Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Циклогексимид Chase Анализ белка Деградация в Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Регулирование белкового изобилия имеет решающее значение для практически во всех клеточных процессов. Белок обилие отражает интеграцию темпов синтеза белка и деградации белка. Многие анализы отчетов о белка изобилии (например, одноразовая точка западной блоттинга, проточной цитометрии, флуоресцентной микроскопии, или репортер анализов на основе роста) не допускают дискриминации относительных последствий перевода и протеолиза на уровне белка. В данной статье описывается использование циклогексимид погони с последующим вестерн - блоттинга , чтобы конкретно проанализировать деградацию белков в модели одноклеточных эукариот, Saccharomyces CEREVISIAE (почкованием дрожжи). В этой процедуре, дрожжевые клетки инкубируют в присутствии ингибитора поступательные циклогексемида. Аликвоты клеток собирают сразу после того, как и в определенные моменты времени после добавления циклогексемида. Клетки лизируют и лизаты разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле FOг вестерн-блот анализ белка обилии в каждый момент времени. Процедура циклогексимид Чейза позволяет визуализировать кинетику разложения устойчивого состояния популяции различных клеточных белков. Эта процедура может быть использована для изучения генетических требований к и влияния окружающей среды на деградацию белка.

Introduction

Белки выполняют важные функции практически во всех клеточных процессов. Многие физиологические процессы требуют присутствия определенного белка (или протеинов) в течение определенного периода времени или при определенных обстоятельствах. Поэтому Организмы контролировать и регулировать белковый изобилие для удовлетворения потребностей клеточных 1. Например, циклины (белки, контролирующие деление клеток) присутствуют в определенных фазах клеточного цикла, а потеря регулируемых уровней циклин было связано с образованием злокачественных опухолей 2. В дополнение к регулированию уровня белка для удовлетворения потребностей клеточные, клетки используют деградационных механизмов контроля качества , чтобы устранить неправильно упакованные, несобранные или иным образом отклоняющиеся белковые молекулы 3. Контроль белка изобилии включает в себя регулирование как синтеза макромолекул (транскрипции и трансляции) и деградации (распада РНК и протеолиз). Нарушение или чрезмерная деградация белков способствует множественных патологий, В том числе рак, кистозный фиброз, нейродегенеративных состояний, а также сердечно - сосудистые расстройства 4-8. Поэтому Протеолитические механизмы представляют собой перспективные терапевтические мишени для целого ряда заболеваний , 9-12.

Анализ белков в одной точке времени (например, с помощью Вестерн - блоттинга 13, проточной цитометрии 14 или флуоресцентной микроскопии 15) обеспечивает снимок устойчивого состояния белка изобилии , не раскрывая относительный вклад синтеза или деградации. Кроме того , на основе роста репортер анализы отражают устойчивые уровни белка в течение длительного периода времени , не различая между влияний синтеза и деградации 15-20. Можно сделать вывод о вкладе дегенеративных процессов до уровня устойчивого состояния белка путем сравнения численности до и после ингибирования конкретных компонентов механизма деструктивных (например, фармакологически инактивировать PROTEasome 21 или выбивания ген гипотетически необходимы для деградации 13). Изменение состояния стационарных уровней белка после ингибирования разрушающих путей обеспечивает убедительные доказательства для вклада протеолиза к контролю белка изобилия 13. Тем не менее, такой анализ до сих пор не предоставляет информацию о кинетике оборота белка. Циклогексимид погоня с последующим вестерн - блоттинга преодолевает эти недостатки, позволяя исследователям визуализировать деградации белка с течением времени 22-24. Кроме того, поскольку обнаружение белка следующие циклогексимид погони , как правило , осуществляется с помощью Вестерн - блоттинга, радиоактивные изотопы и длительные шаги иммунопреципитационных не требуются для циклогексимид погони, в отличие от многих часто используемых методов чейз импульсов, которые также выполняются для визуализации деградации белка 25.

Циклогексимид впервые был идентифицирован как соединение с противогрибковым собственногалстуки , произведенные грамположительной бактерии Streptomyces пзеиз 26,27. Это является клетка-проницаемой молекулу , которая специфически ингибирует эукариотической цитозольная (но не органелл) перевод, ослабляя рибосом транслокацию 28-31. В циклогексимид чейза эксперименте, циклогексимид добавляют к клеткам, и аликвоты клеток собирают сразу и в определенные моменты времени после добавления соединения 22. Клетки лизируют, и белок обилие в каждый момент времени анализируют, как правило, с помощью вестерн-блоттинга. Снижение белка обилии после добавления циклогексемида можно с уверенностью отнести к деградации белка. Нестабильным белком, будет уменьшаться в изобилии в течение долгого времени, в то время как относительно стабильный белок будет демонстрировать небольшие изменения в изобилии.

