti 37.
  2. Seminare lievito in 5 ml di terreno appropriato (ad esempio, definito (SD) mezzo sintetico selettivo per manutenzione plasmide di cellule trasformate o) medium lievito non selettivo extract-peptone-destrosio (YPD per le cellule non trasformate). Incubare per una notte a 30 ° C, rotante.
    NOTA: 30 ° C è la temperatura di crescita ottimale per tipica wild-type ceppi di laboratorio di lievito 38. Tuttavia, poiché alcuni ceppi di lievito mutanti non crescono in modo ottimale a 30 ° C e alcune proteine ​​subiscono degradazione dipendente dalla temperatura, le temperature utilizzate per la crescita cellulare del lievito e cicloesimide chase dovrebbero essere determinati empiricamente 39.
  3. misurare °densità ottica e a 600 nm (OD 600) di ogni cultura durante la notte.
    NOTA: Le cellule possono essere in fase di crescita logaritmica o stazionaria ma avrebbe minimamente raggiunto una densità che permetterà di diluizione ad una OD 600 = 0.2 in 15 ml di mezzo fresco.
  4. Diluire le culture durante la notte per un valore di 600 OD di 0,2 a 15 ml di terreno fresco.
  5. Incubare lievito a 30 ° C, agitando fino a quando le cellule raggiungono fase di crescita medio logaritmica (cioè, un OD 600 tra 0,8 e 1,2).
  6. Durante la crescita delle cellule di lievito, eseguire le seguenti in preparazione per la procedura cicloesimide chase:
    1. Impostare un blocco di calore che può ospitare 15 ml provette coniche da 30 ° C per l'incubazione delle cellule in presenza di cicloesimide. Aggiungere l'acqua ai pozzi del blocco di calore per consentire la distribuzione di calore efficiente alle culture. Aggiungere acqua a ciascun pozzetto tale che un tubo da 15 ml causerà il livello dell'acqua a salire a, ma non troppo pieno, il bordo del pozzo.
    2. Impostare un secondo blocco di calore che può ospitare provette da 1,5 ml microcentrifuga a 95 ° C per la denaturazione proteica seguenti lisi cellulare.
    3. medio Pre-caldo crescita fresco (1,1 ml per punto di tempo per la cultura per essere analizzati) a 30 ° C.
    4. Aggiungere 50 ml 20x stop Mix di pre-etichettati microprovette (un tubo per volta punto per ogni cultura deve essere analizzato). Mettere i tubi in ghiaccio.
      ATTENZIONE: sodio azide, un ingrediente in 20x arresto Mix, è tossico tramite ingestione o contatto dermico. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e sodio azide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore.
  7. Quando le cellule hanno raggiunto una crescita mid-logaritmica, raccogliere 2,5 OD 600 unità di ogni cultura per ogni punto di tempo per essere analizzato (ad esempio, 7,5 OD 600 unità per analizzare l'abbondanza di proteine ​​a tre punti di tempo). Centrifuga raccolte le cellule in 15 ml provette coniche a 3,000 xg a temperatura ambiente per 2 min.
    NOTA: Un OD 600 unità è uguale alla quantità di lievito presente in 1 coltura ml ad una OD 600 di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere X OD 600 unità (V) può essere determinato utilizzando la seguente equazione: V = X OD 600 unità / OD 600 misurato. Ad esempio, per raccogliere 7,5 OD 600 unità di coltura cellulare di lievito ad una OD 600 di 1,0, raccogliere 7,5 OD 600 unità / 1,0 = 7,5 ml coltura di lievito.
  8. Risospendere ogni pellet di cellule in 1 ml di 30 ° C (pre-riscaldato) mezzo di crescita fresco per 2,5 OD 600 unità di cellule (ad esempio, 3 ml per 7,5 OD 600 unità).

2. Cycloheximide Chase

  1. Equilibrare sospensioni cellulari di lievito mediante incubazione per 5 minuti nel blocco C di calore 30 °.
  2. Preparare un timer a contare da 0:00.
  3. Per iniziare l'inseguimento cicloesimide, premere il tasto "Start" sul timer. rapidamente,ma attenzione, effettuare le seguenti operazioni:
    1. Aggiungere cicloesimide ad una concentrazione finale di 250 mg / ml di sospensione cellulare prima di lievito (ad esempio, aggiungere 37,5 ml di 20 mg / ml di cicloeximide a 3 ml di sospensione cellulare), e vortex brevemente per miscelare.
      ATTENZIONE: Cicloeximide è un irritante cutaneo ed è tossico tramite l'ingestione orale. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e cicloesimide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore.
    2. Immediatamente dopo l'aggiunta di cicloesimide e vortex, trasferire 950 ul (~ 2,4 OD 600 unità) della sospensione di cellule di lievito con cicloesimide aggiunto ad una provetta di pre-etichettati contenente 50 ml mix 20x fermata ghiacciata. Agitare la provetta, e posto sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti.
    3. Riportare la sospensione cellulare di lievito a 30 ° C.
  4. Ripetere passaggi 2.3.1 attraverso 2.3.3 Per ciascuno dei restanti sospensioni cellulari di lievito a intervalli di tempo regolari (ad esempio, ogni 30 secondi, in modo tale che viene aggiunto al campione cycloheximide 1 # alle 0:00, Esempio # 2 alle 0:30, Esempio # 3 a 1:00 , ecc.).
  5. Ad ogni punto di tempo successivo, le sospensioni vortice di cellule di lievito e il trasferimento di 950 ml per provette da microcentrifuga etichettati contenenti 50 ml di pre-raffreddata 20x stop Mix. Vortex e cellule di posizione raccolti su ghiaccio. Rientro 15 ml provette coniche a 30 ° C blocco di calore.
    1. Ad esempio, per la raccolta di cellule 30 min dopo l'aggiunta cicloesimide (supponendo 30-sec intervalli tra oltre cicloesimide per sospensioni di cellule di lievito all'inizio del corso tempo), vortex e rimuovere 950 ml di sospensione cellulare da Esempio # 1 a 30:00 . Ripetere per esempio # 2 a 30:30, e così via.
      NOTA: per impedire sedimentazione di lievito, sospensioni cellulari vortice in 15 ml provette coniche circa ogni 5 min durante tutto il corso della caccia. In alternativa, la sospensione cellula di lievitos può essere mantenuta in un bagno di acqua di continuo agitazione per tutta la durata dell'esperimento cicloesimide caccia.
  6. Quando tutti i campioni sono stati raccolti, pellet raccolte le cellule per centrifugazione a 6.500 xg a temperatura ambiente per 30 sec. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. Le cellule sono ora pronti per lisi alcalina. In alternativa, le cellule pellet in azoto liquido e conservare freeze scatto a -80 ° C.

3. Post-alcalina Protein Extraction (Modificata da 16,40)

  1. Aggiungere 100 ml di acqua distillata a ciascun pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù o vortex.
  2. Aggiungere 100 pl di 0,2 M NaOH per ogni campione. Mescolare pipettando su e giù o vortex.
  3. Incubare le cellule in sospensione a temperatura ambiente per 5 min. In questa fase, le cellule di lievito non sono state lisate, e proteine ​​non sono stati rilasciati 40.
  4. Cellule pellet per centrifugazione a 18.000 xg a carattere localeature per 30 sec. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione.
  5. Per lisare cellule, aggiungere 100 ml di tampone campione Laemmli a ciascuna pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù o vortex.
    NOTA: l'incubazione sequenziale delle cellule con il tampone rilascia NaOH e Laemmli proteine ​​in una forma compatibile con dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone di corsa Tris-glicina.
  6. Incubare a 95 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine ​​completamente.
    NOTA: incubazione a 95 ° C può non essere adatto per l'analisi di proteine ​​che sono inclini a aggregazione (ad esempio, proteine ​​con diversi segmenti transmembrana). Queste proteine ​​possono diventare insolubile quando incubate a temperature elevate 41. Così, per l'analisi di tali proteine, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio, 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 minuti, come determinato empiricamente.
  7. lisati centrifugare a 18.000 xga rotemperatura om per 1 min per far sedimentare il materiale insolubile. Il supernatante (proteina estratta solubilizzati) è pronto per separazione mediante SDS-PAGE e successiva analisi western blot. In alternativa, conservare lisati a -20 ° C.

4. Rappresentante SDS-PAGE e Western Blotting procedura (Adattato da 16)

  1. Carico proteine ​​standard di peso molecolare e determinato empiricamente volume di lisati su un gel SDS-PAGE.
    NOTA: Scegliere la percentuale di acrilamide e bis-acrilammide nel gel SDS-PAGE in base al peso molecolare della proteina di interesse. In generale, più bassi gel percentuali sono più adatti per risolvere superiori proteine ​​peso molecolare.
  2. Eseguire gel a 200 V fino a quando il fronte del colorante ha raggiunto il bordo inferiore del gel.
  3. Trasferire proteine ​​dal gel di fluoruro di polivinilidene membrana (PVDF) mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C.
  4. Bloccare membrana incubando in Tris-Buffered Saline (TBS) contenente 5% di latte scremato, dondolo, a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 ° C durante la notte.
    NOTA: per evitare la crescita microbica in presenza di una membrana incubate durante la notte, si raccomanda di includere azide di sodio nella soluzione di blocco ad una concentrazione finale di 0,02%.
  5. Incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) e 1% di latte scremato, dondolo, a temperatura ambiente per 1 ora.
  6. Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo.
  7. Incubare a membrana con appropriata anticorpo secondario fluoroforo coniugato in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo.
    NOTA: Fluorofori sono sensibili alla luce. Pertanto, diluizioni di anticorpi coniugati a fluorofori devono essere preparati al buio, e l'incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati a fluorofori e successive fasi di lavaggio dovrebbe avvenire a tenuta di luce (ad esempio, un foglio-avvolto) containers.
  8. Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo.
  9. membrana delle immagini con LI-COR Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), seguendo le raccomandazioni del produttore.
  10. Dopo immagine membrana acquisizione, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per una proteina di controllo di carico in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo.
  11. Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo.
  12. Incubare a membrana con appropriata anticorpo secondario fluoroforo coniugato in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo.
  13. Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo.
  14. Immagine membrana come al punto 4.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Per illustrare la metodologia caccia cicloesimide, la stabilità del Deg1 -Sec62 (figura 1), un substrato modello di lievito reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD), è stato analizzato 42-44. In ERAD, il controllo di qualità enzimi ubiquitina ligasi covalente attribuiscono catene del piccolo ubiquitina proteine ​​di proteine ​​aberranti localizzate alla membrana ER. Tali proteine ​​polyubiquitylated vengono successivamente rimossi dal pronto soccorso e degradati da parte del proteasoma, un grande, proteasi citosolico 45. La proteina Deg1 -Sec62 si rivolge per la degradazione dopo che è persistente e aberrante impegna il translocon, un canale che facilita la traslocazione di proteine ​​nel lume ER o membrana 43. Analogamente, mammiferi apolipoproteina B, un componente proteico delle lipoproteine ​​a bassa densità, impegna costantemente il translocon ER e successivamente subisce degradazione attraverso un meccanismo relativo quando il labbroid partner di legame sono assenti 46-48. Così, analisi del degrado Deg1 -Sec62 in cellule di lievito può produrre comprensione della degradazione delle proteine ​​che svolgono persistente o aberrante la translocon, provvisoriamente chiamato ERAD-T (per translocon-associato) substrati 43.

Precedenti studi hanno indicato che le ER-residente ubiquitina ligasi funzioni Hrd1 con l'enzima ubiquitina-coniugando Ubc7 per catalizzare la degradazione di Deg1 -Sec62 16,42-44. La proteina transmembrana CUE1 ancore Ubc7 alla membrana ER e attiva l'enzima 49-51. Tuttavia, un requisito per CUE1 nella degradazione di Deg1 -Sec62 non è stata studiata direttamente. Per verificare l'ipotesi che CUE1, come Hrd1 e Ubc7, è necessaria per un efficiente degradazione della Deg1 -Sec62, wild-type e le cellule di lievito mutanti che esprimono Deg1 -Sec62 sono stati sottoposti a cycloheximide Chase e wesblot sterna (Figura 2A). La proteina Deg1 -Sec62 migra su SDS-PAGE in più specie. Questo è coerente con gli studi precedenti indicano vasta modificazione post-traduzionale di proteine ​​43,44,52. In cellule di lievito wild-type, Deg1 -Sec62 era facilmente degradato. Come già osservato, la perdita di una o Hrd1 Ubc7 sostanzialmente stabilizzata della proteina Deg1 -Sec62 42-44. Come previsto, Deg1 -Sec62 è stato stabilizzato in assenza di CUE1 (in misura simile in assenza di Ubc7), confermando un ruolo per la proteina Ubc7 interagente in ERAD-T.

La percentuale di Deg1 -Sec62 proteine ​​rimanendo ad ogni tempo è stata quantificata ed è tracciata nella Figura 2B. Prendiamo atto che il tasso apparente della scomparsa di Deg1 -Sec62 nelle cellule wild-type può essere una sottostima della velocità di degradazione del nascente Deg1 -Sec62(Cioè, l'emivita della proteina, che può essere determinato mediante analisi più direttamente pulse chase 43). Perché wild-type lievito degrada attivamente la proteina Deg1 -Sec62 prima dell'aggiunta cycloheximide, costante abbondanza stato di Deg1 -Sec62 è sostanzialmente ridotta in queste cellule (rispetto alle cellule in cui è compromessa la degradazione). Questo può essere apprezzata confrontando l'abbondanza di Deg1 -Sec62 nei punti temporali iniziali per ogni ceppo in Figura 2A. Inoltre, qualsiasi sottopopolazione degradazione resistente della proteina substrato (ad esempio, se la proteina si accumula in piscine intracellulari da cui viene impedito il degrado) potrebbe apparire relativamente stabile in cellule wild-type nel corso tempo dell'esperimento.

Figura 1
Figura 1. Modello della degradazione di Deg1 -Sec62 Seguente aberrante impegno di translocon (A) Rappresentazione schematica del Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 è costituito dai seguenti elementi, in sequenza:.. Deg1 (i 67 aminoacidi amino-terminale del lievito repressore trascrizionale MATα2), una bandiera (F) epitopo, la proteina 2-transmembrana Sec62, e due copie della Staphylococcus aureus Protein A (PrA). (B) dopo l'inserimento co-traslazionale normale dei due segmenti transmembrana nella membrana del reticolo endoplasmatico (ER), associazione persistente di Deg1 -Sec62 con il translocon innesca anormale, Deg1-dipendente, l'impegno translocon post-traslazionale. Una parte del capolinea amino citosolico entra-e aberrante probabile rimane all'interno del-translocon. (C) A seguito di impegno translocon, l'ubiquitina ligasi Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 è assistito dall'enzima ubiquitina-coniugando UBC7, che è ancorata nella membrana ER da CUE1. Ub, monomeri proteina ubiquitina. (D) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 viene estratto dalla membrana ER e degradata dal proteasoma, alleviando translocon ostruzione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Cycloheximide Chase seguita da Western Blotting Indica che CUE1 è necessario per efficiente Degradazione Deg1 -Sec62. Cellule (A) lievito dei genotipi indicate sono state trasformate con un lievito centromerica plasmide codifica Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AMPR / URA3 43) e sottoposti ad analisi cycloheximide caccia. Proteinas da ogni punto di tempo (pari a 0,125 OD 600 unità) sono stati separati su un gel SDS-PAGE 8% e rilevata mediante western blotting con anticorpi secondari coniglio anti-topo, che si legano direttamente il C-terminale della proteina A epitopi della Deg1 - Sec62 proteina di fusione. Come controllo di carico, la membrana è stata poi incubata con anticorpi specifici per PGK1. Questo esperimento è stato replicato per tre volte; risultati rappresentativi sono raffigurati. (B) Quantificazione di dati in (A) è stata effettuata utilizzando il software di imaging (vedi Tabella dei Materiali). L'intensità di fluorescenza totale di una zona che comprende la proteina Deg1 -Sec62 è stata determinata per ciascun campione. Intensità di fluorescenza di sfondo per ogni campione è stato estrapolato dalla intensità media di fluorescenza di pixel vicino proteina Deg1 -Sec62. Questa intensità di fluorescenza di fondo estrapolato è stata sottratta dalla intensità totale di fluorescenza a cedere fl rettificatointensità za per ogni campione. quantificazioni simili per totale, di sfondo, e intensità di fluorescenza aggiustati sono stati eseguiti per PGK1, una proteina di controllo di carico la cui abbondanza non varia nelle condizioni analizzati. Per confrontare l'abbondanza di proteine ​​Deg1 -Sec62 tra campioni, un rapporto delle intensità segnale regolato di Deg1 -Sec62 a PGK1 è stata determinata per ogni campione. Il rapporto Deg1 -Sec62 / PGK1 stato definito come 100% per il primo punto di tempo (cioè, subito dopo l'aggiunta cicloesimide) per ogni ceppo in analisi. La quantità di Deg1 -Sec62 rimanendo in momenti successivi (ad esempio, i rapporti Deg1 -Sec62 / PGK1) è stata calcolata come percentuale del rapporto Deg1 -Sec62 / PGK1 al primo punto di volta. Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.

Definito sintetico (SD) Minimal medio Lievito 2% di destrosio, 0,67% base di azoto lievito senza aminoacidi, 0,002% adenina, 0,004% uracile, 0,002% arginina, 0,001% istidina, 0,006% isoleucina, 0,006% leucina, 0,004% lisina, 0,001% metionina, 0,006% fenilalanina, 0.005 % treonina, triptofano 0,004%. Per (piatto) terreno solido, comprendono 2% agar. 1. Terreno selettivo è preparato omettendo appropriato acido amino (s) o basi azotate.
2. Per comodità, questi ingredienti possono essere mantenuti come soluzioni di riserva concentrate come segue. Gli aminoacidi possono essere mantenute come soluzione 100x madre contenente tutti gli amminoacidi desiderati. Lievito base di azoto può essere mantenuto in una soluzione di 20x magazzino (13,4%). Destrosio può essere tenuto in una soluzione madre 40%. Adenina e uracile possono essere mantenute come soluzioni madre 1% a 0,1 M NaOH.
3.Sterilizzare media in autoclave.
Yeast Extract-Peptone destrosio (YPD) Rich Media Lievito 1% estratto di lievito, 2% peptone, 2% di destrosio (opzionale: 0.002% adenina). Per (piatto) terreno solido, comprendono 2% agar. 1. Per evitare la crescita lenta e colorazione rossa caratteristica di particolari ceppi di laboratorio di lievito in assenza (o bassa abbondanza) di adenina, adenina può essere aggiunto al terreno di coltura YPD.
2. Per comodità, alcuni ingredienti possono essere mantenuti come soluzioni di riserva concentrate come segue. Destrosio può essere tenuto in una soluzione madre 40%. Adenina può essere mantenuto come una soluzione madre 1% a 0,1 M NaOH.
3. Sterilizzare media in autoclave.
20x stop Mix 200 MM azide di sodio, 5 mg / ml di albumina sierica bovina La sodio azide è tossica tramite ingestione o contatto dermico. seguire produttoreraccomandazioni per la preparazione, la conservazione, la gestione e sodio azide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore.
20 mg / ml Cycloheximide 1. Preparare in etanolo. Conservare a -20 ° C.
2. Cicloeximide è un irritante cutaneo ed è tossico tramite l'ingestione orale. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e cicloesimide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore.
0,2 M di idrossido di sodio Preparare in acqua. idrossido di sodio reagisce con vetro. Pertanto, per la conservazione a lungo termine, 0,2 M di idrossido di sodio deve essere mantenuta in contenitori di plastica.
Sample Buffer Laemmli 2% SDS, 10% glicerolo, 5% &# 946; -mercaptoetanolo, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% blu di bromofenolo 1. Sample Buffer Laemmli viene spesso preparata diluendo uno stock più concentrato (ad esempio, 5x).
2. Il blu di bromofenolo colorante può essere aggiunto intensità desiderata. A "pizzicare" (quantità molto piccola sfruttato dal bordo di una spatola) è tipicamente sufficiente.
Laemmli tampone di corsa (5x) 125 mM Tris, 960 mM glicina, 0,5% SDS Per preparare 1 L di 1x Laemmli tampone di corsa, diluire 1: 5 in DH 2 O.
Tris acetato-SDS Transfer Buffer (5x) 125 mM Tris acetato (pH 8.8), 960 mm glicina, 0,05% SDS Per preparare 20 L di 1x Tris acetato-SDS Trasferire Buffer, unire 4 L di 5x magazzino, 4 L di metanolo, e 12 L di dH 2 O.
10X Tris-Buffered Saline (TBS) 500 mm Tris, 1,5 M di NaCl; pH regolato a 7,5 Per preparare 1 L di 1x TBS, diluire 1:10 in dH 2 O. 1x TBS può essere completata con il detergente Tween-20 e il latte scremato in polvere, a seconda dei casi.

Tabella 1. Le soluzioni utilizzate in questo studio.

Strain Nome Alias genotipo rilevanti Riferimenti
VJY42 MHY501 MATα Chen et al., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2
VJY47 YWO55; MHY507 MATα Jungmann et al., 1993; Rubenstein et al. 2012
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATα Biederer et al., 1997; Ravid et al., 2006
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATα Questo studio
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
GAL2
hrd1Δ :: kanMX4

Tabella 2. lievito ceppi utilizzati in questo studio. Tutti i ceppi sono congenic con MHY500 53. VJY42, VJY47, e VJY56 sono stati descritti in precedenza 49,53,54. Una generazione dettagliata ceppo e la strategia per la conferma VJY172 (preparato per questo studio) è disponibile su richiesta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In questo documento, un metodo per analizzare la cinetica di degradazione delle proteine ​​è presentato. Questa tecnica può essere facilmente applicata ad una gamma di proteine ​​degradate da una varietà di meccanismi. È importante notare che gli esperimenti cicloesimide chase riferire sulla cinetica di degradazione del pool stato stazionario di una data proteina. Altre tecniche possono essere utilizzate per analizzare la cinetica di degradazione di specifiche popolazioni di proteine. Ad esempio, il destino di degradazione di polipeptidi nascenti possono essere monitorati con l'analisi degli impulsi chase 55. In tali esperimenti, proteine ​​nascenti sono brevemente pulse-marcato (ad esempio, con aminoacidi radioattivi). Le variazioni di abbondanza di proteine ​​nascenti marcate (che può o non può rispecchiare cambiamenti nella costante abbondanza di proteine ​​di stato) possono essere seguiti nel tempo.

Chase Cicloeximide è adatto per analizzare la stabilità della proteina su un corso di tempo relativamente breve (ad esempio, fino a due ore). Nel corso più lungo tempo cOurses (cioè, due ore o giorni), cicloesimide, un inibitore globale della traduzione, è tossico per le cellule, probabilmente a causa del depauperamento di ubiquitina 56. Inoltre, le analisi di stabilità della proteina sopra andamenti temporali più lunghi sono più probabilità di essere compromessa da effetti indiretti della sintesi proteica alterata globalmente sulla degradazione della proteina di interesse (ad esempio, la degradazione di un breve proteina coinvolta nella degradazione della proteina di interesse). Altre tecniche, come ad esempio impulso chase esperimenti marcatura metabolica, sono quindi più adatti per lo studio della degradazione delle proteine ​​longevi e possono essere svolte per corroborare i risultati ottenuti negli esperimenti cicloesimide Chase.

I tempi di aggiunta di cicloesimide e la raccolta di cellule è una considerazione importante in questa procedura. La precisione è particolarmente importante per l'analisi delle proteine ​​molto breve durata, come piccole deviazioni del tempo trascorso dalla cicloesimide addizione per la raccolta delle cellule può avere un impatto significativo sulla cinetica di degradazione apparenti. Inoltre, senza un chiaro piano per l'esecuzione di questi passaggi time-sensitive, un esperimento può rapidamente devolvere in caos e frustrazione. Per questo motivo, si consiglia di aggiungere cycloheximide alle culture a intervalli regolari programmati,. intervalli di 30 sec vengono suggeriti in questo protocollo, ma i tempi possono essere regolati in base al livello di comfort e la destrezza del ricercatore. gli investigatori del debuttante possono trovare utile scrivere un programma dei tempi di incasso campione prima di iniziare l'esperimento e di attraversare fuori di ogni collezione in programma, come si verifica.

Nei passaggi 1.7 e 1.8 del protocollo qui descritto, colture cellulari di lievito sono concentrate in ridotti volumi di mezzo di crescita per facilità di manipolazione durante la successiva procedura di cicloesimide chase. Tuttavia, la centrifugazione di cellule di lievito induce rapidamente alcune risposte allo stress cellulare (ad esempio, percorsi di segnalazione chesono attivati ​​da deprivazione di glucosio) 57,58. Gli investigatori sono quindi in guardia contro lunghi periodi di centrifugazione. Quando si analizza la stabilità delle proteine ​​che possono essere sensibili a centrifugazione, gli investigatori possono voler aggiungere cycloheximide direttamente alle culture di fase metà di registro senza previa centrifugazione. In tali casi, cycloheximide deve essere aggiunto alla stessa concentrazione finale (250 mcg / ml), e campioni di cellule di lievito può essere raccolto da metodologie che non richiedono una fase di centrifugazione iniziale (ad esempio, filtrazione rapida) 57. Inoltre, nei passaggi 2,3-2,5, campioni raccolti in ogni punto vengono trasferiti ad una soluzione contenente sodio azide e immessi sul ghiaccio. Queste condizioni inibiscono continuato degradazione delle proteine ​​per la durata della caccia. Va notato che azide riduce la concentrazione cellulare di ATP 59, così in particolare l'inibizione della proteasi ATP-dipendente. Mentre temperatura ridotta dovrebbe unLSO ridurre il tasso al quale non ATP-dipendente proteolitici funzione processi, gli investigatori studiano proteine ​​degradate da tali meccanismi possono inoltre scegliere di snap-freeze pellet cellulari in azoto liquido ciascun campione viene raccolto.

Un protocollo di esempio per la lisi cellulare e un protocollo rappresentante per western blotting inclusi in questo manoscritto sono stati adattati da precedenti rapporti di 16,40. Nel metodo di lisi post-alcalina descritto qui, NaOH pretrattamento migliora estrazione delle proteine ​​di lievito alla successiva aggiunta di tampone campione Laemmli. Il meccanismo con cui si verifica questo miglioramento è poco caratterizzata 40. Tuttavia, polisaccaridi come quelli presenti nelle pareti cellulari di lievito vengono solubilizzati in condizioni alcaline 60. È quindi tentati di ipotizzare che l'incubazione in presenza di NaOH parzialmente o completamente sferoplasti cellule di lievito (cioè, rimuove componenti della parete cellulare), rendendoli più sensitive alla SDS detergente presente nel tampone campione Laemmli. Poiché le proteine ​​sono rilasciate in condizioni altamente denaturanti, inibitori della proteasi non devono essere inclusi nel tampone Laemmli. Il metodo specifico di lisi cellulare può essere modificato come appropriato per un dato esperimento. Ad esempio, il metodo di lisi post-alcalina può non essere adatto per le proteine ​​a bassa abbondanza o proteine ​​che sono mal rilevati mediante western blot. In tali casi, metodi che includono una fase di precipitazione di acido tricloroacetico concentrare campioni di proteine ​​può essere più appropriato 61. Inoltre, alcune considerazioni importanti per quanto riguarda la selezione di anticorpi, il caricamento di scelta, controllo e mezzi alternativi di rilevazione (ad esempio, chemiluminescente western blotting utilizzando sistemi di film o di immagini digitali) sono stati recentemente discusso 16. Quantificazione dell'abbondanza proteine ​​dopo il trattamento cycloheximide può essere eseguita. Molti sistemi di imaging sono venduti con i pacchetti software che facilitanoquesta analisi.

Cicloeximide chase può essere implementato per analizzare il degrado di una varietà di proteine ​​di lievito e può essere adattato per studiare la stabilità della proteina in altre cellule eucariotiche. Come descritto in questo protocollo, il trattamento cycloheximide è seguito da lisi cellulare e la rilevazione di abbondanza di proteine ​​mediante analisi Western Blot. A seconda dell'applicazione, tuttavia, abbondanza proteina dopo il trattamento cycloheximide può essere definita mediante una serie di tecniche appropriate per obiettivi di ricerca. Ad esempio, se la dimensione delle proteine ​​non è un fattore rilevante per l'analisi, lisati cellulari possono essere sottoposti a Dot Blot o l'analisi enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), che riportano in abbondanza di proteine, ma non apparente peso molecolare 62. Per le proteine ​​sulla superficie cellulare (o fluorescente interna tagged proteine ​​interne), citometria a flusso può essere utilizzato per quantificare la proteina abbondanza di campioni in tempi diversi dopo cycloheximide Oltre 51. fluorescence microscopia trattamento seguente cycloheximide fornirebbe informazioni sia abbondanza di proteine ​​e localizzazione 18. La gamma di substrati, gli organismi e le applicazioni a valle suscettibili di cycloheximide inseguimento rende la tecnica un mezzo altamente versatile e informativi di studio degradazione delle proteine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Biochimica Numero 110, Il lievito i mutanti il degrado del reticolo endoplasmatico-associati la degradazione delle proteine cycloheximide caccia translocon sistema ubiquitina-proteasoma
Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter