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Biology

L'analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

Règlement de la protéine abondance est cruciale pour pratiquement tous les processus cellulaire. Abondance des protéines reflète l'intégration des taux de synthèse des protéines et la dégradation des protéines. De nombreux essais de rapports sur la protéine abondance (par exemple, un seul point de temps western blot, cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, ou des dosages de rapporteur basées sur la croissance) ne permettent pas la discrimination des effets relatifs de la traduction et de la protéolyse sur les niveaux de protéines. Cet article décrit l'utilisation de chasse cycloheximide suivie par western blot pour analyser spécifiquement la dégradation des protéines dans le eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe). Dans cette procédure, les cellules de levure sont incubées en présence du cycloheximide inhibiteur de la traduction. Des portions aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement après et à des moments spécifiques après l'addition de cycloheximide. Les cellules sont lysées, et les lysats sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide for analyse par transfert Western de protéines abondance à chaque point de temps. La procédure de poursuite de cycloheximide permet la visualisation de la cinétique de dégradation de la population de l'état d'équilibre d'une variété de protéines cellulaires. La procédure peut être utilisée pour étudier les exigences génétiques pour et les influences environnementales sur la dégradation des protéines.

Introduction

Les protéines remplissent des fonctions cruciales dans pratiquement tous les processus cellulaire. De nombreux processus physiologiques nécessitent la présence d'une protéine spécifique (ou protéines) pendant une période de temps définie ou dans des circonstances particulières. Les organismes surveillent donc et régulent l' abondance de protéines pour répondre aux besoins cellulaires 1. Par exemple, des cyclines (protéines qui contrôlent la division cellulaire) sont présents à des phases spécifiques du cycle cellulaire et la perte des niveaux de cycline réglementés a été associée à la formation de tumeurs malignes 2. En plus de la régulation des niveaux de protéines pour répondre aux besoins cellulaires, les cellules utilisent des mécanismes de contrôle de la qualité de dégradation pour éliminer un repliement des molécules de protéines unassembled, ou autrement aberrantes 3. Le contrôle de l'abondance des protéines implique la régulation à la fois la synthèse macromoléculaire (transcription et traduction) et de la dégradation (de désintégration de l'ARN et la protéolyse). la dégradation des protéines avec facultés affaiblies ou excessive contribue à de multiples pathologies, Y compris le cancer, la fibrose kystique, des maladies neurodégénératives et des troubles cardio - vasculaires 4-8. Mécanismes protéolytiques représentent donc des cibles thérapeutiques prometteuses pour une gamme de maladies 9-12.

Analyse des protéines à un seul point du temps (par exemple, par western blot 13, cytométrie en flux 14, ou la microscopie à fluorescence 15) donne un aperçu de la protéine abondance à l'état stable sans révéler la contribution relative de la synthèse ou de dégradation. De même, des dosages de rapporteur à base de croissance reflètent stables les taux de protéines de l' État sur ​​une période de temps prolongée sans discrimination entre les influences de la synthèse et la dégradation 15-20. Il est possible de déduire la contribution des processus de dégradation à des niveaux de protéines de l' état ​​d' équilibre en comparant l' abondance avant et après l' inhibition des composants spécifiques du mécanisme de dégradation (par exemple, en inactivant pharmacologiquement la proteasome 21 ou assommant un gène hypothétique d'être requis pour la dégradation 13). Un changement dans les niveaux de protéines de l' état ​​d' équilibre après l' inhibition des voies de dégradation fournit des preuves solides pour la contribution de la protéolyse au contrôle de la protéine abondance 13. Cependant, une telle analyse ne fournit toujours pas d'informations sur la cinétique de renouvellement des protéines. Chase cycloheximide suivie par western blot surmonte ces faiblesses en permettant aux chercheurs de visualiser la dégradation des protéines dans le temps 22-24. En outre, parce que la détection de la protéine suivante chase cycloheximide est généralement effectuée par Western blot, les isotopes radioactifs et les étapes d'immunoprécipitation longues ne sont pas nécessaires pour la chasse de cycloheximide, contrairement à de nombreuses techniques de chasse d'impulsions couramment utilisés, qui sont également effectuées pour visualiser la dégradation des protéines 25.

Cycloheximide a d'abord été identifié comme étant un composé anti-fongique appropriéeliens produits par les Streptomyces bactérie à Gram positif griseus 26,27. Elle est une molécule cellulaire perméable qui inhibe spécifiquement cytosoliques eucaryotes (mais pas des organites) en altérant la traduction ribosomique translocation 28-31. Dans une expérience de chasse à la cycloheximide, le cycloheximide est ajouté aux cellules, et des aliquotes de cellules sont prélevées immédiatement et à des moments spécifiques après l' addition du composé 22. Les cellules sont lysées, et l'abondance de protéines à chaque point de temps est analysé, typiquement par western blot. Des diminutions de l'abondance des protéines après l'addition de cycloheximide peuvent être en toute confiance attribuée à la dégradation des protéines. Une protéine instable va diminuer en abondance au fil du temps, tandis que d'une protéine relativement stable présentera peu de changements dans l'abondance.

Mécanismes de dégradation sélective des protéines ont été hautement conservée tout au long de Eukarya. Une grande partie de ce qui est connu à propos de la dégradation des protéines a été appris en premierle modèle eucaryote unicellulaire, Saccharomyces cerevisiae (levure de bourgeonnement) 25,32-36. Des études avec des levures sont susceptibles de continuer à fournir des idées nouvelles et importantes dans la dégradation des protéines. Une méthode pour la chasse de cycloheximide dans les cellules de levure suivie d'une analyse western blot de protéines abondance est présentée ici.

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Protocol

1. Croissance et récolte des cellules de levure

  1. Dans le cas contraire l'analyse de la cinétique de dégradation d'une protéine endogène de levure, transformer la souche (s) de levure désirée avec un plasmide codant pour la protéine d'intérêt. Des méthodes fiables pour la transformation de la levure ont été décrits précédemment 37.
  2. Inoculer levure dans 5 ml de milieu approprié (par exemple, synthétique défini (SD) milieu sélectif pour le maintien du plasmide des cellules transformées ou des levures non-sélective extrait-peptone-dextrose (YPD) moyen pour les cellules non transformées). Incuber une nuit à 30 ° C, en rotation.
    NOTE: 30 ° C est la température optimale de croissance pour de type sauvage typique des souches de laboratoire de levure 38. Cependant, parce que certaines souches de levure mutantes ne se développent pas de façon optimale à 30 ° C et certaines protéines subissent une dégradation dépendant de la température, les températures utilisées pour la croissance des cellules de levure et de poursuite de la cycloheximide doivent être déterminées empiriquement 39.
  3. Mesure ee densité optique à 600 nm (DO 600) de chaque culture d'une nuit.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être en phase de croissance logarithmique ou stationnaire , mais aurait au minimum atteint une densité qui permet une dilution à une DO600 = 0,2 dans 15 ml de milieu frais.
  4. Diluer les cultures d'une nuit à une DO 600 valeur de 0,2 à 15 ml de milieu frais.
  5. Incuber la levure à 30 ° C, en agitant jusqu'à ce que les cellules atteignent la phase de croissance logarithmique moyenne ( par exemple, une DO600 comprise entre 0,8 et 1,2).
  6. Au cours de la croissance des cellules de levure, effectuer les opérations suivantes en préparation de la procédure de poursuite de cycloheximide:
    1. Définir un bloc chauffant qui peut recevoir 15 ml tubes coniques à 30 ° C pendant l'incubation des cellules en présence de cycloheximide. Ajouter de l'eau dans les puits du bloc thermique pour permettre une distribution efficace de la chaleur vers les cultures. Ajouter de l'eau à chaque puits de telle sorte qu'un tube conique de 15 ml provoquera le niveau d'eau monte, mais sans déborder, la lèvre du puits,.
    2. Définir un second bloc de chaleur qui peut recevoir 1,5 ml microtubes à 95 ° C pour la dénaturation des protéines suivantes lyse cellulaire.
    3. milieu de croissance frais Préchauffer (1,1 ml par point de temps par la culture à doser) à 30 ° C.
    4. Ajouter 50 ul 20x Arrêter Mix pré-étiquetés microtubes (un tube par point de temps par la culture à doser). Placer les tubes sur la glace.
      ATTENTION: L'azoture de sodium, un ingrédient 20x Arrêter Mix, est toxique par ingestion ou par contact cutané. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation de l'azoture de sodium. En cas d'exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant.
  7. Lorsque les cellules ont atteint une croissance de mi-logarithmique, recueillir 2,5 OD 600 unités de chaque culture par point de temps à analyser (par exemple, 7,5 OD 600 unités pour analyser l' abondance de protéines à trois points de temps). Centrifugeuse recueilli les cellules dans 15 ml tubes coniques à 3,000 g à la température ambiante pendant 2 min.
    REMARQUE: une unité DO600 est égale à la quantité de levure présente dans 1 ml de culture à une DO600 de 1,0. Le volume de la culture (en ml) nécessaire pour récolter X OD 600 unités (V) peut être déterminée en utilisant l'équation suivante: V = X OD 600 unités / OD 600 mesurée. Par exemple, la récolte de 7,5 unités DO 600 de la culture de cellules de levure à une DO600 de 1,0, de recueillir 7,5 DO 600 unités / 1,0 = 7,5 ml de culture de levure.
  8. Resuspendre chaque culot cellulaire dans 1 ml de 30 ° C (préchauffée) milieu de croissance frais par 2,5 OD 600 unités de cellules (par exemple, 3 ml pour 7,5 OD 600 unités).

2. cycloheximide Chase

  1. Equilibrer suspensions de cellules de levure par incubation pendant 5 min dans le bloc C de chaleur de 30 °.
  2. Préparer une minuterie pour compter de 0:00.
  3. Pour commencer la chasse de cycloheximide, appuyez sur "Démarrer" sur la minuterie. Rapidement,mais soigneusement, procédez comme suit:
    1. Ajouter la cycloheximide à une concentration finale de 250 ug / ml à la suspension de cellules de levure (par exemple, ajouter 37,5 ul de 20 mg / ml de bouillon de cycloheximide à 3 ml de suspension cellulaire), et le vortex brièvement pour mélanger.
      ATTENTION: cycloheximide est un irritant cutané et est toxique par ingestion orale. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation cycloheximide. En cas d'exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant.
    2. Immédiatement après l' addition de cycloheximide et tourbillonnement, transférer 950 pi (~ 2,4 unités DO 600) de la suspension de cellules de levure avec du cycloheximide ajouté à un microtube contenant préétiqueté 50 ul 20x mélange d' arrêt glacée. Vortex du tube à centrifuger et placer sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons ont été recueillis.
    3. Retour à la suspension de cellules de levure à 30 ° C.
  4. Répéter les étapes 2.3.1 à 2.3.3 Pour chacune des autres suspensions de cellules de levure à des intervalles de temps réguliers (par exemple, toutes les 30 secondes, de telle sorte que le cycloheximide est ajouté à l' échantillon n ° 1 à 0:00, l' échantillon n ° 2 à 0:30, l' échantillon n ° 3 à 1:00 etc.).
  5. A chaque point de temps suivant, des suspensions de cellules de levure de vortex et transfert 950 pi à microtubes étiquetés contenant 50 pi pré-réfrigérés 20x Arrêter Mix. Vortex et de placer les cellules recueillies sur la glace. Retour 15 ml tubes coniques à 30 ° C bloc de chaleur.
    1. Par exemple, pour la collecte de cellules 30 minutes après l'addition de cycloheximide (en supposant que 30 s intervalles entre l'addition de cycloheximide à des suspensions de cellules de levure au début du cours du temps), vortexer et retirer 950 pi de suspension cellulaire de l'échantillon n ° 1 à 30:00 . Répétez l'opération pour l'échantillon n ° 2 à 30:30, et ainsi de suite.
      REMARQUE: Pour empêcher la sédimentation de la levure, des suspensions de cellules de vortex dans 15 ml tubes coniques environ toutes les 5 min pendant toute la durée de la chasse. En variante, la suspension de cellules de levures peut être maintenue dans un bain d'eau en agitant de façon continue pendant toute la durée de l'expérience de chasse à la cycloheximide.
  6. Quand tous les échantillons ont été collectés, culot recueilli les cellules par centrifugation à 6500 x g à température ambiante pendant 30 sec. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration. Les cellules sont maintenant prêts pour la lyse alcaline. Alternativement, snap-gel cellules sédimentées dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.

3. Extraction des protéines post-alcaline (Modifié à partir de 16,40)

  1. Ajouter 100 ul d'eau distillée à chaque culot cellulaire. Resuspendre par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
  2. Ajouter 100 ul de NaOH 0,2 M à chaque échantillon. Mélanger par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
  3. Incuber les cellules en suspension à température ambiante pendant 5 min. A ce stade, les cellules de levure n'a pas été lysées et les protéines ont pas été libérés 40.
  4. cellules à pellets par centrifugation à 18.000 xg à la chambre humeurature pendant 30 sec. Retirer le surnageant par pipetage ou aspiration.
  5. À lyser les cellules, ajouter 100 ul de tampon d'échantillon de Laemmli à chaque culot cellulaire. Resuspendre par pipetage de haut en bas ou de tourbillonnement.
    NOTE: incubation séquentielle de cellules avec un tampon d'échantillon libère NaOH et Laemmli protéines sous une forme compatible avec dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide-sulfate (SDS-PAGE) en utilisant un système tampon de course Tris-glycine.
  6. Incuber à 95 ° C pendant 5 min pour dénaturer complètement les protéines.
    REMARQUE: L' incubation à 95 ° C ne peut pas être adapté à l' analyse des protéines qui sont sujettes à l' agrégation (par exemple, des protéines ayant plusieurs segments transmembranaires). Ces protéines peuvent devenir insolubles lorsqu'ils sont incubés à des températures élevées 41. Ainsi, pour l'analyse de ces protéines, des lysats doivent être incubées à des températures plus basses (par exemple 37 ° C - 70 ° C) pendant 10 - 30 minutes, comme déterminé de manière empirique.
  7. lysats Centrifugeuse à 18.000 xg à rotempérature om pour 1 min à pellet matière insoluble. Le surnageant (extrait protéique solubilisé) est prêt pour une séparation par SDS-PAGE et après une analyse Western Blot. Alternativement, lysats conserver à -20 ° C.

4. Représentant SDS-PAGE et de la procédure Western Blot (Adapté de 16)

  1. protéine de charge des étalons de poids moléculaire et un volume déterminé de façon empirique de lysats sur un gel SDS-PAGE.
    REMARQUE: Choisir le pourcentage d'acrylamide et de bis-acrylamide dans le gel SDS-PAGE sur la base du poids moléculaire de la protéine d'intérêt. En général, la baisse des gels de pourcentage sont mieux adaptés à la résolution de protéines de poids moléculaire élevé.
  2. Gel de fonctionner à 200 V jusqu'à ce que le front de colorant ait atteint le bord inférieur du gel.
  3. Transfert des protéines du gel au fluorure de polyvinylidène (PVDF) par virement humide à 20 V pour 60-90 min à 4 ° C.
  4. Bloquer la membrane par incubation dans du Tris-solution saline tamponnée (TBS) contenant 5% de lait écrémé, à bascule, à la température ambiante pendant 1 heure ou à 4 ° C pendant la nuit.
    Remarque: pour empêcher la croissance microbienne en présence d'une membrane incubée pendant une nuit, il est recommandé d'inclure azoture de sodium dans la solution de blocage à une concentration finale de 0,02%.
  5. Incuber membrane avec un anticorps primaire spécifique pour la protéine d'intérêt dans TBS avec 0,1% de Tween-20 (TBS / T) et 1% de lait écrémé, à bascule, à la température ambiante pendant 1 h.
  6. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  7. Incuber membrane avec un anticorps secondaire approprié fluorophore conjugué dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
    NOTE: Les fluorophores sont sensibles à la lumière. Par conséquent, des dilutions d'anticorps conjugués à des fluorophores doivent être préparées dans l'obscurité, et l' incubation de membranes en présence d'anticorps conjugués à des fluorophores et des étapes de lavage ultérieures devraient se produire dans lightproof (par exemple, une feuille enveloppée) containers.
  8. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  9. membrane d'image en utilisant LI-COR Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l'équipement d'imagerie comparable et logiciel), suivant les recommandations du fabricant.
  10. Après l'acquisition de l'image de la membrane, incuber la membrane avec un anticorps primaire spécifique pour une protéine de contrôle de chargement dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
  11. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  12. Incuber membrane avec un anticorps secondaire approprié fluorophore conjugué dans TBS / T avec 1% de lait écrémé à température ambiante pendant 1 heure, à bascule.
  13. Laver la membrane à la température ambiante 3 x 5 min avec TBS / T, à bascule.
  14. Membrane d'image comme à l'étape 4.9.

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Representative Results

Pour illustrer la méthodologie de poursuite de cycloheximide, la stabilité de deg1 -Sec62 (Figure 1), un modèle de levure réticulum endoplasmique (RE) dégradation -Associated (ERAD) substrat, a été analysé 42-44. Dans DGAER, des enzymes ubiquitine ligase de contrôle de qualité fixer de manière covalente des chaînes de la petite protéine ubiquitine à des protéines aberrantes localisées sur la membrane du RE. De telles protéines polyubiquitylated sont ensuite retirés de l'ER et dégradées par le protéasome, une grande, la protéase cytosolique 45. La protéine deg1 -Sec62 est ciblé pour la dégradation après qu'elle vient en prise de façon persistante et aberrante translocon, un canal qui facilite la translocation de protéines dans la lumière du RE ou de la membrane 43. De même, l'apolipoprotéine B de mammifère, un composant protéique des lipoprotéines de faible densité, engage constamment la translocation ER et subit ensuite la dégradation par un mécanisme apparenté lorsque sa lèvreLes partenaires de liaison id sont absents 46-48. Ainsi, les analyses de la dégradation deg1 -Sec62 dans les cellules de levure peut donner un aperçu de la dégradation des protéines qui persistance ou aberrantly engagent la translocation, appelée provisoirement ERAD-T (pour translocon-associé) substrats 43.

Des études antérieures ont indiqué que les ER-résident ubiquitine ligase fonctions Hrd1 avec l'enzyme ubiquitine-conjugaison Ubc7 pour catalyser la dégradation de deg1 -Sec62 16,42-44. La protéine transmembranaire CUE1 ancre Ubc7 à la membrane du RE et active l'enzyme 49-51. Toutefois, une exigence pour CUE1 dans la dégradation des deg1 -Sec62 n'a pas été directement étudiée. Pour tester l'hypothèse selon laquelle CUE1, comme Hrd1 et Ubc7, est indispensable à la dégradation efficace de deg1 -Sec62, de type sauvage et des cellules de levure mutantes exprimant deg1 -Sec62 ont été soumis à la chasse de cycloheximide et wesL' analyse par transfert de Dougall (Figure 2A). La protéine deg1 -Sec62 migre sur SDS-PAGE sous forme de plusieurs espèces. Ceci est cohérent avec des études antérieures indiquant une modification post-traductionnelle de la protéine 43,44,52. Dans les cellules de levure de type sauvage, deg1 -Sec62 était facilement dégradée. Comme observé précédemment, la perte de l' une ou Hrd1 Ubc7 stabilisée sensiblement la protéine deg1 -Sec62 42-44. Comme prévu, deg1 -Sec62 a été stabilisé en l'absence de CUE1 (dans une mesure similaire en l'absence de Ubc7), ce qui confirme un rôle pour la protéine interagissant dans Ubc7 DGAER-T.

La proportion de protéines deg1 -Sec62 restant à chaque point de temps a été quantifiée et est représentée sur la figure 2B. Nous notons que le taux apparent de disparition de deg1 -Sec62 dans les cellules de type sauvage peut être une sous - estimation de la vitesse de dégradation des naissant deg1 -Sec62( Par exemple, la demi-vie de la protéine, qui peut être le plus directement déterminé par analyse pulse-chase 43). Parce que levure de type sauvage dégrade activement la protéine deg1 -Sec62 avant l'addition de cycloheximide, l' abondance de l' état ​​d' équilibre de deg1 -Sec62 est sensiblement réduite dans ces cellules ( par rapport à des cellules dans lesquelles la dégradation est altérée). Ceci peut être apprécié en comparant l'abondance de deg1 -Sec62 aux points de temps initial pour chaque souche de la figure 2A. En outre, toute sous - population de la protéine de substrat résistant à la dégradation (par exemple, si la protéine accumule dans les pools intracellulaires à partir de laquelle on empêche la dégradation) peut apparaître relativement stable dans les cellules de type sauvage au cours de la durée de l'expérience.

Figure 1
Figure 1. Modèle de dégradation des deg1 -Sec62 Suivante Aberrant Engagement de translocation (A) de la représentation schématique de deg1 -Sec62 deg1 -Sec62 se compose des éléments suivants, dans l' ordre:.. Deg1 (les 67 acides aminés amino-terminale de la levure répresseur transcriptionnel MATα2), un drapeau (F) épitope, la protéine 2-transmembranaire sec62, et deux copies du Staphylococcus aureus Protein A (PRA). (B) Après insertion co-traductionnelle normal de ses deux segments transmembranaires dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE), association persistante de deg1 -Sec62 avec le translocon déclenche, deg1 dépendante, l' engagement de translocation post-traductionnelle anormale. Une partie de l'extrémité amino - terminale cytosolique pénètre et aberrantly vraisemblablement reste dans-la translocation. (C) Après l' engagement de translocation, l'ubiquitine ligase Hrd1 ubiquitylates deg1 -Sec62. Hrd1 est assisté par l'enzyme ubiquitine-conjugaison UBC7, qui est ancré dans la membrane du RE par CUE1. Ub, des monomères de protéine ubiquitine. (D) ubiquitylé deg1 -Sec62 est extraite de la membrane du RE et dégradée par le protéasome, soulager l' obstruction de translocation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. cycloheximide Chase suivi par Western blot Indique que CUE1 est requise pour Efficient Dégradation deg1 -Sec62. Cellules (A) de levure des génotypes indiqués ont été transformées avec une levure centromérique plasmide codant deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) et soumis à une analyse de poursuite de cycloheximide. Protéines à chaque point de temps ( ce qui équivaut à 0,125 DO 600 unités) ont été séparées sur un gel SDS-PAGE à 8% et détectée par transfert de type western avec des anticorps secondaires de lapin anti-souris, qui se lient directement les C-terminaux des épitopes de la protéine A de la deg1 - sec62 protéine de fusion. En tant que témoin de chargement, la membrane a été ensuite mis en incubation avec des anticorps spécifiques à PGK1. Cette expérience a été répétée trois fois; des résultats représentatifs sont illustrés. (B) Quantification des données (A) a été réalisée en utilisant un logiciel d'imagerie (voir le tableau des matériaux). L'intensité de fluorescence totale d'une zone englobant la protéine deg1 -Sec62 a été déterminée pour chaque échantillon. Arrière - plan de fluorescence de chaque échantillon a été extrapolée à partir de l'intensité de fluorescence moyenne de pixels proches de la protéine deg1 -Sec62. Dans ce contexte intensité de fluorescence extrapolée a été soustraite de l'intensité de fluorescence totale ajustée pour donner Déessl'intensité de rence pour chaque échantillon. quantifications similaires pour au total, fond, et les intensités de fluorescence ajustées ont été effectuées pour PGK1, une protéine de contrôle de chargement dont l'abondance ne varie pas dans les conditions testées. Pour comparer l'abondance de protéines deg1 -Sec62 parmi les échantillons, un rapport des intensités du signal ajusté de deg1 -Sec62 à PGK1 a été déterminée pour chaque échantillon. Le ratio deg1 -Sec62 / PGK1 a été définie comme 100% pour le premier point temporel ( par exemple, immédiatement après l' addition de cycloheximide) pour chaque souche analysée. La quantité de deg1 -Sec62 restant à des points de temps suivants ( à savoir les rapports deg1 -Sec62 / PGK1) a été calculé en pourcentage du ratio deg1 -Sec62 / PGK1 au premier point de temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande ce chiffre.

Synthétique Défini (SD) Minimal Yeast Medium 2% de dextrose, 0,67% de base azotée de levure sans acides aminés, 0,002% d'adénine, 0,004% d'uracile, de 0,002% d'arginine, 0,001% d'histidine, 0,006% d'isoleucine, 0,006% de leucine, 0,004% de lysine, 0,001% de methionine, 0,006% de phénylalanine, de 0,005 % thréonine, 0,004% de tryptophane. Pour solide (plaque) moyen, y compris 2% d'agar. 1. Milieu sélectif est préparée en omettant l'acide aminé approprié (s) ou les bases azotées.
2. Pour plus de commodité, ces ingrédients peuvent être maintenus sous forme de solutions mères concentrées de la manière suivante. Les acides aminés peuvent être maintenues sous forme de solution 100x mère contenant tous les acides aminés souhaités. Levure base azotée peut être maintenue dans une solution 20x stock (13,4%). Dextrose peut être maintenue dans une solution mère à 40%. Adénine et uracile peuvent être maintenues que 1% des solutions mères dans NaOH 0,1 M.
3.Stériliser à l'autoclave.
Extract-Peptone de levure dextrose (YPD) Rich Yeast Medium 1% d'extrait de levure, 2% de peptone, 2% de glucose (facultatif: 0,002% d'adénine). Pour solide (plaque) moyen, y compris 2% d'agar. 1. Pour éviter la croissance lente et rouge coloration caractéristique de certaines souches de laboratoire de levure en l'absence (ou faible abondance) de l'adénine, l'adénine peut être ajouté au milieu de croissance YPD.
2. Pour plus de commodité, certains ingrédients peuvent être maintenus sous forme de solutions mères concentrées de la manière suivante. Dextrose peut être maintenue dans une solution mère à 40%. Adénine peut être maintenu comme une solution de stock 1% dans NaOH 0,1 M.
3. Stériliser à l'autoclave.
20x Arrêter Mix 200 mM d'azoture de sodium, 5 mg / ml de sérum-albumine bovine L'azoture de sodium est toxique par ingestion ou par contact cutané. Suivez fabricantrecommandations lors de la préparation, le stockage et la manipulation de l'azoture de sodium. En cas d'exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant.
20 mg / ml cycloheximide 1. Préparer dans l'éthanol. Conserver à -20 ° C.
2. Le cycloheximide est un irritant cutané et est toxique par ingestion orale. Suivez les recommandations du fabricant lors de la préparation, le stockage et la manipulation cycloheximide. En cas d'exposition accidentelle, consulter les documents fiche de données de sécurité fournies par le fabricant.
0,2 M d' hydroxyde de sodium Préparer dans l'eau. L'hydroxyde de sodium réagit avec le verre. Par conséquent, pour le stockage à long terme, 0,2 M d'hydroxyde de sodium doit être maintenu dans des récipients en plastique.
Sample Buffer Laemmli 2% de SDS, 10% de glycerol, 5% &# 946; mercaptoéthanol, 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,008% de bleu de bromophénol 1. Laemmli Sample Buffer est souvent préparée en diluant un plus concentré (par exemple, 5x) stock.
2. Le bleu de bromophénol de colorant peut être ajouté à l'intensité souhaitée. Un "pincement" (très petite quantité prélevée sur le bord d'une spatule) est généralement suffisante.
Laemmli Courir Buffer (5x) mM Tris 125, glycine 960 mM, 0,5% de SDS Pour préparer 1 L de 1x Laemmli Courir Buffer, diluer 1: 5 dans dH 2 O.
Tris Acétate-SDS Transfer Buffer (5x) 125 Tris acétate mM (pH 8,8), glycine 960 mM, SDS à 0,05% Pour préparer 20 L de 1x Tris Acétate-SDS Transfert Buffer, combiner 4 L de 5x stock 4 L de méthanol, et 12 L de dH 2 O.
10x Tris-solution saline tamponnée (TBS) 500 mM de Tris, 1,5 M de NaCl; pH ajusté à 7,5 Pour préparer 1 L de 1x TBS, diluer 1:10 dans dH 2 O. TBS 1x peut être complété avec le détergent Tween-20 et le lait écrémé en poudre, selon le cas.

Tableau 1. Solutions utilisées dans cette étude.

Strain Nom Alias génotype pertinente Les références
VJY42 MHY501 MATa Chen et al., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATa Jungmann et al . , 1993; Rubinstein et coll., 2012
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATa Biederer et al . , 1997; Ravid et al., 2006
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATa Cette étude
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

Tableau 2. Levure souches utilisées dans cette étude. Toutes les souches sont congenic avec MHY500 53. VJY42, VJY47 et VJY56 ont été décrits précédemment 49,53,54. Une génération détaillée de contrainte et de la stratégie de confirmation pour VJY172 (préparé pour cette étude) est disponible sur demande.

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Discussion

Dans cet article, un procédé d'analyse de la cinétique de dégradation des protéines est présentée. Cette technique peut être appliquée facilement à une large gamme de protéines dégradées par une variété de mécanismes. Il est important de noter que les expériences de chasse de cycloheximide rapport sur la cinétique de dégradation de la piscine de l'état d'équilibre d'une protéine donnée. D'autres techniques peuvent être utilisées pour analyser la cinétique de la dégradation des populations spécifiques de protéines. Par exemple, le sort de dégradation des polypeptides naissants peut être suivi par une analyse de la chasse d'impulsion 55. Dans de telles expériences, les protéines naissantes sont marquées par impulsions brièvement (par exemple avec des acides aminés radioactifs). Les changements dans l'abondance des protéines naissantes marqués (qui peuvent ou peuvent ne pas refléter les changements dans l'abondance des protéines à l'état stable) peuvent être suivis dans le temps.

Chase cycloheximide est adapté pour analyser la stabilité des protéines sur un parcours de temps relativement court ( à savoir, jusqu'à deux heures). Au cours de plus de temps courses (c. -à- deux heures à quelques jours), cycloheximide, un inhibiteur global de la traduction, est toxique pour les cellules, probablement en raison de l' épuisement de l' ubiquitine 56. En outre, les analyses de la stabilité des protéines sur de longues plages de temps sont plus susceptibles d'être compromises par les effets indirects de la synthèse des protéines ayant une déficience au niveau mondial sur la dégradation de la protéine d'intérêt (par exemple, la dégradation d'une protéine courte durée impliquée dans la dégradation de la protéine intérêt). D'autres techniques, telles que la chasse d'impulsion des expériences de marquage métabolique, sont donc mieux adaptés à l'étude de la dégradation des protéines longue durée de vie et peuvent être effectués pour corroborer les résultats obtenus dans des expériences de chasse de cycloheximide.

Le moment de l'addition de cycloheximide et la collecte de cellules est une considération importante dans cette procédure. La précision est particulièrement importante dans l'analyse des protéines très courte durée de vie, comme de petits écarts dans le temps écoulé depuis cycloheximide addition à la récolte des cellules peut avoir un impact important sur la cinétique de dégradation apparente. En outre, sans un plan clair pour l'exécution de ces étapes sensibles au facteur temps, une expérience peut déléguer rapidement dans le chaos et la frustration. Pour cette raison, il est recommandé d'ajouter cycloheximide aux cultures prévues, à intervalles réguliers. intervalles de 30 s sont suggérées dans ce protocole, mais le calendrier peuvent être ajustés en fonction du niveau de confort et la dextérité de l'enquêteur. les enquêteurs débutants peuvent trouver utile d'écrire un horaire de collecte d'échantillons avant de lancer l'expérience et de rayer chaque collection prévue comme cela se produit.

Dans les étapes 1.7 et 1.8 du protocole décrit ici, les cultures de cellules de levure sont concentrées dans des volumes réduits de milieu de croissance pour faciliter la manipulation au cours de la procédure de poursuite de la cycloheximide ultérieure. Cependant, la centrifugation des cellules de levure induit rapidement certaines réponses au stress cellulaire (par exemple, les voies de signalisationsont activés par le glucose privation) 57,58. Les enquêteurs sont donc mis en garde contre de longues périodes de centrifugation. Lors de l'analyse de la stabilité des protéines qui peuvent être sensibles à la centrifugation, les enquêteurs peuvent ajouter cycloheximide directement aux cultures en phase mi-log sans centrifugation préalable. Dans de tels cas, le cycloheximide doit être ajouté à la même concentration finale (250 pg / ml) et des échantillons de cellules de levure peut être récolté par les méthodes qui ne nécessitent pas une étape de centrifugation initiale (par exemple, une filtration rapide) 57. En outre, dans les étapes 02.03 à 02.05, les échantillons prélevés à chaque point de temps sont transférés à une solution contenant de l'azoture de sodium et placé sur la glace. Ces conditions inhibent la dégradation des protéines ont continué pendant toute la durée de la chasse. Il convient de noter que l' azide réduit la concentration cellulaire d'ATP 59, ainsi inhiber spécifiquement l'activité des protéases dépendantes de l' ATP. Alors que la température réduite si unLSO réduire la vitesse à laquelle non-ATP-dépendant fonction des processus protéolytique, les chercheurs qui étudient les protéines dégradées par de tels mécanismes peuvent également choisir de snap-gel culots de cellules dans l'azote liquide que chaque échantillon est récolté.

Un protocole d'échantillonnage pour la lyse cellulaire et un protocole représentatif de western blot inclus dans ce manuscrit ont été adaptés à partir des rapports précédents 16,40. Dans la méthode de la lyse alcaline post décrit ici, NaOH prétraitement améliore l'extraction des protéines de levure lors de l'addition ultérieure d'un tampon d'échantillon de Laemmli. Le mécanisme par lequel cette amélioration se produit est mal caractérisée 40. Cependant, les polysaccharides tels que ceux trouvés dans les parois cellulaires de levure sont solubilisés dans 60 conditions alcalines. Il est donc tentant de spéculer que l' incubation en présence de NaOH partiellement ou totalement sphéroplastes de cellules de levure ( par exemple, élimine les composants de la paroi cellulaire), ce qui les rend plus sensibe au SDS détergent présent dans le tampon d'échantillon de Laemmli. Parce que les protéines sont libérées dans des conditions fortement dénaturantes, les inhibiteurs de protéase ne doivent pas être inclus dans le tampon d'échantillon de Laemmli. Le procédé spécifique de lyse cellulaire peut être modifié comme il convient pour une expérience donnée. Par exemple, la méthode de la lyse alcaline post ne peut pas convenir pour les protéines de faible abondance ou de protéines qui sont mal détectées par Western Blot. Dans de tels cas, les méthodes qui incluent une étape de précipitation de l' acide trichloroacétique à concentrer les échantillons de protéines peut être la plus appropriée 61. En outre, plusieurs considérations importantes relatives à la sélection d'anticorps, le chargement de choix de contrôle, et d'autres moyens de détection (par exemple, chimioluminescent western blot en utilisant des systèmes de films ou d' imagerie numérique) ont été récemment discuté 16. Quantification de l'abondance des protéines après un traitement cycloheximide peut être effectuée. De nombreux systèmes d'imagerie sont vendus avec des logiciels qui facilitentcette analyse.

poursuite de la cycloheximide peut être mis en oeuvre pour analyser la dégradation d'une variété de protéines de levure et peut être adaptée pour étudier la stabilité des protéines dans d'autres cellules eucaryotes. Comme décrit dans ce protocole, le traitement cycloheximide est suivie par la lyse des cellules et la détection de la protéine abondance par analyse western blot. Selon l'application, cependant, l'abondance de protéines après un traitement de cycloheximide peut être évaluée par une gamme de techniques, le cas échéant pour les objectifs de la recherche. Par exemple, si la taille de la protéine est pas un facteur pertinent pour l' analyse, les lysats cellulaires peuvent être soumis à dot blot ou un dosage immuno (ELISA) Analyse enzymatique, lequel rapport sur ​​la protéine abondance, mais pas de poids moléculaire apparent 62. Pour les protéines à la surface cellulaire (ou protéines marquées par fluorescence interne internes), cytométrie de flux peuvent être utilisés pour quantifier l' abondance des protéines des échantillons à différents moments après l' addition de cycloheximide 51. Fluomicroscopie rescence traitement cycloheximide suivante serait de fournir des informations à la fois sur l' abondance des protéines et la localisation 18. La gamme de substrats, des organismes et des applications en aval se prêtent à la chasse de cycloheximide rend la technique un moyen très polyvalent et informatif d'étudier la dégradation des protéines.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

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Biochimie numéro 110, La levure bourgeonnante mutants endoplasmique dégradation du réticulum associée la dégradation des protéines chase cycloheximide translocon système ubiquitine-protéasome
L&#39;analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em
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Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

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