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Biology

Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Regulation der Proteinmenge ist entscheidend für nahezu jeden zellulären Prozess. Protein Fülle spiegelt die Integration der Geschwindigkeiten der Proteinsynthese und Proteinabbau. Viele Tests auf Proteinmenge Berichterstattung (zB Single-Zeitpunkt Western - Blot, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder wachstumsbasierten Reporter - Assays) keine Diskriminierung der relativen Auswirkungen der Übersetzung und Proteolyse auf Protein - Ebene ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid durch Western - Blot gefolgt Chase speziell Proteinabbau im Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) zu analysieren. In diesem Verfahren werden Hefezellen in Gegenwart des Translationsinhibitor Cycloheximid inkubiert. Aliquots von Zellen unmittelbar nach und in bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe von Cycloheximid gesammelt. Die Zellen werden lysiert und die Lysate werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt for Westernblot-Analyse von Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt. Die Cycloheximid chase Verfahren ermöglicht die Visualisierung der Abbaukinetik der Steady-State-Population einer Vielzahl von zellulären Proteinen. Das Verfahren kann die genetische Anforderungen und Umwelteinflüsse auf den Proteinabbau zu untersuchen, verwendet werden.

Introduction

Proteine ​​erfüllen wichtige Funktionen in praktisch jeder zelluläre Prozess. Viele physiologische Prozesse erfordern die Anwesenheit eines spezifischen Proteins (oder Proteine) für einen definierten Zeitraum oder unter bestimmten Umständen. Organismen deshalb überwachen und Proteinmenge regulieren die zelluläre Bedürfnisse 1 erfüllen. Zum Beispiel Cycline (Proteine, die Zellteilung kontrollieren) vorhanden sind , in bestimmten Phasen des Zellzyklus und der Verlust der geregelten cyclin Ebenen hat mit malignen Tumorbildung 2 verbunden. Zusätzlich Proteinspiegel zu regulieren zelluläre Bedürfnisse zu erfüllen, verwenden Zellen zersetzenden Qualitätskontrollmechanismen misfolded, unmontiert oder auf andere Weise anomale Proteinmoleküle 3 zu beseitigen. Kontrolle der Proteinmenge beinhaltet Regulierung sowohl makromolekularen Synthese (Transkription und Translation) und Abbau (RNA Zerfall und Proteolyse). Beeinträchtigte oder übermäßige trägt Proteinabbau zu mehreren PathologienEinschließlich Krebs, Mukoviszidose, neurodegenerativen Erkrankungen und Herz - Kreislauf - Erkrankungen 4-8. Proteolytischen Mechanismen stellen somit vielversprechende therapeutische Ziele für eine Reihe von Krankheiten 12.09.

Analyse von Proteinen in einem einzigen Zeitpunkt (zB durch Western - Blot - 13, Durchflusszytometrie 14 oder Fluoreszenzmikroskopie 15) stellt eine Momentaufnahme der steady state Proteinmenge , ohne dass die relativen Beiträge der Synthese oder Abbau offenbaren. Ähnlich wachstums basierten Reporterassays reflektieren steady state - Proteinspiegel über einen längeren Zeitraum ohne 15-20 zwischen den Einflüssen der Synthese und Abbau zu unterscheiden. Es ist möglich , den Beitrag der degradative Prozesse steady state - Proteinspiegel durch Überfluß Vergleich zu schließen , vor und nach der spezifischen Komponenten des Mechanismus degradative Hemmen (beispielsweise durch die pharmakologisch Prote inaktivierendeasome 21 oder ein Gen vermutet , Ausschlagen zu 13 Abbau erforderlich). Eine Änderung in steady state - Proteinspiegel nach Abbauwege sorgt für den Beitrag der Proteolyse zur Kontrolle der Proteinmenge 13 starke Beweise hemmen. Allerdings ist eine solche noch eine Analyse keine Informationen über die Kinetik des Proteinumsatzes bereitstellen. Durch Western - Blot gefolgt Cycloheximide Chase überwindet diese Schwächen , indem Forscher Proteinabbau im Laufe der Zeit von 22 bis 24 sichtbar zu machen. Ferner wird in der Regel durch Western - Blot, radioaktive Isotope und langwierige Immunpräzipitation Schritte sind nicht erforderlich , für Cycloheximid Jagd, im Gegensatz zu vielen häufig verwendeten Puls chase Techniken, die auch durchgeführt werden , zu visualisieren Proteinabbau 25 durchgeführt , da Proteindetektion folgende Cycloheximid Jagd.

Cycloheximide wurde zuerst als eine Verbindung mit Anti-Pilz richtige identifiziertBindungen von den grampositiven Bakterium Streptomyces griseus 26,27 erzeugt. Es ist eine zellpermeable Molekül , das spezifisch eukaryotische cytosolischen hemmt (aber nicht organellären) Übersetzung von der ribosomalen Translokation 28-31 beeinträchtigen. In einem Cycloheximid chase Experiment wird Cycloheximid zu Zellen zugesetzt, und Aliquote der Zellen werden sofort und zu bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe der Verbindung 22 gesammelt. Die Zellen werden lysiert und Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt, typischerweise durch Western-Blot analysiert. Vermindert in Proteinmenge nach der Zugabe von Cycloheximid kann getrost auf den Proteinabbau zurückzuführen. Ein instabiles Protein wird in Hülle und Fülle im Laufe der Zeit ab, während ein relativ stabiles Protein wenig Veränderung in Hülle und Fülle aufweisen wird.

Mechanismen der selektiven Proteinabbau wurden in ganz Eukarya hoch konserviert. Vieles von dem, was über den Proteinabbau bekannt ist, wurde zum ersten Mal gelernt, indas Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) 25,32-36. Studien mit Hefe sind wahrscheinlich neue und wichtige Einblicke in Proteinabbau fortzusetzen bereitstellt. Verfahren zur Cycloheximid chase in Hefe durch Western-Blot-Analyse der Proteinmenge, gefolgt Zellen wird hier vorgestellt.

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Protocol

1. Wachstum und Ernte von Hefezellen

  1. Wenn nicht Abbaukinetik eines endogenen Hefe-Proteins zu analysieren, umwandeln gewünschten Hefestamm (s) mit einem Plasmid, das das interessierende Protein kodiert. Zuverlässige Methoden für die Transformation von Hefe wurden 37 zuvor beschrieben wurde .
  2. Beimpfen von Hefe in 5 ml geeigneten Medium (beispielsweise eine selektive synthetische definiert (SD) Medium für Plasmiderhaltung von transformierten Zellen oder nicht-selektiven Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Medium für nicht-transformierte Zellen). über Nacht bei 30 ° C inkubieren, drehen.
    HINWEIS: 30 ° C ist die optimale Wachstumstemperatur für typische Wildtyp - Labor Hefestämme 38. Da jedoch einige mutanten Hefestämmen nicht wachsen optimal bei 30 ° C und einige Proteine ​​unterzogen werden temperaturabhängige Abbau die Temperaturen empirisch 39 bestimmt werden für Hefe Zellwachstum und Cycloheximid chase verwendet sollte.
  3. Messen Sie the optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) jeder Übernachtkultur.
    HINWEIS: Die Zellen können in logarithmischen oder stationären Wachstumsphase sein , aber minimal eine Dichte erreicht haben , sollte die Verdünnung bis zu einer OD 600 ermöglichen = 0,2 in 15 ml frisches Medium.
  4. Verdünne die Nacht - Kulturen auf eine OD 600 - Wert von 0,2 in 15 ml frisches Medium.
  5. Inkubieren Hefe bei 30 ° C, Schütteln , bis die Zellen mittleren logarithmischen Wachstumsphase (dh eine OD 600 zwischen 0,8 und 1,2) erreichen.
  6. Während des Zellwachstums Hefe, führen Sie die folgenden in Vorbereitung auf die Cycloheximid chase Verfahren:
    1. Stellen Sie einen Wärmeblock, der 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C für die Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid aufnehmen kann. Zugabe von Wasser zu den Vertiefungen der Heizblock eine effiziente Wärmeverteilung zu den Kulturen zu ermöglichen. Fügen Sie Wasser zu jeder Vertiefung, so dass eine 15 ml konischen Röhrchen wird der Wasserspiegel führen zu steigen, aber nicht überlaufen, um die Lippe des Brunnens.
    2. Legen Sie einen zweiten Wärmeblock, der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf 95 ° C für Eiweißdenaturierung folgende Zell-Lyse aufnehmen kann.
    3. Pre-warmes frisches Wachstumsmedium (1,1 ml pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden) bis 30 ° C.
    4. In 50 ul 20x Stop-Mix zu vormarkiert Mikrozentrifugenröhrchen (ein Röhrchen pro Zeitpunkt pro Kultur getestet werden). Die Röhrchen auf Eis.
      VORSICHT: Natriumazid, ein Bestandteil in 20x Stop-Mix, ist giftig über die orale Einnahme oder Hautkontakt. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Umgang mit Natriumazid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt.
  7. Wenn die Zellen mittleren logarithmischen Wachstum erreicht haben, sammeln 2,5 OD 600 Einheiten jeder Kultur pro Zeitpunkt zu untersuch (zB 7,5 OD 600 Einheiten Proteinmenge zu drei Zeitpunkten zu analysieren). Zentrifuge gesammelten Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 3,000 × g bei Raumtemperatur für 2 min.
    HINWEIS: Eine OD600 - Einheit entspricht der Menge Hefe , die in 1 ml Kultur bei einer OD 600 von 1,0. V = X OD 600 Einheiten / Mess OD 600: Das Volumen der Kultur (in ml) erforderlich X OD 600 Einheiten (V) zu ernten kann durch Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt werden. Beispielsweise zur Ernte 7,5 OD 600 Einheiten von Hefe - Zellkultur bei einer OD 600 von 1,0, sammeln 7,5 OD 600 Einheiten / 1,0 = 7,5 ml Hefekultur.
  8. Resuspendieren jedes Zellpellet in 1 ml 30 ° C (vorgewärmte) frisches Wachstumsmedium pro 2,5 OD 600 Einheiten von Zellen (beispielsweise 3 ml 7,5 OD 600 - Einheiten).

2. Cycloheximide Chase

  1. Hefe-Zellsuspensionen durch Inkubation für 5 min bei 30 ° C Heizblock äquilibrieren.
  2. Bereiten Sie einen Timer von 0:00 aufwärts zu zählen.
  3. Um die Cycloheximid Jagd, drücken Sie "Start" auf dem Timer beginnen. Schnell,aber sorgfältig, führen Sie die folgenden Schritte aus:
    1. Hinzufügen Cycloheximid zu einer Endkonzentration von 250 ug / ml zur ersten Hefezelle Suspension (beispielsweise hinzu 37,5 ul 20 mg / ml Cycloheximid Lager zu 3 ml der Zellsuspension) und vortex kurz zu mischen.
      ACHTUNG: Cycloheximid ist ein reizend Haut und ist toxisch bei der oralen Einnahme. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Handhabung Cycloheximid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt.
    2. Unmittelbar nach Cycloheximid und Verwirbelung Zugabe, Transfer 950 ul (~ 2,4 OD 600 Einheiten) der Hefe - Zellsuspension mit zusätzlichem Cycloheximid zu einem vorher markierten Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul eiskaltes 20x Stop Mix. Vortex, um die Mikrozentrifugenröhrchen, und auf Eis, bis alle Proben gesammelt worden sind.
    3. Liefert die Hefe-Zellsuspension auf 30 ° C.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 bis 2.30,3 für jede der verbleibenden Hefezelle Suspensionen in regelmäßigen Zeitintervallen (beispielsweise alle 30 sec, so daß Cycloheximid hinzugefügt # 1 um 0:00, Probe # 2 bei 0.30, Probe # 3 um 1:00 bis Probe usw.).
  5. Bei jedem nachfolgenden Zeitpunkt, Wirbel Hefezelle Suspensionen und Transfer 950 ul an markierte Mikrozentrifugenröhrchen 50 ul vorgekühlten 20x Stopp Mix enthält. Vortex und Ort gesammelten Zellen auf Eis. Rück 15 ml konische Röhrchen auf 30 ° C Heizblock.
    1. Beispielsweise für die Sammlung von Zellen 30 min nach Zugabe Cycloheximid (unter der Annahme von 30-sec Intervallen zwischen Cycloheximid neben Hefe-Zellsuspensionen zu Beginn des Zeitverlaufs), Vortexen und entfernen 950 & mgr; l der Zellsuspension aus Probe # 1 bei 30:00 . Wiederholen für Probe # 2 bei 30:30, und so weiter.
      ANMERKUNG: Um zu verhindern, von Hefe Absetzen vortex Zellsuspensionen in 15 ml konische Röhrchen etwa alle 5 min im Verlauf des chase. Alternativ Hefe Zellsuspensions kann in einem kontinuierlich Rühren Wasserbad für die Dauer des Experiments Cycloheximid chase aufrechterhalten werden.
  6. Wenn alle Proben gesammelt worden sind, gesammelt Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 6.500 × g bei Raumtemperatur für 30 sec. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Absaugen. Die Zellen sind nun bereit für die alkalische Lyse. Alternativ Snap-freeze-Zellen in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C pelletiert.

3. Post-alkalische Proteinextraktion (Modified aus 16,40)

  1. Füge 100 & mgr; l destilliertes Wasser zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung.
  2. Zugabe von 100 ul 0,2 M NaOH zu jeder Probe. Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung.
  3. Inkubieren suspendierten Zellen bei Raumtemperatur für 5 min. In diesem Stadium haben Hefezellen nicht lysiert, und die Proteine ​​wurden nicht 40 freigegeben.
  4. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 18.000 × g bei Raum Temperamenttur für 30 Sekunden. Überstand entfernen durch Pipettieren oder Absaugen.
  5. Um lysieren Zellen, 100 & mgr; l Laemmli-Probenpuffer zu jedem Zellpellet. Resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren oder Verwirbelung.
    HINWEIS: Sequential Inkubation von Zellen mit NaOH und Laemmli-Probenpuffer Freisetzungen Proteine ​​in einer Form kompatibel mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem Tris-Glycin-Laufpuffersystem verwendet wird.
  6. bei 95 ° C inkubieren 5 min voll Proteine ​​zu denaturieren.
    HINWEIS: Die Inkubation bei 95 ° C kann nicht für die Analyse von Proteinen geeignet sein , die zur Aggregation neigen (beispielsweise Proteine ​​mit mehreren transmembrane segments). Diese Proteine ​​können unlöslich werden , wenn sie bei erhöhten Temperaturen 41 inkubiert. So kann für die Analyse derartiger Proteine ​​sollten Lysate bei niedrigeren Temperaturen (zB 37 ° C - 70 ° C) inkubiert, für 10 bis 30 min, wie empirisch ermittelt.
  7. Centrifuge Lysate bei 18.000 × g bei room Temperatur 1 min unlösliche Material zu pelletieren. Der Überstand (solubilisiert extrahierte Protein) bereit ist für die Trennung durch SDS-PAGE und anschließendem Western-Blot-Analyse. Alternativ speichern Lysate bei -20 ° C.

4. Repräsentative SDS-PAGE und Western Blot - Verfahren (Angepasst von 16)

  1. Lastproteinmolekulargewichtsstandards und empirisch ermittelten Volumen der Lysate auf einem SDS-PAGE-Gel.
    HINWEIS: Wählen Sie den Prozentsatz von Acrylamid und Bisacrylamid im Gel SDS-PAGE, bezogen auf das Molekulargewicht des Proteins von Interesse. In der Regel niedriger sind Prozentsatz Gele besser geeignet für höhermolekulare Proteine ​​zu lösen.
  2. Führen Gel bei 200 V, bis die Farbstofffront hat den unteren Rand des Gels erreichte.
  3. Transferproteine ​​aus dem Gel auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran durch Nasstransfer bei 20 V für 60 bis 90 min bei 4 ° C.
  4. Block Membran durch Inkubation in Tris-gepufferter Saline (TBS), enthaltend 5% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht.
    ANMERKUNG: Um das mikrobielle Wachstum in Gegenwart einer Membran über Nacht inkubiert verhindern, wird empfohlen, Natriumazid in der Blockierungslösung bei einer Endkonzentration von 0,02% enthalten.
  5. Inkubieren Membran mit primärem Antikörper, der spezifisch für Protein von Interesse in TBS mit 0,1% Tween-20 (TBS / T) und 1% Magermilch, schaukeln, bei Raumtemperatur für 1 Std.
  6. Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln.
  7. Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln.
    HINWEIS: Fluorophore sind lichtempfindlich. Deshalb, um Fluorophoren konjugiert Verdünnungen von Antikörpern sollte im Dunkeln hergestellt werden, und die Inkubation der Membranen in der Gegenwart von Antikörpern gegen Fluorophore und nachfolgende Waschschritte in konjugiert lichtundurchlässigen (beispielsweise folienumwickelte) co auftretenntainers.
  8. Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln.
  9. Bild Membran mit LI-COR Odyssey CLx und Bild-Studio-Software (oder einem vergleichbaren Bildgeräte und Software), nach den Empfehlungen des Herstellers.
  10. Membran Bild Nach dem Erwerb, Inkubation der Membran mit einem primären Antikörper, der spezifisch für eine Ladekontrollprotein in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, schaukeln.
  11. Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln.
  12. Inkubieren Membran mit geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in TBS / T mit 1% Magermilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde, zu schaukeln.
  13. Waschen Sie die Membran bei Raumtemperatur 3 x 5 min mit TBS / T, zu schaukeln.
  14. Bild Membran, wie in Schritt 4.9.

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Representative Results

Zu Cycloheximid chase Methodik, die Stabilität der deg1 -Sec62 (Abbildung 1), ein Modell Hefe endoplasmatischen Retikulum (ER) -assoziierten Degradation (ERAD) -Substrat wurde 42-44 veranschaulichen analysiert. In ERAD, Qualitätskontrolle Ubiquitin-Ligase-Enzyme kovalent an die ER-Membran lokalisiert Ketten des kleinen Proteins Ubiquitin an anomale Proteine ​​anhängen. Solche polyubiquitylated Proteine ​​werden anschließend aus dem ER und durch das Proteasom abgebaut, eine große, cytosolischen Protease 45 entfernt. Das deg1 -Sec62 Protein wird für den Abbau gezielt nach beharrlich und aberrantly die Translocon eingreift, einen Kanal, der Protein - Translokation in das ER - Lumen oder Membran 43 erleichtert. Ebenso Säuger Apolipoprotein B, eine Proteinkomponente von Lipoproteinen niedriger Dichte greift beharrlich die ER Translokon und anschließend erfährt Abbau durch einen verbundenen Mechanismus, wenn seine Lippeid Bindungspartner fehlen 46-48. So Einblick in den Abbau von Proteinen Analysen von deg1 -Sec62 Abbau in Hefezellen ergeben können , die beharrlich oder aberrantly die Translocon engagieren, bezeichnet als vorläufig ERAD-T (für Translocon-assoziierte) 43 Substrate.

Frühere Studien haben gezeigt , dass die ER-resident - Ubiquitin - Ligase Hrd1 Funktionen mit dem Ubiquitin-konjugierende Enzym Ubc7 zu katalysieren den Abbau von deg1 -Sec62 16,42-44. Das Transmembranprotein CUE1 Anker Ubc7 an der ER - Membran und aktiviert das Enzym 49-51. Allerdings hat sich ein Bedarf an CUE1 in den Abbau von deg1 -Sec62 nicht direkt untersucht worden. Um die Hypothese zu testen , dass CUE1, wie Hrd1 und Ubc7, für einen effizienten Abbau von deg1 -Sec62 erforderlich ist, Wildtyp und Mutante exprimierenden Hefezellen deg1 -Sec62 wurden Cycloheximid Jagd ausgesetzt und western - Blot - Analyse (Abbildung 2A). Die deg1 -Sec62 Protein wandert auf einem SDS-PAGE als mehrere Arten. Dies steht im Einklang mit früheren Untersuchungen , die ausgedehnte posttranslationale Modifikation des Proteins 43,44,52. In Wildtyp - Hefezellen, war deg1 -Sec62 leicht verschlechtert. Wie zuvor beobachtet, der Verlust entweder Hrd1 oder Ubc7 stabilisiert im wesentlichen die deg1 -Sec62 Protein 42-44. Wie vorhergesagt, wurde in Abwesenheit von CUE1 (in einem ähnlichen Ausmaß wie in der Abwesenheit von Ubc7), was bestätigt , eine Rolle für den Ubc7-interacting protein in ERAD-T deg1 -Sec62 stabilisiert.

Der Anteil der deg1 -Sec62 Protein zu jedem Zeitpunkt verblieb , wurde quantifiziert und ist in 2B dargestellt. Wir nehmen zur Kenntnis , dass die scheinbare Geschwindigkeit des Verschwindens von deg1 -Sec62 in Wildtyp - Zellen kann eine Unterschätzung der Geschwindigkeit des Abbaus von im Entstehen begriffenen deg1 -Sec62 sein(Dh die Halbwertszeit des Proteins, die sich am unmittelbarsten durch Puls chase - Analyse bestimmt werden kann , 43). Weil Wildtyp - Hefe aktiv die deg1 -Sec62 Protein vor Cycloheximid hinaus steady state Fülle von deg1 -Sec62 degradieren im wesentlichen in diesen Zellen verringert ( im Vergleich zu Zellen , in denen Abbau beeinträchtigt ist ). Dies kann durch einen Vergleich der Überfluss an deg1 -Sec62 zu dem Anfangszeitpunkte für jeden Stamm in 2A erkannt werden. Weiterhin wurden keine Degradation beständigen Subpopulation des Substratproteins (beispielsweise , wenn das Protein von dem bei der intrazellulären Pools ansammelt Abbau verhindert wird) könnte relativ stabil erscheinen in Wildtyp - Zellen , über den Zeitverlauf des Experiments.

Abbildung 1
Abbildung 1. Modell für den Abbau von deg1 -Sec62 Folgende anomale Verpflichtungs von Translocon (A) Schematische Darstellung von deg1 -Sec62 deg1 -Sec62 aus den folgenden Elementen besteht, in der Reihenfolge:.. Deg1 (die aminoterminalen 67 Aminosäuren aus der Hefe Repressor MATα2), eine Flagge (F) Epitop, das 2-Transmembranprotein Sec62 und zwei Kopien des Staphylococcus aureus Protein A (PRA). (B) Nach normalen co-translationale Einführen seiner beiden Transmembransegmente in das endoplasmatische Retikulum (ER) -Membran, persistent Assoziation von deg1 -Sec62 mit dem Translocon löst abnormal, deg1 -abhängigen, post-translationale Translocon Engagement. Ein Teil des cytosolischen Aminoterminus aberrantly eintritt-und wahrscheinlich bleibt in-the Translocon. (C) Nach Translocon Engagement, ubiquitylates die Hrd1 Ubiquitin - Ligase deg1 -Sec62. Hrd1 wird durch das Ubiquitin-konjugierende Enzym unterstützt UBC7, die in der ER-Membran durch CUE1 verankert ist. Ub, Ubiquitin - Protein - Monomeren. (D) ubiquitinierten deg1 -Sec62 aus der ER - Membran extrahiert und durch das Proteasom abgebaut, Translocon Obstruktion zu entlasten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Cycloheximide Chase , gefolgt von Western Blotting Zeigt an, dass CUE1 für effiziente Degradation deg1 -Sec62 erforderlich ist. (A) Hefezellen der angegebenen Genotypen wurden mit einem Hefe - Zentromer - Plasmid - Kodierung deg1 -Sec62 transformiert (pRS416-P MET25 - deg1 -Flagge-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) und Cycloheximid chase - Analyse unterzogen. Eiweißs von jedem Zeitpunkt (äquivalent zu 0,125 OD 600 Einheiten) wurden auf einem 8% SDS-PAGE - Gel aufgetrennt und detektiert durch Western Blot mit Kaninchen - anti-Maus - Sekundärantikörper, der direkt auf die C-terminale Protein A Epitope des deg1 binden - Sec62 Fusionsproteins. Als Ladekontrolle wurde die Membran anschließend mit Antikörpern spezifisch für PGK1 inkubiert. Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt; abgebildet sind repräsentative Ergebnisse. (B) Quantifizierung der Daten in (A) wurde unter Verwendung von Imaging - Software durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien). Die Gesamtfluoreszenzintensität eines Bereichs des deg1 -Sec62 Protein umfassenden wurde für jede Probe bestimmt. Hintergrundfluoreszenzintensität für jede Probe wurde aus der mittleren Fluoreszenzintensität von Pixeln in der Nähe des deg1 -Sec62 Protein hochgerechnet. Diese Extrapolation Hintergrundfluoreszenzintensität wurde aus der Gesamt-Fluoreszenzintensität subtrahiert eingestellten fluoreszier zu ergebenrenz Intensität für jede Probe. Ähnliche Quantifizierungen für insgesamt, Hintergrund und angepasste Fluoreszenzintensitäten wurden für PGK1, durchgeführt in den getestet Bedingungen Ladekontrolle Protein, dessen Fülle nicht variiert. Um die Fülle von deg1 -Sec62 Protein unter den Proben, ein Verhältnis der eingestellten Signalintensitäten von deg1 -Sec62 zu PGK1 vergleichen wurde für jede Probe bestimmt. Die deg1 -Sec62 / pgk1 - Verhältnis wurde als 100% für den ersten Zeitpunkt definiert (dh unmittelbar nach Cycloheximid Addition) für jeden Stamm unter Analyse. Die Menge an deg1 -Sec62 bei späteren Zeitpunkten verbleibenden (dh die deg1 -Sec62 / PGK1 - Verhältnisse) wurde als Prozentsatz des deg1 berechnet -Sec62 / PGK1 Verhältnis zu dem ersten Zeitpunkt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

Synthetische Defined (SD) Minimal Hefe - Medium 2% Dextrose, 0,67% Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 0,002% Adenin, 0,004% Uracil, 0,002% Arginin, 0,001% Histidin, 0,006% Isoleucin, 0,006% Leucin, 0,004% Lysin 0,001% Methionin, 0,006% Phenylalanin, 0,005 % Threonin, Tryptophan 0,004%. Für feste (Platte) Medium, umfassen 2% Agar. 1. Selektives Medium wird durch Weglassen geeigneten Aminosäure (n) oder stickstoffhaltige Basen hergestellt.
2. Der Einfachheit halber können diese Bestandteile als konzentrierte Stammlösungen aufrechterhalten werden, wie folgt. Aminosäuren können als 100x Stammlösung beibehalten werden, die alle gewünschten Aminosäuren. Hefe-Stickstoff-Base kann in einer 20x Stammlösung (13,4%) gehalten werden. Dextrose kann in einer 40% igen Stammlösung beibehalten werden. Adenin und Uracil als 1% Stammlösungen in 0,1 M NaOH gehalten werden.
3.Sterilisieren Medium durch Autoklavieren.
Hefeextrakt-Pepton Dextrose (YPD) Rich - Hefe - Medium 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose (Optional: 0,002% Adenin). Für feste (Platte) Medium, umfassen 2% Agar. 1. Um das langsame Wachstum und Rotfärbung charakteristisch insbesondere Labor Hefestämme in Abwesenheit (oder niedrigen Häufigkeit) von Adenin verhindern, Adenin zu YPD Wachstumsmedium zugegeben werden.
wie folgt 2. Der Einfachheit halber werden einige Bestandteile können als konzentrierte Stammlösungen erhalten. Dextrose kann in einer 40% igen Stammlösung beibehalten werden. Adenin kann als 1% ige Stammlösung in 0,1 M NaOH aufrechterhalten werden.
3. Sterilisieren Medium durch Autoklavieren.
20x Stop - Mix 200 mM Natriumazid, 5 mg / ml Rinderserumalbumin Natriumazid ist giftig über die orale Einnahme oder Hautkontakt. Folgen HerstellerEmpfehlungen bei der Vorbereitung, Lagerung und Umgang mit Natriumazid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt.
20 mg / ml Cycloheximid 1. in Ethanol vorbereiten. Lagerung bei -20 ° C.
2. Cycloheximide ist ein Reiz Haut und ist über die orale Einnahme giftig. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers bei der Vorbereitung, Lagerung und Handhabung Cycloheximid. Im Falle versehentlicher Exposition, konsultieren Sicherheitsdatenblatt des Herstellers zur Verfügung gestellt.
0,2 M Natriumhydroxid Bereiten Sie in Wasser. Natriumhydroxid reagiert mit Glas. Daher ist für die Langzeitlagerung, 0,2 M Natriumhydroxid sollten in Kunststoffbehälter gehalten werden.
Laemmli Probenpuffer 2% SDS, 10% Glycerin, 5% &946 #; -Mercaptoethanol, 60 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,008% Bromphenolblau 1. Laemmli Probenpuffer wird oft durch Verdünnen einer konzentrierteren (zB 5x) vorbereitet Lager.
2. Der Farbstoff Bromphenolblau kann, um die gewünschte Intensität hinzugefügt werden. A "pinch" (sehr kleinen Menge von der Kante eines Spatels angezapft) ist typischerweise ausreichend.
Laemmli Laufpuffer (5x) 125 mM Tris, 960 mM Glycin, 0,5% SDS Zur Herstellung von 1 l 1x Laemmli Laufpuffer, verdünnen 1: 5 in dH 2 O.
Tris - Acetat-SDS Transferpuffer (5x) 125 mM Tris-Acetat (pH 8,8), 960 mM Glycin, 0,05% SDS Zur Herstellung von 20 l 1x Tris - Acetat-SDS - Puffer übertragen, kombinieren 4 l 5x Lager, 4 l Methanol und 12 l dH 2 O.
10x Tris-gepufferter Saline (TBS) 500 mM Tris, 1,5 M NaCl; pH eingestellt auf 7,5 Zur Herstellung von 1 l 1x TBS verdünnt 1:10 in dH 2 O. 1x TBS kann mit dem Detergens Tween-20 und Magermilchpulver, gegebenenfalls ergänzt werden.

Tabelle 1. Lösungen in dieser Studie verwendet.

Dehnungsnamens Alias Relevante Genotype Referenzen
VJY42 MHY501 MAT & alpha; Chen et al., 1993
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MAT & alpha; Jungmann et al . , 1993; Rubenstein et al., 2012
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MAT & alpha; Biederer et al . , 1997; Ravid et al., 2006
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MAT & alpha; Diese Studie
HIS3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

Tabelle 2. Hefestämmen in dieser Studie verwendet. Alle Stämme sind congenic mit MHY500 53. VJY42, VJY47 und VJY56 wurden zuvor 49,53,54 beschrieben. Eine detaillierte Stamm Generation und Bestätigungsstrategie für VJY172 (für diese Studie vorbereitet) ist auf Anfrage erhältlich.

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Discussion

In diesem Dokument wird ein Verfahren Protein Abbaukinetik zur Analyse dargestellt. Diese Technik kann leicht zu einer Reihe von Proteinen, die durch eine Vielzahl von Mechanismen abgebaut angewendet werden. Es ist wichtig zu beachten, daß Cycloheximid chase-Experimente berichten über Abbaukinetik des steady state Pool eines bestimmten Proteins. Andere Techniken können die Abbaukinetik von spezifischen Populationen von Proteinen zu analysieren. Zum Beispiel kann die degradative Schicksal von naszierenden Polypeptiden durch Pulse - Chase - Analyse 55 verfolgt werden. In solchen Experimenten werden naszierende Proteine ​​kurz pulsmarkiert (zB mit radioaktiven Aminosäuren). Änderungen in der Fülle der markierten Proteine ​​im Entstehen begriffenen über die Zeit verfolgt werden kann (die kann oder auch nicht in einem stabilen Zustand Proteinmenge Veränderungen spiegeln).

Cycloheximid chase ist geeignet für die Proteinstabilität über eine relativ kurze Zeitverlauf zu analysieren (dh bis zu zwei Stunden). Über längere Zeit curse (dh zwei Stunden bis Tage), Cycloheximid, ein globaler Inhibitor der Übersetzung ist, giftig für Zellen, wahrscheinlich aufgrund der Dezimierung von Ubiquitin 56. Ferner sind Analysen der Proteinstabilität über längere Zeitverläufe eher durch indirekten Auswirkungen der global beeinträchtigt Proteinsynthese auf dem Abbau des Proteins von Interesse beeinträchtigt werden (beispielsweise Abbau eines kurzlebigen Protein in den Abbau des Proteins beteiligt von interessieren). Andere Techniken, wie Puls chase metabolischen Markierungsexperimente sind daher besser geeignet für den Abbau von langlebigen Proteinen zu studieren und kann Ergebnisse durchgeführt werden, in Cycloheximid chase Experimenten erhalten zu erhärten.

Der Zeitpunkt der Zugabe von Cycloheximid und Sammlung von Zellen ist eine wichtige Überlegung in diesem Verfahren. Genauigkeit ist besonders wichtig bei der Analyse von sehr kurzlebigen Proteinen, da kleine Abweichungen in der Zeit von Cycloheximid ADDI verstrichenetion zur Zellernte kann einen erheblichen Einfluss auf die scheinbare Degradationskinetik haben. Weiterhin ohne einen klaren Plan für diese zeitkritische Schritte ausgeführt wird, kann ein Experiment schnell in Chaos und Frustration über. Aus diesem Grund ist es empfehlenswert, Cycloheximid zu den Kulturen in geplanten, regelmäßigen Abständen hinzuzufügen. 30-Sekunden-Intervallen werden in diesem Protokoll vorgeschlagen, aber das Timing eingestellt werden, um den Komfort und Geschicklichkeit des Forschers zu entsprechen. Anfänger Forscher finden es sinnvoll, einen Zeitplan für die Probenentnahme mal zu schreiben, bevor das Experiment zu initiieren und jede geplante Sammlung zu streichen, wie sie auftritt.

In den Schritten 1.7 und 1.8 des Protokolls hier beschriebenen Hefe-Zellkulturen werden in reduzierten Mengen an Wachstumsmedium für eine einfache Handhabung während der nachfolgenden Cycloheximid chase Verfahren konzentriert. Jedoch Zentrifugation von Hefezellen induziert schnell bestimmte zelluläre Stressreaktionen (zB Signalwege, diewerden durch Glukose Deprivation) 57,58 aktiviert. Die Ermittler werden darauf hingewiesen, daher gegen längere Zeiträume Zentrifugation. Wenn die Stabilität der Proteine ​​zu analysieren, die Zentrifugation empfindlich sein kann, kann Ermittler wünschen Cycloheximid direkt bis zur mittleren log-Phase-Kulturen ohne vorherige Zentrifugation hinzuzufügen. In solchen Fällen sollte Cycloheximid auf die gleiche Endkonzentration (250 & mgr; g / ml) und Hefe - Zellproben hinzugefügt werden , können durch Methoden gewonnen werden , die (beispielsweise schnelle Filtration) 57 , keine anfängliche Zentrifugationsschritt erforderlich ist . Ferner wird in den Schritten von 2,3 bis 2,5, zu jedem Zeitpunkt gesammelten Proben werden zu einer Lösung, die Natriumazid und auf Eis überführt. Diese Bedingungen hemmen fortgesetzt Proteinabbau für die Dauer der Jagd. Es sollte beachtet werden , dass Azid die zelluläre Konzentration von ATP 59, wodurch die spezifische Hemmung der Aktivität der ATP-abhängigen Proteasen verringert. Während reduzierter Temperatur sollte einreduzieren lso die Rate, mit der nicht-ATP-abhängige Funktion proteolytischen Prozesse, Snap-freeze Zellpellets in flüssigem Stickstoff können alternativ wählen Ermittler Proteine ​​abgebaut durch solche Mechanismen zu studieren, da jede Probe geerntet wird.

Eine Probe Protokoll für die Zell - Lyse und ein repräsentatives Protokoll für die Western - Blot in diesem Manuskript aufgenommen wurden aus früheren Berichten 16,40 angepasst. In der post-alkalische Lyse hier beschriebene Verfahren verbessert NaOH Vorbehandlung Extraktion von Hefe-Proteine ​​bei der anschließenden Zugabe von Laemmli-Probenpuffer. Der Mechanismus , durch den diese Verbesserung auftritt , wird schlecht 40 gekennzeichnet. Jedoch Polysaccharide wie diejenigen in Hefezellwände gefunden werden in alkalischen Bedingungen solubilisiert 60. Es ist verlockend , daher , dass die Inkubation in Gegenwart von NaOH teilweise oder vollständig zu spekulieren Hefezellen (dh entfernt Komponenten Zellwand) Sphäroplasten, um sie sensitiv Renderinge zu dem SDS Waschmittel in der Laemmli-Probenpuffer. Weil Proteine ​​unter stark denaturierenden Bedingungen freigesetzt werden, müssen Proteaseinhibitoren nicht in dem Laemmli-Probenpuffer aufgenommen werden. Das besondere Verfahren der Zelllyse kann in geeigneter Weise für ein gegebenes Experiment modifiziert werden. Zum Beispiel kann die post-alkalische Lyse-Verfahren für Low-Fülle Proteine ​​oder Proteine ​​können nicht geeignet sein, die durch Western-Blot schlecht erkannt werden. In solchen Fällen sind Verfahren , die eine Trichloressigsäure Fällungsschritt zu konzentrieren Proteinproben umfassen kann am geeignetsten 61. Darüber hinaus haben mehrere wichtige Überlegungen in Bezug auf Antikörperselektion, Ladekontroll Wahl und alternative Mittel zur Detektion (zB chemolumineszenten Western - Blot - Film oder Digital - Imaging - Systemen) haben vor kurzem 16 diskutiert. Die Quantifizierung der Proteinmenge Cycloheximid-Behandlung folgenden durchgeführt werden. Viele Bildgebungssysteme sind mit Softwarepaketen, die verkauft erleichterndiese Analyse.

Cycloheximid chase kann den Abbau einer Vielzahl von Hefe-Proteinen zu analysieren umgesetzt und angepasst werden kann, die Proteinstabilität in anderen eukaryontischen Zellen zu untersuchen. Wie in diesem Protokoll beschrieben ist, wird durch Zell-Lyse und den Nachweis von Proteinmenge mittels Western-Blot-Analyse Cycloheximid Behandlung. Je nach Anwendung kann jedoch Proteinmenge folgende Cycloheximid-Behandlung durch eine Reihe von Techniken bewertet werden, je nach Forschungsziele. Zum Beispiel kann , wenn Proteingröße kein relevanter Faktor für die Analyse ist, Zellysate zu Dot - Blot oder einem Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Analyse unterzogen, die auf Proteinmenge berichten, aber nicht offensichtliches Molekulargewicht 62. Für Proteine ​​auf der Zelloberfläche (oder interne fluoreszierend markierten internen Proteine), Durchflusszytometrie verwendet werden , um Proteinmenge der Proben zu verschiedenen Zeiten nach Zugabe Cycloheximid 51 quantifizieren. FluoFluoreszenz - Mikroskopie folgende Cycloheximid Behandlung würde sowohl Informationen über die Proteinmenge zur Verfügung stellen und Lokalisierung 18. Die Auswahl von Substraten, Organismen und Downstream-Anwendungen zugänglich zu Cycloheximid Chase macht die Technik eine sehr vielseitige und informative mittels Proteinabbau zu studieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

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Biochemie Heft 110, Bäckerhefe Mutanten Endoplasmatischen Retikulum-assoziierten Abbau den Proteinabbau Cycloheximid chase Translocon Ubiquitin-Proteasom-System
Cycloheximid Chase-Analyse von Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

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