Механизмы селективной деградации белков были высоко консервативны на протяжении Eukarya. Многое из того, что известно о деградации белков был впервые узнал вмодель одноклеточные эукариоты, Saccharomyces CEREVISIAE (почкованием дрожжи) 25,32-36. Исследования с использованием дрожжей, вероятно, продолжать предоставлять новые и важные идеи в деградации белков. Способ циклогексимид погонях в клетках дрожжей с последующим вестерн-блот-анализ белков изобилии здесь представлены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Рост и урожай дрожжевых клеток

  1. Если не анализируя кинетики деградации эндогенного дрожжевого белка, превратить желаемый штамм дрожжей (ы) с помощью плазмиды, кодирующей белок, представляющий интерес. Надежные способы трансформации дрожжей были описаны ранее 37.
  2. Инокулируйте дрожжей в 5 мл соответствующей среды (например, селективный синтетический определен (SD) , средство для поддержания плазмиды трансформированных клеток или неселективный дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) питательную среду для нетрансформированных клеток). Инкубируют в течение ночи при 30 ° C, вращение.
    Примечание: 30 ° С является оптимальной температурой роста для типичной дикого типа лабораторные штаммы дрожжей 38. Тем не менее, поскольку некоторые мутантные штаммы дрожжей не растут оптимально при температуре 30 ° С , и некоторые белки подвергаются деградации в зависимости от температуры, температуры , используемые для роста дрожжевых клеток и циклогексимид охоты должны быть определены эмпирически 39.
  3. Мера-ее оптическую плотность при длине волны 600 нм (OD 600) каждой ночной культуры.
    Примечание: Ячейки могут быть в логарифмической или стационарной фазе роста , но должна быть минимально достигнута плотность , которая позволит разбавление до OD 600 = 0,2 в 15 мл свежей среды.
  4. Развести в течение ночи культуры к OD 600 стоимостью 0,2 в 15 мл свежей среды.
  5. Выдержите дрожжей при температуре 30 ° С, встряхивая , пока клетки не достигают середины логарифмической фазы роста (т.е. OD 600 от 0,8 до 1,2).
  6. Во время роста дрожжевых клеток, выполните следующие действия в рамках подготовки к процедуре циклогексимид погоня:
    1. Установить нагревательный блок, способный вместить 15 мл конические пробирки до 30 ° С для инкубации клеток в присутствии циклогексемида. Добавьте воду в лунки теплового блока, чтобы обеспечить эффективное распределение тепла к культурам. Добавьте воду в каждую лунку таким образом, что 15 мл коническую трубку заставит уровень воды подняться, но не переполнить, губы скважины,
    2. Установите второй нагревательный блок, способный вместить 1,5 мл микроцентрифужных пробирок до 95 ° С для денатурации белков следующие лизиса клеток.
    3. Предварительно теплый свежий ростовую среду (1,1 мл на временную точку на культуру, чтобы быть проанализирован) до 30 ° С.
    4. Добавить 50 мкл 20x Stop Mix предварительно меченных микроцентрифужных трубки (одна трубка в момент времени в культуре, которые будут проанализированы). Поместите пробирки на лед.
      ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: азид натрия, ингредиент в 20х Stop Mix, токсичен при оральном приеме внутрь или попадании на кожу. Следуйте рекомендациям производителя при подготовке, хранении и обработке азид натрия. В случае случайного контакта, обратитесь паспорт безопасности, предусмотренные изготовителем.
  7. Когда клетки достигли середины-логарифмического роста, собирают 2,5 OD 600 единиц каждой культуры в момент времени , чтобы быть проанализирован (например, 7,5 OD 600 единиц для анализа белка изобилие в трех временных точках). Центрифуга клетки собирали в 15 мл конические пробирки на 3,000 XG при комнатной температуре в течение 2 мин.
    Примечание: Один OD 600 единица равна количеству дрожжей , присутствующих в 1 мл культуры при OD 600 1,0. Объем культуры (в мл) , необходимого для сбора X OD 600 единиц (V) может быть определена с помощью следующего уравнения: V = X OD 600 единиц / Измеренные OD 600. Например, чтобы собрать 7,5 OD 600 единиц культуры дрожжевых клеток при OD 600 1,0, собирают 7,5 OD 600 единиц / 1,0 = 7,5 мл культуры дрожжей.
  8. Ресуспендируют каждый осадок клеток в 1 мл 30 ° C (предварительно нагретом) свежей среды , прирост в 2,5 OD 600 единиц клеток (например, 3 мл 7,5 OD 600 единиц).

2. Циклогексимид Chase

  1. Равновесие дрожжей клеточные суспензии путем инкубации в течение 5 мин в С теплом блоке 30 °.
  2. Подготовьте таймер для подсчета от 0:00.
  3. Для того, чтобы начать циклогексемида погоню, нажмите кнопку "Пуск" на таймер. Стремительно,но осторожно, выполните следующие действия:
    1. Добавить циклогексимид до конечной концентрации 250 мкг / мл к суспензии клеток дрожжей первого (например, добавьте 37,5 мкл 20 мг / мл циклогексимид запаса до 3 мл клеточной суспензии), и вихрь коротко перемешать.
      ВНИМАНИЕ: Циклогексимид является раздражителем кожных покровов и является токсичным при оральном приеме внутрь. Следуйте рекомендациям производителя при подготовке, хранении и обработке циклогексимид. В случае случайного контакта, обратитесь паспорт безопасности, предусмотренные изготовителем.
    2. Сразу же после добавления циклогексимид и встряхивания передача 950 мкл раствора (~ 2,4 OD 600 единиц) суспензии клеток дрожжей с добавлением циклогексемида к предварительно меченных микроцентрифужных пробирку , содержащую 50 мкл ледяной 20x стоп - смеси. Vortex микроцентрифужных трубки и место на льду до тех пор, пока не будут собраны все образцы.
    3. Возвращение суспензии дрожжевых клеток до 30 ° С.
  4. Повторите шаги 2.3.1 через 2.3.3 Для каждого из оставшихся суспензий дрожжевых клеток через равные промежутки времени (например, таким образом, что циклогексимид добавляется каждые 30 сек, к образцу # 1 в 0:00, образец № 2 в 0:30, образец № 3 в 1:00 и др.).
  5. На каждом последующем момент времени, вихревая дрожжевых клеток суспензии и передачи 950 мкл до меченых микроцентрифужных пробирки, содержащие 50 мкл предварительно охлажденное 20x Stop Mix. Vortex и место собирают клетки на льду. Возвращение 15 мл конические пробирки до 30 ° тепла блока C.
    1. Например, для сбора клеток через 30 мин после добавления циклогексимид (предполагается, что до 30 секунд интервалы между циклогексимид дополнение к дрожжам клеточных суспензий в начале хода времени), вихря и удалить 950 мкл суспензии клеток из образца № 1 в 30:00 , Повторите эти действия для образца № 2 в 30:30, и так далее.
      Примечание: Для того, чтобы предотвратить осаждение дрожжей, суспензий вихревых клеток в 15 мл конические пробирки примерно каждые 5 мин в течение всего курса погони. В качестве альтернативы, дрожжевой суспензии клетокs может поддерживаться в ванне непрерывно перемешивающей воды в течение всего срока эксперимента циклогексимид погоня.
  6. Когда все образцы были собраны, осадок собирали клетки центрифугированием при 6500 х г при комнатной температуре в течение 30 сек. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации. Клетки теперь готовы к щелочного лизиса. В качестве альтернативы, оснастке замораживающих осажденные клетки в жидком азоте и хранят при -80 ° С.

3. Пост-щелочной экстракции белка (модифицированный из 16,40)

  1. Добавляют 100 мкл дистиллированной воды в каждую осадку клеток. Ресуспендируют пипетированием вверх и вниз или встряхиванием.
  2. Добавьте 100 мкл 0,2 М NaOH для каждого образца. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз или встряхиванием.
  3. Выдержите суспендированные клетки при комнатной температуре в течение 5 мин. На этой стадии, клетки дрожжей не были лизированы, и белки , которые не были освобождены 40.
  4. Гранул клетки центрифугированием при 18000 мкг при комнатной нравратуре в течение 30 сек. Удалить супернатант с помощью пипетки или аспирации.
  5. Для того, чтобы лизировать клетки, добавляют 100 мкл буфера для образца Лэммли к каждому осадку клеток. Ресуспендируют пипетированием вверх и вниз или встряхиванием.
    Примечание: Последовательное инкубации клеток с NaOH и Лэммли высвобождает буфера выборок белков в форме, совместимой с додецилсульфатом натрия-электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с использованием трис-глицин системы рабочего буфера.
  6. Инкубируют при 95 ° С в течение 5 мин, чтобы полностью денатурировать белки.
    Примечание: инкубация при 95 ° C не могут быть пригодны для анализа белков, которые склонны к агрегации (например, белки с несколькими трансмембранных сегментов). Эти белки могут стать нерастворимыми при инкубации при повышенных температурах 41. Таким образом, для анализа таких белков, лизаты следует инкубировать при более низких температурах (например, 37 ° С - 70 ° С) в течение 10 - 30 мин, а определено эмпирически.
  7. Центрифуга лизаты на 18,000 XG в ротемпература ом в течение 1 мин для осаждения нерастворимого материала. Жидкость над осадком (растворенную извлеченный протеин) готов к разделению с помощью SDS-PAGE и последующим вестерн-блот анализ. В качестве альтернативы, хранить лизатов при -20 ° С.

4. Представитель SDS-PAGE и Вестерн - блоттинг Процедура (адаптировано из 16)

  1. Нагрузка белка стандарты молекулярной массы и определены эмпирически объем лизата на геле SDS-PAGE.
    Примечание: Выберите процентное содержание акриламида и бис-акриламида в геле SDS-PAGE, основанный на молекулярной массе белка, представляющего интерес. В целом, более низкий процент гели лучше подходят для решения более высоких белков молекулярной массой.
  2. Запуск гель при 200 V, пока фронт красителя достиг нижнего края геля.
  3. Перенос белков из геля на поливинилиденфторида (PVDF) мембрану путем мокрого переноса при 20 В в течение 60 - 90 мин при температуре 4 ° С.
  4. Блок мембраны путем инкубирования в Трис-солевом буфере (ТБS), содержащий 5% обезжиренное молоко, качалки, при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4 ° С в течение ночи.
    Примечание: Для предотвращения роста микроорганизмов в присутствии мембраны инкубировали в течение ночи, рекомендуется включать азид натрия в блокирующем растворе до конечной концентрации 0,02%.
  5. Инкубируйте мембраны с первичным антителом, специфическим для белка, представляющего интерес в TBS с 0,1% твина-20 (TBS / T) и 1% обезжиренным молоком, раскачивание при комнатной температуре в течение 1 часа.
  6. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  7. Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора конъюгированных с вторичными антителами в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
    Примечание: флуорофоры светочувствительные. Поэтому разведений антител , конъюгированных с флуорофоров должны быть подготовлены в темноте, и инкубация мембран в присутствии антител , конъюгированных с флуорофоров и последующих стадий промывки должно происходить в светонепроницаемой (например, обернутого фольгой) соntainers.
  8. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  9. Изображение мембраны с помощью LI-COR Odyssey CLX и Image Studio программное обеспечение (или сравнимой оборудования обработки изображений и программного обеспечения), в соответствии с рекомендациями производителя.
  10. После получения мембранного изображения, инкубирование мембраны с первичным антителом, специфичным для контрольного белка нагрузки в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
  11. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  12. Инкубируйте мембраны с соответствующим флуорофора конъюгированных с вторичными антителами в TBS / T 1% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 ч, качалки.
  13. Промыть мембрану при комнатной температуре 3 х 5 мин с TBS / T, качалки.
  14. Изображение мембраны как на этапе 4.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для иллюстрации методики погоня циклогексемида, стабильность Deg1 -Sec62 (рис 1), -associated деградация (ERAD) субстрат модель дрожжевого эндоплазматической сети (ER), анализировали 42-44. В ERAD, контроль качества убиквитинлигазы ферменты ковалентно присоединять цепи небольшого белка убиквитина к аберрантных белков, локализованных на ER мембране. Такие polyubiquitylated белки затем удаляются из ER и деградирует с помощью протеасомы, большой, цитозольной протеазы 45. Белок Deg1 -Sec62 нацелен на деградацию после того, как он настойчиво и аберрантно входит в зацепление с транслокон, канал , который способствует транслокации белка в ER просвет или мембраны 43. Точно так же, аполипопротеина B у млекопитающих, белковый компонент липопротеинов низкой плотности, настойчиво входит в зацепление с ER транслокон, а затем подвергается деградации с помощью соответствующего механизма, когда его губыИдентификация партнеров связывания отсутствуют 46-48. Таким образом, анализ деградации Deg1 -Sec62 в клетках дрожжей может дать представление о деградации белков , которые постоянно или аберрантно занимаются транслокона, условно называют ERAD-T (для транслокон-ассоциированных) подложки 43.

Предыдущие исследования показали , что ER-резидент убиквитинлигазы Hrd1 функции с убиквитин-конъюгации фермента Ubc7 катализировать деградацию Deg1 -Sec62 16,42-44. Трансмембранный белок Cue1 анкеры Ubc7 к ER мембране и активирует фермент 49-51. Тем не менее, потребность в Cue1 в деградации Deg1 -Sec62 непосредственно не исследована. Чтобы проверить гипотезу о том, что Cue1, как Hrd1 и Ubc7, необходим для эффективной деградации Deg1 -Sec62, дикого типа и мутантные клетки дрожжей экспрессирующих Deg1 -Sec62 были подвергнуты циклогексимид погони и Уэскрачка - блот - анализ (рис 2А). Белок Deg1 -Sec62 мигрирует на SDS-PAGE в виде нескольких видов. Это согласуется с более ранними исследованиями , указывающими обширный пост-трансляционной модификации белков 43,44,52. В клетках дрожжей дикого типа, Deg1 -Sec62 был легко деградирует. Как было отмечено ранее, потеря либо Hrd1 или Ubc7 существенно стабилизировали белок Deg1 -Sec62 42-44. Как и предсказывалось, Deg1 -Sec62 стабилизировали при отсутствии Cue1 (в такой же степени , как и в случае отсутствия Ubc7), что подтверждает роль для Ubc7-взаимодействующего белка в ERAD-T.

Доля Deg1 -Sec62 белка остающегося в каждый момент времени количественно и показана на рисунке 2B. Отметим , что видимая скорость исчезновения Deg1 -Sec62 в клетках дикого типа может быть недооценка скорости деградации зарождающейся Deg1 -Sec62(То есть, белок в период полураспада, который может быть самым непосредственным образом определяется с помощью анализа импульсов погоня 43). Поскольку дрожжи дикого типа , активно деградируют белок Deg1 -Sec62 до начала циклогексимид Кроме того, устойчивое состояние обилие Deg1 -Sec62 существенно уменьшается в этих клетках ( по сравнению с клетками , в которых нарушается деградация). Это может быть оценено путем сравнения обилие Deg1 -Sec62 на начальных моментов времени для каждого штамма на рисунке 2А. Кроме того, любая деградация резистентных субпопуляции белка - субстрата (например, если белок накапливается в внутриклеточных пулов , из которых предотвращается деградация) может показаться относительно стабильным в клетках дикого типа в течение времени хода эксперимента.

Рисунок 1
Рисунок 1. Модель Деградация Deg1 -Sec62 Следующие аберрантных вовлечение транслокона (A) схематичное изображение Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 состоит из следующих элементов, в следующей последовательности:.. Deg1 (Аминоконцевая 67 аминокислот из дрожжей транскрипционный репрессор MATα2), флаг (F) , эпитоп, 2-трансмембранный белок Sec62, и две копии белка а золотистого стафилококка (АРП). (в) в соответствии с нормальным со-поступательным вставки его двух трансмембранных сегментов в мембрану эндоплазматического ретикулума (ER), стойкие ассоциации из Deg1 -Sec62 с транслокона вызывает аномальный, Deg1 -зависимую, посттрансляционный взаимодействие транслокона. Часть цитозольной амино - конца аберрантно входит-и , вероятно , остается в пределах-транслокона. (С) После зацепления транслоконе, убиквитин - лигазы Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 помогает убиквитин-конъюгации фермента UBC7, который закреплен в ER мембране Cue1. Ub, убиквитин белковые мономеры. (D) убиквитилируются Deg1 -Sec62 извлекается из ER мембраны и разлагаются протеасоме, освободив транслокона обструкции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Циклогексимид Chase с последующим Вестерн - блоттинга Указывает , что Cue1 необходим для эффективной Deg1 -Sec62 Деградация. (A) дрожжевых клеток указанных генотипов трансформируют дрожжевой центромерной плазмидой , кодирующей Deg1 -Sec62 (pRS416-P МЕТ25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) и подвергали анализу циклогексимид Чейзом. белкас от каждой временной точки (эквивалентно 0,125 OD 600 единиц) были разделены на 8% геле с SDS-PAGE и детектируется Вестерн - блоттинга с кроличьей анти-мышиных вторичными антителами, которые непосредственно связываются с С-концевой эпитопы протеина А к Deg1 - Sec62 слитый белок. В качестве контроля нагрузки, мембрану затем инкубировали с антителами, специфичными к PGK1. Этот эксперимент был воспроизведен в три раза; Представительные результаты изображены. (В) Количественное данных в (А) проводили с использованием программного обеспечения обработки изображений (см таблицу материалов). Суммарная интенсивность флуоресценции в области , охватывающей белка Deg1 -Sec62 определяли для каждого образца. Фоновая интенсивность флуоресценции для каждого образца путем экстраполяции средней интенсивности флуоресценции точек вблизи белка Deg1 -Sec62. Эта экстраполировать интенсивность фоновой флуоресценции вычитали из общей интенсивности флуоресценции с получением скорректированного fluorescИнтенсивность ENCE для каждого образца. Подобные количественными в целом, так и фона, скорректированных интенсивности флуоресценции были выполнены для PGK1, контроля загрузки белка, чья численность не меняется в условиях проведения анализа. Для того, чтобы сравнить обилие белка Deg1 -Sec62 среди образцов, отношение скорректированных интенсивностей сигналов от Deg1 -Sec62 до PGK1 определяли для каждого образца. Соотношение Deg1 -Sec62 / PGK1 была определена как 100% в первый момент времени (то есть, сразу после того, как циклогексимид дополнение) для каждого штамма при анализе. Количество Deg1 -Sec62 оставшиеся в последующих временных точках (т.е. отношения Deg1 -Sec62 / PGK1) рассчитывали как процент от соотношения Deg1 -Sec62 / PGK1 в первый момент времени. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

Синтетический Defined (SD) Минимальный средний Дрожжи 2% раствор декстрозы, 0.67% дрожжевого азотистого основания без аминокислот, 0,002% аденина, 0,004% урацил, 0,002% аргинина, 0,001% гистидина, 0,006% изолейцин, 0,006% лейцин, 0,004% лизина, 0,001% метионина, 0,006% фенилаланина, 0,005 % треонин, триптофан 0,004%. Для получения твердого вещества (пластины) среды, включают в себя 2% агара. 1. Селективное среду получают путем исключения соответствующую аминокислоту (ы) или азотистые основания.
2. Для удобства эти ингредиенты могут быть сохранены в виде концентрированных маточных растворов следующим образом. Аминокислоты могут быть сохранены в качестве 100x исходного раствора, содержащего все желаемые аминокислоты. азотистое основание дрожжей может поддерживаться в 20х маточный раствор (13,4%). Декстроза может поддерживаться в 40% маточного раствора. Аденина и урацила может сохраняться в качестве 1% маточных растворов в 0,1 М NaOH.
3.Стерилизовать среду автоклавированием.
Дрожжевой экстракт-пептон декстроза (YPD) Богатые дрожжевой среде 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% раствор декстрозы (Необязательно: 0,002% аденина). Для получения твердого вещества (пластины) среды, включают в себя 2% агара. 1. Для предотвращения медленного роста и красной окраски характеристики отдельных штаммов дрожжей Laboratory в отсутствие (или низкое содержание) аденина, аденин может быть добавлен в среду для выращивания YPD.
2. Для удобства некоторые ингредиенты могут быть сохранены в виде концентрированных маточных растворов следующим образом. Декстроза может поддерживаться в 40% маточного раствора. Аденин может сохраняться в качестве 1% -ного раствора в 0,1 М NaOH.
3. стерилизовать среду автоклавированием.
20x Stop Mix 200 мМ азида натрия, 5 мг / мл бычьего сывороточного альбумина Азид натрия токсичен при оральном приеме внутрь или попадании на кожу. Следуйте производителюРекомендации при подготовке, хранении и обработке азид натрия. В случае случайного контакта, обратитесь паспорт безопасности, предусмотренные изготовителем.
20 мг / мл Циклогексимид 1. Подготовьте в этаноле. Хранить при -20 ° C.
2. Циклогексимид является раздражителем кожных покровов и является токсичным при оральном приеме внутрь. Следуйте рекомендациям производителя при подготовке, хранении и обработке циклогексимид. В случае случайного контакта, обратитесь паспорт безопасности, предусмотренные изготовителем.
0,2 М раствор гидроксида натрия Готовят в воде. гидроксид натрия реагирует со стеклом. Поэтому для длительного хранения, 0,2 М гидроксида натрия следует поддерживать в пластиковых контейнерах.
Laemmli буфера для образца 2% ДСН, 10% глицерина, 5% &# 946; -mercaptoethanol, 60 мМ Трис-HCl рН 6,8, 0,008% бромфеноловый синий 1. образцового буфера Лэммли часто получают путем разбавления более концентрированной (например, 5x) запас.
2. Краситель голубой бромфениловый может быть добавлен к желаемой интенсивности. А "пинч" (очень небольшое количество сливают из края шпателем), как правило, достаточным.
Лэммли проточном буфере (5x) 125 мМ Трис, 960 мМ глицина, 0,5% SDS Для приготовления 1 л 1x Laemmli проточном буфере, разбавленные 1: 5 в дН 2 O.
Трис Ацетат-ДСН буфера переноса (5x) 125 мМ Трис-ацетата (рН 8,8), 960 мМ глицина, 0,05% ДСН Для приготовления 20 л 1x Трис винилацетат-SDS буфера переноса, скомбинировать 4 л 5x Шток, 4 л метанола и 12 л дН 2 O.
10x Трис-буферном солевом растворе , (ТБС) 500 мМ Трис, 1,5 М NaCl; рН доводили до 7,5 Для приготовления 1 л 1x TBS, развести в соотношении 1:10 в дН 2 O. 1x TBS может быть дополнена с моющим средством твин-20 и порошкообразного обезжиренного молока, в зависимости от обстоятельств.

Таблица 1. Решения , используемые в данном исследовании.

Штамм Имя кличка Соответствующие Генотип Рекомендации
VJY42 MHY501 MATα Чен и др., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATα Юнгманн и др . , 1993; Рубинштейн и др., 2012
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATα Biederer и др . , 1997; Ravid и др., 2006
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATα Эта учеба
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

Таблица 2. Штаммы дрожжей , используемые в данном исследовании. Все штаммы конгенных с MHY500 53. VJY42, VJY47 и VJY56 были описаны ранее 49,53,54. Детальное поколение штамма и стратегии подтверждения для VJY172 (подготовлено для данного исследования) предоставляется по запросу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной работе предложен метод анализа кинетики деградации белка представлена. Этот метод может быть легко применен к различным белкам, деградировавших различных механизмов. Важно отметить, что циклогексимид чейз-эксперименты сообщать о кинетике деградации устойчивого состояния пула данного белка. Другие методы могут быть использованы для анализа кинетики деградации специфических популяций белков. Например, разрушающих судьба растущими полипептидами можно отслеживать с помощью анализа импульсов чейза 55. В таких экспериментах, формирующиеся белки кратко широтно-меченый (например, с радиоактивными аминокислотами). Изменения в изобилии меченых формирующихся белков (которые могут или не могут зеркально изменения в стационарном состоянии белка изобилии) могут быть отслежены с течением времени.

Циклогексимид Чейза подходит для анализа стабильности белка в течение относительно короткого времени курс (т.е. до двух часов). Более продолжительный срок времени сourses (то есть, за два часа до нескольких дней), циклогексимид, глобальный ингибитор перевода, является токсичным для клеток, вероятно , из - за истощения убиквитина 56. Кроме того, анализ стабильности белка в течение более длительного времени курсов, более вероятно , будет поставлена ​​под угрозу путем косвенного воздействия на глобальном уровне нарушенного синтеза белка на деградацию белка , представляющего интерес (например, деградация короткоживущих белков , участвующих в деградации белка интерес). Другие методы, такие как пульс чейз экспериментов метаболические маркировки, поэтому лучше подходит для изучения деградации долгоживущих белков и могут быть выполнены, чтобы подтвердить результаты, полученные в опытах циклогексимид погонь.

Выбор времени добавления циклогексемида и сбора клеток является важным фактором в этой процедуре. Точность особенно важно при анализе очень короткоживущих белков, так как небольшие отклонения в то время, прошедшее от циклогексимид дополниции для сбора клеток может оказывать существенное влияние на очевидные кинетики деградации. Кроме того, без четкого плана для выполнения этих чувствительных ко времени действия, эксперимент может быстро переходить в состояние хаоса и разочарования. По этой причине рекомендуется добавлять циклогексимид к культурам по плановым, с регулярными интервалами. Интервалы 30 сек предлагаются в этом протоколе, но сроки могут быть скорректированы, чтобы соответствовать уровню комфорта и ловкость следователя. Начинающие исследователи могут счесть целесообразным написать график времени взятия пробы до начала эксперимента и вычеркивать каждую запланированную коллекцию, как это происходит.

На этапах 1.7 и 1.8 протокола, описанного здесь, дрожжи клеточные культуры сосредоточены в сокращенных объемов питательной среды для простоты манипуляций в ходе последующей процедуры циклогексимид чейза. Тем не менее, центрифугирование клеток дрожжей быстро вызывает определенные реакции клеточного стресса (например, сигнальных путей , которыеактивируются лишения глюкозы) 57,58. Исследователи поэтому предостерег от длительных периодов центрифугирования. При анализе стабильности белков, которые могут быть чувствительны к центрифугирование, исследователи могут пожелать добавить циклогексимид непосредственно к фазе культур середины логарифмического без предварительного центрифугирования. В таких случаях, циклогексимид должны быть добавлены к той же самой конечной концентрации (250 мкг / мл), и образцы дрожжевых клеток могут быть собраны с помощью методик , которые не требуют предварительной стадии центрифугирования (например, быстрая фильтрация) 57. Далее, на этапах 2.3 - 2.5, образцы, собранные в каждый момент времени передаются в раствор, содержащий азид натрия и помещают на лед. Эти условия тормозят продолжающейся деградации белка на время погони. Следует отметить , что азид снижает клеточную концентрацию АТФ 59, таким образом , специфически ингибирующее активность АТФ-зависимых протеаз. В то время как пониженная температура должен лиLSO уменьшить скорость, на которой не-АТФ-зависимой протеолитической функции процессов, исследователи, изучающие белки деградированных такими механизмами может в качестве альтернативы выбрать привязку замораживания клеток гранул в жидком азоте, как каждый образец собирают.

Протокол образец для лизиса клеток и репрезентативной протокола для вестерн - блоттинга , включенных в этой рукописи были взяты из предыдущих докладов 16,40. В пост-методом щелочного лизиса, описанной здесь, NaOH, предварительная обработка улучшает экстракцию белков у дрожжей при последующем добавлении Laemmli буфера для образцов. Механизм , посредством которого происходит это улучшение плохо характеризуется 40. Тем не менее, полисахариды , такие как те , что в клеточных стенок дрожжей растворимую в щелочных условиях 60. Поэтому заманчиво предположить , что инкубация в присутствии NaOH , частично или полностью сферопластах дрожжевых клеток (то есть, удаляет компоненты клеточной стенки), что делает их более SENSITIVе для моющего средства в настоящее время SDS буфера образца Лэммли. Поскольку белки высвобождаются при весьма денатурирующих условиях, ингибиторы протеазы, не должны быть включены в Laemmli буфера для образцов. Конкретный способ лизиса клеток может быть изменен в зависимости от обстоятельств для данного эксперимента. Например, после щелочного лизиса не могут быть пригодны для низкой численности белки или белки, которые плохо обнаруживаемых с помощью вестерн-блоттинга. В таких случаях, методы , которые включают трихлоруксусной кислоты стадии осаждения к концентрации образцов белка может быть наиболее подходящим 61. Кроме того, ряд важных соображений , касающихся выбора антител, выбор загрузки, управления и альтернативные средства обнаружения (например, хемилюминесцентный Вестерн - блоттинга с использованием пленки или цифровой системы визуализации) были недавно обсуждали 16. Количественное определение белка обилии следующий циклогексемида обработка может быть осуществлена. Многие системы визуализации продаются с программными пакетами, которые облегчаютэтот анализ.

Циклогексимид Чейза может быть реализован для анализа деградации множества белков у дрожжей и может быть адаптирован для изучения стабильности белка в других эукариотических клетках. Как описано в данном протоколе, циклогексимид лечение следует лизиса клеток и обнаружение обилии белка с помощью Вестерн-блот-анализа. В зависимости от применения, однако, белок обилие после обработки циклогексимид может быть оценена с помощью целого ряда методов, в случае необходимости для исследовательских целей. Например, если размер белка не является существенным фактором для анализа, клеточные лизаты могут быть подвергнуты дот - блот или иммуноферментный анализ (ELISA) , анализа связанный с ферментом, в которых сообщается о белковой избытке, но не кажущаяся молекулярная масса 62. Для белков на поверхности клетки (или внутренний флуоресцентно меченый внутренние белки), проточной цитометрии могут быть использованы для количественного определения белка обилие образцов в разные моменты времени после того, как циклогексимид дополнение 51. Fluoценция микроскопия лечение следующие циклогексимид предоставит информацию как обилие белка и локализации 18. Ассортимент субстратов, организмов и последующих применений поддающихся циклогексимид погоней делает технику очень универсальный и информативные средства изучения деградации белка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Биохимия выпуск 110, Почкованием дрожжи мутанты эндоплазматический ретикулум-ассоциированной деградации деградации белка циклогексемида погоню транслокон убиквитин-Протеасома системы
Циклогексимид Chase Анализ белка Деградация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter