Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Regulering van eiwit overvloed is cruciaal voor vrijwel elke cellulaire proces. Eiwitgehalte weerspiegelt de integratie van de snelheden van eiwitsynthese en eiwitafbraak. Veel assays rapportage over eiwit overvloed (bijvoorbeeld één tijdstip western blotting, flowcytometrie, fluorescentie microscopie, of-groei op basis reporter assays) geen discriminatie van de relatieve effecten van de vertaling en proteolyse op eiwitgehalten niet toestaan. Dit artikel beschrijft het gebruik van cycloheximide chase gevolgd door Western blotting om specifiek wat eiwitafbraak in het model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (gist). In deze procedure worden gistcellen geïncubeerd in aanwezigheid van de translationele remmer cycloheximide. Hoeveelheden van cellen onmiddellijk verzameld na en op specifieke tijdstippen na toevoeging van cycloheximide. Cellen worden gelyseerd en de lysaten worden gescheiden door polyacrylamidegelelektroforese for western blot analyse van eiwitten overvloed op elk tijdstip. De cycloheximide chase werkwijze maakt visualisatie van de afbraakkinetiek van de steady state populatie van verschillende cellulaire eiwitten. De procedure kan worden gebruikt om de genetische behoefte en omgevingsinvloeden op eiwitafbraak onderzoeken.

Introduction

Eiwitten uit te voeren cruciale functies in vrijwel elke cellulaire proces. Vele fysiologische processen vereisen de aanwezigheid van een specifiek eiwit (of eiwitten) voor een bepaalde periode of onder bepaalde omstandigheden. Organismen daarom controleren en reguleren eiwit overvloed aan mobiele behoeften 1 te voldoen. Bijvoorbeeld, cyclinen (eiwitten die celdeling) aanwezig op specifieke fasen van de celcyclus en het verlies van cycline gereguleerde niveau is geassocieerd met kwaadaardige tumorvorming 2. Naast het reguleren van eiwit niveaus om cellulaire behoeften te voldoen, cellen in dienst afbrekende kwaliteitscontrole mechanismen om verkeerd gevouwen, niet gemonteerd of anderszins afwijkende eiwitmoleculen 3 te elimineren. Controle van eiwit overvloed impliceert regulering van beide macromoleculaire synthese (transcriptie en vertaling) en afbraak (RNA verval en proteolyse). Gestoorde of overmatige afbraak van eiwitten bijdraagt ​​aan meerdere pathologieën, Waaronder kanker, cystische fibrose, neurodegeneratieve aandoeningen en cardiovasculaire aandoeningen 4-8. Proteolytische mechanismen vertegenwoordigen daarom veelbelovende therapeutische doelwitten voor een reeks van ziekten 9-12.

Analyse van eiwitten op een enkel tijdstip (bijvoorbeeld door western blot 13, 14 flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie 15) geeft een overzicht van de steady-state-eiwit overvloed zonder het openbaren van de relatieve bijdrage van de synthese of degradatie. Evenzo groei gebaseerde reporter assays tijdens steady state eiwitniveaus over een langere tijdsperiode zonder onderscheid tussen de invloeden van de synthese en degradatie 15-20. Het is mogelijk de bijdrage van afbrekende processen steady state eiwitniveaus afgeleid door vergelijking overvloed voor en na remming van specifieke onderdelen van de afbrekende mechanisme (bijvoorbeeld door het inactiveren farmacologisch proteasome 21 of het uitspelen van een gen dat de hypothese vereist zijn voor de afbraak 13). Een verandering in de steady state eiwitniveaus na remmen afbraakroutes sterk bewijs voor de bijdrage van proteolyse de controle eiwitgehalte 13. Echter, een dergelijke analyse nog steeds geen informatie verstrekken over de kinetiek van de omzet eiwit. Cycloheximide chase gevolgd door western blotting overwint deze tekortkomingen doordat onderzoekers om eiwitafbraak te visualiseren in de tijd 22-24. Omdat verder eiwitdetectie volgende cycloheximide chase typisch uitgevoerd door middel van Western blotting, radioactieve isotopen en langdurige immunoprecipitatie stappen niet vereist voor cycloheximide chase, in tegenstelling tot veel gangbare pulse chase technieken, die eveneens uitgevoerd om eiwitafbraak 25 te visualiseren.

Cycloheximide werd eerst geïdentificeerd als een verbinding met anti-schimmel juistebanden geproduceerd door de gram-positieve bacterie Streptomyces griseus 26,27. Het is een cel-permeabel molecuul dat specifiek eukaryote cytosolische (maar niet organellen) vertaling remt door afbreuk ribosomale translocatie 28-31. In een cycloheximide chase experiment wordt cycloheximide toegevoegd aan cellen en monsters van cellen onmiddellijk op specifieke tijdstippen na toevoeging van de verbinding 22 verzameld. Cellen worden gelyseerd en eiwitgehalte op elk tijdstip geanalyseerd, typisch door western blot. Afneemt eiwitgehalte na toevoeging van cycloheximide veilig kan worden toegeschreven aan eiwitafbraak. Een instabiele eiwit zal afnemen in overvloed in de tijd, terwijl een relatief stabiele eiwit weinig verandering in overvloed zal vertonen.

Mechanismen van selectieve afbraak van eiwitten zijn sterk geconserveerd in heel Eukarya. Veel van wat bekend is over eiwitafbraak werd voor het eerst geleerd inhet model eencellige eukaryoot, Saccharomyces cerevisiae (gist) 25,32-36. Studies met gist zijn waarschijnlijk blijven leveren nieuwe en belangrijke inzichten in eiwitafbraak. Werkwijze voor cycloheximide chase in gistcellen gevolgd door Western blot analyse van eiwitten overvloed wordt hier gepresenteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Groei en Oogst van gistcellen

  1. Zoniet analyseren afbraakkinetiek van een endogeen gisteiwit, transformatie gewenste giststam (s) met een plasmide dat codeert voor het eiwit van belang. Betrouwbare werkwijzen voor transformatie van gist zijn hiervoor beschreven 37.
  2. Inoculeer gist in 5 ml geschikt medium (bijvoorbeeld selectieve synthetische gedefinieerd (SD) medium voor plasmide handhaving van getransformeerde cellen of niet-selectieve gistextract-pepton-dextrose (YPD) medium voor niet- getransformeerde cellen). Incubeer overnacht bij 30 ° C, roteren.
    OPMERKING: 30 ° C is de optimale groeitemperatuur voor typische wildtype laboratorium giststammen 38. Omdat sommige mutante giststammen niet optimaal groeien bij 30 ° C en sommige eiwitten ondergaan temperatuurafhankelijke degradatie, het voor groei gebruikte gistcel en cycloheximide chase temperaturen worden empirisch bepaald 39.
  3. meet the optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) van elke overnacht kweek.
    OPMERKING: Cellen kunnen in logaritmische en stationaire groeifase maar moet minimaal bereikt een dichtheid verdunning zal een OD 600 = 0,2 in 15 ml vers medium.
  4. Verdun de overnachtkweken een OD600 waarde van 0,2 in 15 ml vers medium.
  5. Incubeer gist bij 30 ° C, schudden totdat de cellen te bereiken mid-logaritmische groeifase (dwz een OD 600 tussen 0,8 en 1,2).
  6. Tijdens gistcel groei, de volgende in voorbereiding op de cycloheximide chase procedure:
    1. Stel een hitteblok die plaats 15 ml conische buizen tot 30 ° C voor incubatie van cellen in de aanwezigheid van cycloheximide. Voeg water toe aan de putjes van de warmte blok voor een efficiënte warmteverdeling culturen mogelijk te maken. Voeg water toe aan elk putje zodat een 15 ml conische buis zorgt ervoor dat het waterniveau stijgt, maar niet overstromen, de rand van de put.
    2. Stel een tweede warmte-blok dat plaats biedt aan 1,5 ml microcentrifugebuizen tot 95 ° C voor eiwitdenaturatie na cellysis.
    3. Voorverwarmen vers groeimedium (1,1 ml per tijdstip per cultuur te testen) tot 30 ° C.
    4. Voeg 50 ul 20x Stop Mix voor een pre-gelabeld microcentrifugebuizen (één buis per tijdstip per cultuur te testen). Plaats de buizen op ijs.
      LET OP: Natriumazide, een ingrediënt in 20x Stop Mix, is giftig via orale inname of huidcontact. Volg de aanbevelingen van de fabrikant bij de voorbereiding, de opslag en het hanteren van natriumazide. In geval van accidentele blootstelling, raadpleeg veiligheidsinformatieblad verstrekt door de fabrikant.
  7. Wanneer cellen mid-logaritmische groei hebben bereikt, het verzamelen van 2,5 OD 600 eenheden van elke cultuur per tijdstip om te worden getest (bv 7,5 OD 600 eenheden eiwit overvloed op drie tijdstippen te analyseren). Centrifuge verzamelde cellen in 15 ml conische buisjes 3,000 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    Opmerking: Een OD 600 eenheid is gelijk aan de hoeveelheid gist aanwezig in 1 ml kweek bij een OD 600 van 1,0. Het volume van cultuur (in ml) nodig om X OD 600 eenheden (V) oogsten kan worden bepaald met de volgende vergelijking: V = X OD 600 eenheden / OD 600 gemeten. Bijvoorbeeld, tot 7,5 OD 600 eenheden van gist celcultuur oogsten op een OD 600 van 1,0, het verzamelen van 7,5 OD 600 eenheden / 1,0 = 7,5 ml gistcultuur.
  8. Resuspendeer elk celpellet in 1 ml van 30 ° C (voorverwarmd) vers groeimedium per 2,5 OD 600 eenheden van cellen (bijvoorbeeld 3 ml van 7,5 OD 600 eenheden).

2. Cycloheximide Chase

  1. Evenwicht gistcel schorsingen door incubatie gedurende 5 minuten in de 30 ° C verwarmen blok.
  2. Bereid een timer te tellen van 0:00.
  3. Om de cycloheximide chase, drukt u op "Start" op de timer te beginnen. Snel,maar goed, de volgende stappen:
    1. Cycloheximide aan een uiteindelijke concentratie van 250 ug / ml aan de eerste gistcel suspensie (bijvoorbeeld voeg 37,5 ul van 20 mg / ml cycloheximide voorraad tot 3 ml celsuspensie) en vortex kort mengen.
      LET OP: Cycloheximide is een irriterend voor de huid en is giftig via orale inname. Volg de aanbevelingen van de fabrikant bij de voorbereiding, de opslag en het hanteren van cycloheximide. In geval van accidentele blootstelling, raadpleeg veiligheidsinformatieblad verstrekt door de fabrikant.
    2. Onmiddellijk na het toevoegen van cycloheximide en vortexen, overdracht 950 ui (2,4 OD 600 eenheden) van de gist celsuspensie met cycloheximide toegevoegd aan een pre-gemerkte microcentrifugebuis met 50 ul ijskoude 20x stop mix. Vortex de microcentrifugebuis, en leg ze op ijs tot alle monsters zijn verzameld.
    3. Zet de gistcel suspensie tot 30 ° C.
  4. Herhaal de stappen 2.3.1 tot 2.30,3 voor elk van de overblijvende gist celsuspensies op regelmatige tijdstippen (bijvoorbeeld elke 30 seconden, zodat cycloheximide toegevoegd aan Sample # 1 op 0:00, Monster # 2 in 00:30, Monster # 3 op 1:00 , enz.).
  5. Bij elke volgende tijdstip, draaikolk gistcel schorsingen en overdracht 950 ul aan gemerkt microcentrifugebuizen die 50 pi pre-gekoelde 20x Stop Mix. Vortex en plaats verzamelde cellen op ijs. Terug 15 ml conische buizen tot 30 ° C verwarmen blok.
    1. Bijvoorbeeld, voor verzameling cellen 30 minuten na toevoeging cycloheximide (uitgaande van 30-seconden intervallen tussen cycloheximide Naast gist celsuspensies aan het begin van het tijdsverloop), vortex en verwijder 950 pi celsuspensie van Voorbeeld # 1 in 30:00 . Herhaal voor monster # 2 op 30:30, enzovoort.
      LET OP: Om te voorkomen dat de afwikkeling van gist, vortex celsuspensies in 15 ml conische buizen ongeveer om de 5 min in de loop van de jacht. Als alternatief, gist celsuspensieB kan in een continu roeren waterbad gedurende de duur van de cycloheximide chase experiment gehandhaafd.
  6. Wanneer alle monsters zijn verzameld, pellet cellen verzameld door centrifugeren bij 6500 xg bij kamertemperatuur gedurende 30 sec. Verwijder de bovenstaande vloeistof door pipetteren of aspiratie. De cellen zijn nu klaar voor alkaline lysis. Alternatief snap-freeze gepelleteerde cellen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.

3. Post-alkaline Protein Extraction (Gewijzigd van 16,40)

  1. Voeg 100 ul gedestilleerd water aan elk celpellet. Resuspendeer door en neer te pipetteren of vortexen.
  2. Voeg 100 ul van 0,2 M NaOH aan elk monster. Meng door en neer te pipetteren of vortexen.
  3. Incubeer gesuspendeerde cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 min. In dit stadium hebben gistcellen niet zijn gelyseerd, en eiwitten zijn niet vrijgegeven 40.
  4. Pellet cellen door centrifugeren bij 18.000 xg bij kamertemperatuur temperARD voor 30 sec. Verwijder supernatant door pipetteren of aspiratie.
  5. Te lyseren, voeg 100 pl Laemmli monsterbuffer aan elke celpellet. Resuspendeer door en neer te pipetteren of vortexen.
    OPMERKING: Sequentiële incubatie van cellen met NaOH en Laemmli monsterbuffer releases eiwitten in een vorm geschikt voor natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) onder toepassing van een Tris-glycine-loopbuffer systeem.
  6. Incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten om volledig eiwitten denatureren.
    OPMERKING: Incubatie bij 95 ° C niet geschikt voor de analyse van eiwitten die gevoelig zijn voor aggregatie (bijvoorbeeld, eiwitten met meerdere transmembraan segmenten). Deze eiwitten kunnen onoplosbare worden wanneer geïncubeerd bij 41 verhoogde temperaturen. Dus voor de analyse van dergelijke eiwitten, lysaten worden geïncubeerd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 37 ° C - 70 ° C) gedurende 10 - 30 min, zoals empirisch.
  7. Centrifuge lysaten bij 18.000 xg bij roOM gedurende 1 min om onoplosbaar materiaal te pelletiseren. Het supernatans (oplosbaar geëxtraheerd eiwit) is gereed voor scheiding door SDS-PAGE en daaropvolgende Western-blot analyse. Als alternatief, opslag lysaten bij -20 ° C.

4. Representatieve SDS-PAGE en Western Blotting Procedure (Aangepast van 16)

  1. Load eiwitstandaarden molecuulgewicht en empirisch bepaalde hoeveelheid lysaten op een SDS-PAGE gel.
    OPMERKING: Kies het percentage acrylamide en bis-acrylamide in de SDS-PAGE gel op basis van het molecuulgewicht van het beoogde eiwit. Doorgaans lagere percentage gels zijn beter geschikt voor het oplossen hogere hoogmoleculaire eiwitten.
  2. Run gel bij 200 V totdat de kleurstof voorkant heeft de onderkant van de gel bereikte.
  3. Transfer eiwitten uit de gel polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan door natte overdracht bij 20 V gedurende 60-90 min bij 4 ° C.
  4. Blok membraan door incuberen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 5% magere melk, schommelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C overnacht.
    OPMERKING: microbiële groei in de aanwezigheid van een membraan overnacht geïncubeerd voorkomen, wordt aanbevolen om natriumazide in de blokkerende oplossing omvat bij een uiteindelijke concentratie van 0,02%.
  5. Incubeer het membraan met primaire antilichaam specifiek voor eiwit van interesse in TBS met 0,1% Tween-20 (TBS / T) en 1% magere melk, schommelen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  6. Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen.
  7. Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen.
    LET OP: fluoroforen lichtgevoelig. Derhalve verdunningen van antilichamen geconjugeerd met fluoroforen worden bereid in het donker en incubatie van membranen bij aanwezigheid van antilichamen geconjugeerd met fluoroforen en daaropvolgende wasstappen optreedt in lichtdichte (bijvoorbeeld in folie verpakte) containers.
  8. Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen.
  9. Afbeelding membraan met behulp van LI-COR Odyssey CLX en beeld Studio-software (of vergelijkbare imaging apparatuur en software), naar aanleiding van aanbevelingen van de fabrikant.
  10. Nabeeld membraan verkrijgen Incubeer het membraan met een primair antilichaam specifiek voor een beladingscontrole eiwit in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen.
  11. Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen.
  12. Incubeer het membraan met geschikte fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam in TBS / T met 1% magere melk bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, schommelen.
  13. Was membraan bij kamertemperatuur 3 x 5 min met TBS / T, schommelen.
  14. Beeld Membraan voor stap 4,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om cycloheximide chase methoden illustreren de stabiliteit van -Sec62 ° 1 (figuur 1), een model gist endoplasmatisch reticulum (ER) geassocieerde afbraak (ERAD) substraat werd geanalyseerd 42-44. In ERAD, kwaliteitscontrole ubiquitine ligase enzymen covalent hechten ketens van het klein eiwit ubiquitine tot afwijkende eiwitten gelokaliseerd in het ER membraan. Dergelijke polyubiquitylated eiwitten worden vervolgens verwijderd uit het ER en afgebroken door het proteasoom, een groot, cytosolische protease 45. De ° 1 -Sec62 eiwit is bedoeld voor degradatie na aanhoudend en afwijkend aangrijpt op de translocatie, een kanaal dat eiwit translocatie vergemakkelijkt in het ER lumen of membraan 43. Ook zoogdieren apolipoproteïne B, een eiwitcomponent van low-density lipoproteïnen, grijpt voortduring de ER translocatie-complex en vervolgens afbraak ondergaat door een vergelijkbaar mechanisme wanneer de lipid bindende partners afwezig 46-48. Zo analyses van ° 1 -Sec62 afbraak in gistcellen kan inzicht geven in de afbraak van eiwitten die aanhoudend of aberrantly de translocon betrekken, voorlopig genoemd ERAD-T (voor-translocatie-geassocieerde) substraten 43.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de ER-resident ubiquitine ligase Hrd1 functies met de ubiquitine het vervoegen enzym Ubc7 om afbraak te katalyseren van ° 1 -Sec62 16,42-44. Het transmembraaneiwit Cue1 verankert Ubc7 de ER membraan en activeert het enzym 49-51. Echter, een vereiste voor Cue1 bij de afbraak van -Sec62 ° 1 niet rechtstreeks onderzocht. Om de hypothese dat Cue1, zoals Hrd1 en Ubc7, vereist voor een efficiënte afbraak van ° 1 -Sec62 testen, wild-type en mutant gistcellen tot expressie ° 1 -Sec62 werden onderworpen aan cycloheximide chase en wesstern blotanalyse (Figuur 2A). De -Sec62 ° 1 eiwit migreert op SDS-PAGE als meerdere soorten. Dit is consistent met eerdere studies hetgeen op uitgebreide posttranslationele modificatie van het eiwit 43,44,52. In wild-type gistcellen, ° 1 -Sec62 was direct afgebroken. Zoals eerder opgemerkt, het verlies van een van beide Hrd1 of Ubc7 nagenoeg gestabiliseerd de ° 1 -Sec62 eiwit 42-44. Zoals voorspeld was ° 1 -Sec62 gestabiliseerd afwezigheid van Cue1 (in dezelfde mate als in afwezigheid van Ubc7) bevestigt een rol voor de Ubc7-interagerende proteïne in ERAD-T.

Het aandeel ° 1 -Sec62 resterende eiwit op elk tijdstip werd gekwantificeerd en uitgezet in figuur 2B. We merken op dat de schijnbare snelheid van de verdwijning van ° 1 -Sec62 in wild-type cellen een onderschatting van de afbraaksnelheid van ontluikende ° 1 -Sec62 kan zijn(Dat wil zeggen, het eiwit halfwaardetijd, die het meest rechtstreeks door pulse chase analyse 43 kan worden bepaald). Omdat wild-type gist actief de ° 1 -Sec62 eiwit voorafgaand aan cycloheximide Daarnaast degraderen, wordt steady state overvloed aan ° 1 -Sec62 aanzienlijk verminderd in deze cellen (in vergelijking met cellen waarin afbraak is aangetast). Dit kan worden begrepen door vergelijking van de overvloed aan ° 1 -Sec62 op de initiële tijdstippen voor elke stam in figuur 2A. Daarnaast kunnen eventuele afbraak resistente subpopulatie van het substraat eiwit (bijvoorbeeld wanneer het eiwit zich ophoopt in intracellulaire pools dat afbraak wordt voorkomen) kunnen relatief stabiel in wild-type cellen over het tijdsverloop van het experiment weergegeven.

Figuur 1
Figuur 1. Model voor de afbraak van ° 1 -Sec62 Volgende Afwijkende Engagement van translocon (A) Schematische weergave van ° 1 -Sec62 ° 1 -Sec62 bestaat uit de volgende elementen, in volgorde:.. ° 1 (de amino-terminale 67 aminozuren van de gist transcriptionele repressor MATα2), een vlag (F) epitoop, de 2-transmembraaneiwit Sec62 en twee exemplaren van de Staphylococcus aureus proteïne A (PRA). (B) Na normale co-translationele insertie van de twee transmembraan segmenten in het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan, persistente vereniging van ° 1 -Sec62 met de translocon triggers abnormale, ° 1 afhankelijke, post-translationele translocon engagement. Een deel van de cytosolische aminoterminus aberrant binnenkomt-en waarschijnlijk blijft binnen-de translocon. (C) Na translocatie verloving, de Hrd1 ubiquitine ligase ubiquitylates ° 1 -Sec62. Hrd1 wordt bijgestaan ​​door het ubiquitine het vervoegen enzym UBC7, dat is verankerd in het ER membraan door Cue1. Ub, ubiquitine eiwit monomeren. (D) Ubiquitylated ° 1 -Sec62 wordt uit het ER membraan gehaald en afgebroken door het proteasoom, het verlichten van translocon obstructie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Cycloheximide Chase gevolgd door Western Blotting Geeft aan dat Cue1 nodig is voor Efficient ° 1 -Sec62 Degradatie. (A) Gistcellen van de aangegeven genotypes werden getransformeerd met een gist centromeer plasmide coderend ° 1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - ° 1 -FLAG-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) en aan cycloheximide chase analyse. Eiwits van elk tijdspunt (equivalent aan 0,125 OD 600 eenheden) werden gescheiden op een 8% SDS-PAGE gel en gedetecteerd door western blotting met konijnen anti-muis secundaire antilichamen, die direct het C-terminale proteïne A epitopen van de ° 1 binden - Sec62 fusieproteïne. Als lading controle werd het membraan vervolgens geïncubeerd met antilichamen die specifiek PGK1. Dit experiment werd drie keer herhaald; representatieve resultaten worden afgebeeld. (B) Kwantificatie van gegevens in (A) werd uitgevoerd met beeldverwerkingssoftware (zie tabel of Materials). De totale fluorescentie-intensiteit van een gebied beslaat de -Sec62 ° 1 eiwit werd bepaald voor elk monster. Achtergrond fluorescentie-intensiteit voor elk monster werd afgeleid uit de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de pixels rondom ° 1 -Sec62 eiwit. Dit geëxtrapoleerd achtergrond fluorescentie-intensiteit werd afgetrokken van de totale fluorescentie-intensiteit aan aangepaste tl opleverenlingen intensiteit voor elk monster. Vertaald kwantificering van totaal achtergrond en aangepaste fluorescentie-intensiteiten werden uitgevoerd PGK1, een beladingscontrole proteïne waarvan overvloed varieert niet in omstandigheden getest. Om de overvloed van ° 1 -Sec62 eiwit onder monsters te vergelijken, een verhouding van de aangepaste signaal intensiteiten van ° 1 -Sec62 om PGK1 werd bepaald voor elk monster. De -Sec62 ° 1 / PGK1 verhouding werd gedefinieerd als 100% voor het eerste tijdstip (dat wil zeggen onmiddellijk na toevoeging cycloheximide) voor elke stam dat geanalyseerd. Het bedrag van ° 1 -Sec62 nog op een latere tijdstippen (dat wil zeggen, de ° 1 -Sec62 / PGK1 ratio) werd berekend als een percentage van de ° 1 -Sec62 / PGK1 ratio op het eerste tijdstip. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.

Synthetische Defined (SD) Minimal Gist Medium 2% glucose, 0,67% gist stikstofbase zonder aminozuren, 0,002% adenine, 0,004% uracil, 0,002% arginine, 0,001% histidine, 0,006% isoleucine, 0,006% leucine, 0,004% lysine, 0,001% methionine, 0,006% fenylalanine, 0,005 % threonine, tryptofaan 0,004%. Voor vaste (plaat) medium, onder 2% agar. 1. Selectief medium wordt bereid door het weglaten van geschikte aminozuur (aminozuren) of stikstofbasen.
2. Voor het gemak, deze ingrediënten kunnen worden als geconcentreerde voorraadoplossingen als volgt gehandhaafd. Aminozuren kunnen worden gehandhaafd 100x voorraadoplossing van alle gewenste aminozuren. Giststikstofbase kunnen een 20x stockoplossing (13,4%) gehandhaafd. Dextrose kan in een 40% voorraadoplossing worden gehandhaafd. Adenine en uracil kan worden gehandhaafd met 1% voorraadoplossingen in 0,1 M NaOH.
3.Steriliseren medium autoclaaf.
Gistextract-pepton dextrose (YPD) Rich Gist Medium 1% gistextract, 2% pepton, 2% dextrose (optioneel: 0,002% adenine). Voor vaste (plaat) medium, onder 2% agar. 1. Om de trage groei en rode kleuring kenmerkend voor bepaalde laboratorium giststammen zonder (of lage abundantie) adenine voorkomen kan adenine op YPD groeimedium worden toegevoegd.
2. Voor het gemak, sommige ingrediënten kunnen worden als geconcentreerde voorraadoplossingen als volgt gehandhaafd. Dextrose kan in een 40% voorraadoplossing worden gehandhaafd. Adenine kan worden gehandhaafd als een 1% voorraadoplossing in 0,1 M NaOH.
3. Steriliseren medium autoclaaf.
20x Stop Mix 200 mM natriumazide, 5 mg / ml runderserumalbumine Natriumazide is giftig via orale inname of huidcontact. Volg de fabrikantaanbevelingen bij de voorbereiding, de opslag en het hanteren van natriumazide. In geval van accidentele blootstelling, raadpleeg veiligheidsinformatieblad verstrekt door de fabrikant.
20 mg / ml cycloheximide 1. Bereid in ethanol. Bewaar bij -20 ° C.
2. Cycloheximide is een irriterend voor de huid en is giftig via orale inname. Volg de aanbevelingen van de fabrikant bij de voorbereiding, de opslag en het hanteren van cycloheximide. In geval van accidentele blootstelling, raadpleeg veiligheidsinformatieblad verstrekt door de fabrikant.
0,2 M natriumhydroxide Bereid in het water. Natriumhydroxide reageert met glas. Daarom is voor langdurige opslag, 0,2 M natriumhydroxide worden in plastic containers gehandhaafd.
Laemmli Sample Buffer 2% SDS, 10% glycerol, 5% en# 946; mercaptoethanol, 60 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,008% broomfenolblauw 1. Laemmli monsterbuffer vaak bereid door verdunning van een geconcentreerde (bijvoorbeeld 5x) voorraad.
2. De kleurstof broomfenolblauw kan de gewenste intensiteit worden toegevoegd. Een "pinch" (zeer kleine hoeveelheid afgetapt van de rand van een spatel) is meestal voldoende.
Laemmli lopende buffer (5x) 125 mM Tris, 960 mM glycine, 0,5% SDS Om 1 liter 1x Laemmli lopende buffer voor te bereiden, te verdunnen 1: 5 in dH 2 O.
Tris acetaat-SDS Transfer Buffer (5x) 125 mM Tris-acetaat (pH 8,8), 960 mM glycine, 0,05% SDS Tot 20 liter 1x Tris-acetaat SDS bereiden Transfer Buffer combineren 4 L 5x voorraad, 4 liter methanol en 12 L van dH 2 O.
10x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH bijgesteld tot 7,5 Om 1 liter 1x TBS voor te bereiden, te verdunnen 01:10 in dH 2 O. 1x TBS kan worden aangevuld met de detergens Tween-20 en gepoederde magere melk, indien nodig.

Tabel 1. Oplossingen die in deze studie.

Strain Naam Alias relevant Genotype Referenties
VJY42 MHY501 MATa Chen et al., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATa Jungmann et al., 1993; Rubenstein et al., 2012
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATa Biederer et al., 1997; Ravid et al., 2006
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATa Deze studie
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

Tabel 2. giststammen gebruikt in deze studie. Alle stammen zijn congenic met MHY500 53. VJY42, VJY47 en VJY56 waren eerder 49,53,54 beschreven. Een gedetailleerde stam generatie en de bevestiging strategie voor VJY172 (bereid voor deze studie) is beschikbaar op aanvraag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel wordt een methode voor het analyseren van eiwitafbraak kinetiek gepresenteerd. Deze techniek kan gemakkelijk worden toegepast op een reeks van proteïnen gedegradeerd door verschillende mechanismen. Het is belangrijk op te merken dat cycloheximide chase experimenten rapporteren afbraakkinetiek van de steady state pool van een bepaald eiwit. Andere technieken kunnen worden gebruikt om de afbraak kinetiek van specifieke populaties van eiwitten te analyseren. Zo kan bijvoorbeeld de afbrekende lot van ontluikende polypeptiden worden bijgehouden door pulse chase analyse 55. In dergelijke experimenten ontluikende eiwitten korte-puls gemerkt (bijvoorbeeld met radioactieve aminozuren). Veranderingen in de overvloed van de gelabelde eiwitten in wordingstoestand (al dan niet veranderingen in normaal eiwitgehalte spiegel) kan worden bijgehouden de tijd.

Cycloheximide chase is geschikt voor het analyseren van eiwit stabiliteit gedurende een relatief korte tijd cursus (dat wil zeggen, tot twee uur). Over langere tijd courses (dwz twee uren tot dagen), cycloheximide, een globale remmer van de vertaling, is giftig voor cellen, waarschijnlijk door uitputting van ubiquitine 56. Verdere analyses van eiwitstabiliteit langere tijdsverloop zullen eerder worden aangetast door indirecte effecten van wereldwijd verminderde eiwitsynthese op de afbraak van het eiwit van belang (bijvoorbeeld afbraak van een kortstondige eiwit betrokken bij de afbraak van het eiwit van interesseren). Andere technieken, zoals metabolisch merken pulse chase experimenten, zijn dus beter geschikt voor het bestuderen van de afbraak van langlevende eiwitten en kunnen worden uitgevoerd met de resultaten verkregen in cycloheximide chase experimenten bevestigen.

Het tijdstip van toevoeging van cycloheximide en verzameling cellen is een belangrijke overweging in deze procedure. Precisie is vooral belangrijk bij de analyse van zeer kortlevende eiwitten, zoals kleine afwijkingen in de tijd verstreken vanaf cycloheximide additie naar cel oogst kan een substantiële impact hebben op schijnbare degradatie kinetiek hebben. Verder, zonder een duidelijk plan voor het uitvoeren van deze tijdgevoelige stappen, een experiment kan snel overgaan in chaos en frustratie. Daarom is het raadzaam om cycloheximide culturen toe met geplande regelmatige tijdstippen. 30-seconden intervallen voorgesteld in dit protocol, maar de timing kan worden aangepast aan het comfort en beweeglijkheid van de onderzoeker passen. Beginnende onderzoekers kan het nuttig zijn om een ​​schema van monstername keer schrijven voorafgaand aan de start van het experiment en elke geplande collectie af te steken als het zich voordoet.

In stappen 1.7 en 1.8 van de hier beschreven protocol worden gistcel kweken geconcentreerd onder verminderde volumes groeimedium voor gemakkelijke manipulatie gedurende de daaropvolgende cycloheximide chase procedure. Echter, centrifugeren van gistcellen snel induceert bepaalde cellulaire stress reacties (bijv signaalwegen datworden geactiveerd door glucose deprivatie) 57,58. De onderzoekers zijn dan ook gewaarschuwd tegen langdurig centrifugeren. Bij de analyse van de stabiliteit van eiwitten die gevoelig centrifugeren kan zijn, kunnen onderzoekers willen cycloheximide direct tot mid-log-fase kweken toevoegen zonder voorafgaande centrifugatie. In dergelijke gevallen moet cycloheximide toegevoegd aan dezelfde eindconcentratie (250 ug / ml), en gist celmonsters kan door methoden die geen initiële centrifugatie stap (bijvoorbeeld snelle filtratie) 57 vereisen worden geoogst. Verder wordt in stappen 2,3-2,5, monsters op elk tijdstip overgebracht naar een oplossing van natriumazide en op ijs geplaatst. Deze voorwaarden remmen voortgezet eiwitafbraak voor de duur van de jacht. Opgemerkt zij dat azide vermindert de cellulaire concentratie van ATP 59, waarbij specifiek remmen van de activiteit van ATP-afhankelijke proteases. Terwijl verlaagde temperatuur moet eenlso verlagen de snelheid waarmee niet-ATP-afhankelijke proteolytische processen kunnen de met onderzoekers bestuderen eiwitten afgebroken door dergelijke mechanismen afwisselend kiezen snap-vries celpellets in vloeibare stikstof als een monster wordt geoogst.

Een monster protocol voor cellysis en een vertegenwoordiger protocol voor western blotting opgenomen in dit handschrift zijn op basis van eerdere rapporten 16,40. In het post-alkaline lysis methode hier beschreven NaOH voorbehandeling verhoogt winning van gisteiwitten bij aansluitende toevoeging van Laemmli monsterbuffer. Het mechanisme waardoor deze verbetering optreedt is slecht gekarakteriseerd 40. Echter, polysachariden zoals die in gist celwanden opgelost in alkalische omstandigheden 60. Daarom is verleidelijk om te speculeren dat incubatie in aanwezigheid van NaOH gistcellen gedeeltelijk of volledig sferoplasten (dwz verwijdert celwand componenten), waardoor ze meer sensitive naar de SDS wasmiddel aanwezig in het Laemmli monsterbuffer. Omdat eiwitten worden vrijgegeven onder sterk denaturerende omstandigheden behoeven proteaseremmers niet worden opgenomen in de Laemmli monsterbuffer. De specifieke werkwijze voor cellysis kan worden aangepast afhankelijk van een bepaald experiment. Bijvoorbeeld kan de post-alkaline lysis methode ongeschikt voor lage abundantie proteïnen of eiwitten die slecht worden gedetecteerd door western blot. In dergelijke gevallen, methoden die een trichloorazijnzuur precipitatie stap eiwitsteekproeven concentreren kan het meest geschikt 61 zijn omvatten. Bovendien is een aantal belangrijke overwegingen met betrekking tot selectie antilichaam, het laden van controle keuze, en alternatieve middelen van detectie (bijvoorbeeld chemiluminescerende western blotting met behulp van film of digitale imaging-systemen) zijn onlangs besproken 16. Kwantificering van eiwitgehalte volgende cycloheximide behandeling worden uitgevoerd. Veel beeldvormende systemen worden verkocht met softwarepakketten die te vergemakkelijkendeze analyse.

Cycloheximide chase kan worden toegepast om de afbraak van diverse gisteiwitten geanalyseerd en kunnen worden aangepast om eiwitstabiliteit in andere eukaryote cellen te bestuderen. Zoals beschreven in dit protocol, wordt cycloheximide behandeling, gevolgd door cellysis en detectie van eiwit overvloed door Western blotanalyse. Afhankelijk van de toepassing, maar eiwit overvloed volgende cycloheximide behandeling kan worden beoordeeld door een scala van technieken, zoals aangewezen voor onderzoeksdoeleinden. Als bijvoorbeeld eiwitgrootte is niet relevant voor analyse cellysaten worden onderworpen aan dot blot analyse of enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA), welk rapport op eiwitgehalte, maar schijnbaar molecuulgewicht 62. Voor eiwitten op het celoppervlak (of inwendig fluorescent gelabeld interne eiwitten), flowcytometrie worden gebruikt om eiwitgehalte van monsters op verschillende tijdstippen na kwantificeren cycloheximide toevoeging 51. Fluocerend microscopie volgende cycloheximide behandeling zou informatie over zowel eiwit overvloed en lokalisatie 18 bieden. Het bereik van substraten, organismen, en downstream-applicaties vatbaar voor cycloheximide achtervolging maakt deze techniek een zeer veelzijdige en informatieve middel van het bestuderen van eiwitafbraak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Biochemie , Gist mutanten endoplasmatisch reticulum-geassocieerde degradatie eiwitafbraak cycloheximide chase translocatie ubiquitine-proteasoom systeem
Cycloheximide Chase Analyse van de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter