Summary
Le collagène est une composante essentielle de l'ECM, et fournit des indices essentiels pour plusieurs processus cellulaires allant de la migration vers la différenciation et la prolifération. Pourvu ici est un protocole pour l'intégration des cellules dans les hydrogels de collagène 3D, et une technique plus avancée pour générer des matrices de collagène randomisées ou alignées à l'aide de microcanaux PDMS.
Protocol
1. Neutralisation, Dilution et Polymérisation de collagène Solutions pour la 3D Investigation et cellulaires Contraction Assays
- Sur la glace dans stérile culture de tissus capuche, neutraliser le collagène (1: 1) avec stérile glacée 100 mM HEPES dans 2x PBS, pH 7,4, dans un tube de 15 ml conique. Bien mélanger avec une pipette en plastique jusqu'à ce que la solution est homogène et des tourbillons de mélange ne sont plus visibles. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air pendant le processus de mélange. Stockez brièvement sur la glace.
- Diluer le collagène neutralisé à la concentration appropriée avec des milieux cellulaires (tels que le milieu RPMI, DMEM, etc.).
- Pour calculer la quantité de collagène neutralisé nécessaire pour compenser la concentration de collagène désirée, utiliser l'équation N = (D * V) / (S / 2), où N est quantité de collagène neutralisé nécessaire, D est la concentration de collagène souhaitée, V est le volume final de la concentration désirée de collagène, et S est un groupe til concentration de départ stock collagène.
- Afficher la quantité de collagène neutralisée au volume par addition d'une solution de cellules et des milieux cellulaires. Bien mélanger et stocker sur la glace jusqu'à ce que prêt à lancer.
- Exemple: pour un gel à 2 mg / ml dans un volume de gel de 1 ml (volume typique d'un moulage en gel dans 6 puits de plaque ou de 50 mm de verre plat en bas), d'abord multiplier la concentration désirée (2 mg / ml) par le volume final désiré (1 ml). Prenez ce nombre (2 mg) et le diviser par la moitié de la concentration en actions cotées sur la bouteille (9,49 mg / ml). Dans ce cas, 0,42 ml de collagène neutralisé sont dilués avec 0,58 ml de mélange / support de cellules.
- Pipet le collagène / cellule / mélange des médias de la glace soit dans une culture non-tissu traité plaque à 6 puits ou un verre plat en bas de 50 mm. Utilisez la pointe de la pipette pour répartir uniformément la solution.
Remarque: il est important d'utiliser une culture non tissulaire plaque traitée pour réduire au minimum la fixation ou la croissance des cellules en dehors de la collagen gel. - Permettre de polymériser à la température ambiante pendant environ 10 - 15 min. Les gels doivent devenir opaque lors de la polymérisation.
- Après qu'il a tourné opaque, déplacer assiette ou un plat à 37 ° C pendant encore 45 - 60 min pour terminer la polymérisation.
- Après 45 - 60 min, ajouter 2 - 3 ml de milieu et de libérer les gels des parois du puits en exécutant une pointe p200 de pipette autour du périmètre du bien ou un plat. Antenne Agiter doucement pour libérer le gel. Le gel de collagène doit être flottant dans un milieu.
2. Western blot, Cell morphogenèse et Gel Gontractility Assay
- Pour évaluer les niveaux de protéines, la morphologie ou la contractilité cellulaire par rapport à la rigidité ECM, commencer par coulage des gels de collagène, selon 01.01 à 01.06, ensemencé avec des cellules pour une 7 - essai de 10 jours. Déterminer chaque taux d'ensemencement de la lignée cellulaire empiriquement en fonction de taux de croissance et la confluence. Pour un essai de 10 jours, la densité d'ensemencement peut varier de 20.000 - 100.000 cellules / gel.
- Mesurerla contractilité cellulaire, mesurer le diamètre de gel à l'aide d'une règle ou d'une caméra toutes les 24 h ou à l'intervalle de temps approprié.
Remarque: En outre, les images correspondantes collectées à partir d'un microscope peuvent être examinés pour rechercher des caractéristiques morphologiques caractéristiques de la lignée cellulaire ensemencée dans le gel, telles que les structures en forme acini, tubules épithéliaux, des saillies cellulaires et lameliapodia. - Pour évaluer les niveaux de protéines, lyser les gels dans RIPA tampon et le processus d'analyse par Western blot de protéines d'intérêt , comme décrit dans Wozniak et al. 17 et Gallagher et al. 18.
- IMPORTANT: Dans les comparaisons de la contractilité entre les lignées cellulaires, de normaliser la contractilité à l' ADN total, qui peut être extrait à partir des gels tel que décrit par Lui, et al 19, ou à une invariables, protéine de ménage (histones, GAPDH, etc.) par Western. Une analyse par transfert, comme décrit dans Wozniak et al. , 17 et Gallagher et al. 18. Si le comptage des cellules dans le gel en utilisant un hémocytomètre, assurez-vous de normaliser le nombre de cellules à la surface totale de gel que le gel contractant se concentrera cellules.
- gels d'alimentation tous les 3 - 4 jours en enlevant 1 ml de milieu et de le remplacer par 1 ml de milieu frais. Assurez-vous de nourrir gels après la mesure est considérée comme l'ajout de milieu frais / sérum provoque un pic dans la contractilité.
3. Génération de PDMS microcanaux pour l'alignement de collagène fibre
Remarque: Pour générer des matrices de collagène alignées, un moule pour PDMS microcanaux (figure 2A) nécessite un maître de silicium SU-8 réalisé par lithographie douce 15.
- Pour les canaux de PDMS, mélanger soigneusement PDMS dans une tasse jetable avec un bâtonnet. Pour un maître de silicone de 6 pouces, mélanger 20 g de base d'élastomère avec 2 g d'agent de durcissement.
- Dégazer le mélange PDMS en plaçant le gobelet jetable dans une chambre à vide sous une pression de vide550 mm de Hg. De gaz pour les 1 - 1,5 h.
- Alors que de dégazage les PDMS, préparer le maître de silicone pour la coulée. Préparer en plaçant une feuille de film transparent sur une plaque suivie par le maître de silicone. Assurez-vous que le moule de microcanaux vers le haut.
REMARQUE: Pendant PDMS coulée et le durcissement, le maître de silicone sera prise en sandwich entre deux feuilles de film transparent. - Après 1 à 1,5 h, retirer les PDMS de-gazés de la chambre à vide, et verser lentement sur le maître de silicone.
IMPORTANT: Éviter les bulles d'air. Continuer à verser dans le centre de maître, et permettre à la gravité de l'étaler uniformément.
NOTE: La baisse PDMS n'a pas besoin de prolonger tout le chemin vers le bord du maître. - Après PDMS a été versé sur le maître, appliquer une deuxième feuille de film transparent au-dessus du maître de silicone et PDMS. Soigneusement, rouler la seconde feuille de transparence sur le dessus du maître PDMS / silicone pour éviter les bulles d'air. Ne vous précipitez pas. PDMS doivent maintenant être réparties uniformément omaître ver.
- Placez délicatement une feuille de caoutchouc sur le dessus de la transparence, suivie d'une "feuille acrylique 1/8.
- Ajouter trois 10 lb poids sur le dessus de la feuille acrylique. Dans un premier temps, les poids seront "flotter". Leur permettre de régler et de stabiliser avant d'aller plus loin.
- Réglez la température de la plaque chauffante à 70 ° C et la guérison PDMS pendant 4 heures. Laisser refroidir pendant au moins 1 heure supplémentaire avant de déranger.
- Retirer délicatement la feuille supérieure de film transparent de la plaquette, et enlever les canaux avec une pince.
- Magasin dans un plat sans poussière avant d'être prêt à utiliser.
4. Prepping PDMS microcanaux d'emploi
- La place des canaux à l'envers sur le nouveau film de transparence propre,. Nettoyez tous les ports (Figure 2b) en utilisant un mouvement circulaire avec une forte pince. Retirez tous les fragments de PDMS.
- canaux propres à l'aide d'un morceau de ruban adhésif d'emballage comme un chiffon collant. Appliquer du ruban à la surface du banc (côté collant vers le haut), puis régler le canal on top. Appuyez sur les canaux avec bout rond de pince pour assurer un bon contact. Retirez et répéter sur les deux côtés jusqu'à ce que les débris visibles est enlevé.
- Transfert nettoyée, préparée canaux PDMS dans un cône de 50 ml avec 70% EtOH. Vortex à la vitesse maximale pendant 30 secondes. Jeter EtOH et remplacer avec des produits frais 70% EtOH. Conserver dans 70% EtOH jusqu'à utilisation.
- Dans le tissu hotte de culture et en utilisant des techniques d'asepsie, transférer les canaux de PDMS à un couvercle en verre propre et stérile ou en verre plats de fond. Mettez le canal vers le haut et UV traitement jusqu'à ce que EtOH a évaporé.
- Une fois sec, retournez les PDMS afin que les canaux sont orientés vers le bas vers la lamelle. Appuyez sur le canal PDMS vers le bas sur le verre pour faire une bonne étanchéité. Ajouter un patch de PDMS stériles pour couvrir / fermer le centre port (port B, Figure 2b). Laisser sécher complètement avant de poursuivre.
- Précouche à l'intérieur du canal avec 10 pg / ml de collagène dans de l'eau stérile. Pour revêtir, placer une gouttelette de 100 pi sur le sommet d'une channel, et tirer au travers avec le vide. Au bout de 1 h à 37 ° C, les canaux de transfert remplis de solution de revêtement de collagène pour un réfrigérateur. Réfrigérer pendant environ 15 - 30 min.
- Éliminer la solution de revêtement de collagène avec aspiration ou d'une pipette, et pour commencer la préparation de collagène.
5. Collagène Préparation à l'utilisation dans des microcanaux
- Sur la glace, neutraliser le collagène (1: 1) avec de la glace à froid 100 mM HEPES dans 2x PBS, pH 7,4. Bien mélanger jusqu'à homogénéité (Pour plus de détails, voir la section 1.1).
- Diluer collagène neutralisé aux concentrations appropriées avec les médias de la cellule (Pour plus de détails, voir la section 1.2). Incuber pendant 15 min sur la glace.
- Dans le même temps, froid canaux sur la glace monté.
NOTE: Le but est d'avoir tous les composants pour le processus de canal à 4 ° C ou moins. Collagène température et le temps nucléation sont des paramètres clés du processus de polymérisation, et peut être le point de départ pour une optimisation plus poussée, si nécessaire. - Count cellules avec un hémocytomètre et resuspendre à la densité de semis appropriée à ce moment. Pour la facilité de calcul, la remise en suspension à 1 - 3 millions de cellules / ml. (Pour plus de détails, voir également la section 2.1).
- Une fois que les cellules ont été comptées et 15 min ont passé, procéder au collagène de coulée.
6. Verser alignés et Random collagène microcanaux
- Avant de dessiner le collagène à travers des canaux, ajuster et régler la pression à vide avec un régulateur de vide en ligne. la pression de vide fournit la force pour induire et contrôler le débit d'écoulement du collagène, qui détermine le degré d'alignement.
- Pour les matrices aléatoires ou non alignés, utilisant un large canal (3 mm de large x 200 um de hauteur) avec une pression de vide de 10 mm Hg ou moins.
- Pour les matrices alignées, utiliser le canal étroit (1 mm de largeur x 200 um de hauteur) avec une pression de vide de 60 mm Hg ou plus.
- Supprimer la chaîne montée de la glace et placer sur surface propre, aseptisée de flux laminaire hood.
- Travaillez rapidement et charger 120 - 150 pi de collagène neutralisé dans le port A (Figure 2b).
- Tirer le collagène dans le canal en plaçant un 25 ml de pipette attaché à la canalisation à vide au- dessus de l' orifice C (figure 2b). Dessinez le collagène par le biais d'un seul mouvement uniforme. IMPORTANT: Pour les matrices aléatoires ou non alignés, dessiner collagène lentement à travers le canal (environ 0,5 à 1 mm par seconde), et arrêter une fois qu'il atteint la fin. Pour les matrices alignées, dessiner le collagène dans plus rapidement, mais prendre soin d'éviter les bulles d'air.
- Retirez soigneusement l'excès de collagène de la région portuaire avec Pipetman P200 ou aspirateur.
- Placez PDMS patchs stériles sur les deux ports A et C. Tous les ports doivent maintenant être couverts.
- Après 2 - 3 minutes, retirez centre correctif PDMS (port B) et ajouter 2 - 3 pi de cellules (5 - 10 000 cellules) dans le port central. Laisser polymériser partiellement (tourner opaque) à la température ambiante pendant 10 - 15 min.
- Au bout de 10- 15 min, transfert à 37 ° C pendant plus de 15 - 30 minutes pour terminer la polymérisation. Oter les couvercles PDMS et ajouter des médias pour couvrir complètement les cellules de canal et de la culture au besoin. Les cellules peuvent être alimentées par la suppression d'un ml d'anciens supports, et en le remplaçant par un ml de nouveaux supports.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alors que les tests 3D peuvent être faits dans la même rigidité de gel de collagène, de faire varier la rigidité du gel peut être utilisée pour déterminer comment les cellules répondent à des changements mécaniques dans leur microenvironnement cellulaire. Un hydrogel de collagène rigide est défini comme un gel dans lequel les cellules incorporées ne sont pas capables de contracter localement le collagène environnant. La contractilité intrinsèque des différents types de cellules est unique, et il est donc préférable de commencer avec une courbe de contractilité simple pour déterminer la concentration de collagène qui sera détecté comme conforme et raide.
Commencer en maintenant le nombre de cellules et la constante augmentation de la concentration du gel de collagène. La rigidité du gel va évoluer de façon exponentielle avec la concentration, comme indiqué précédemment 10,20. Un exemple représentatif d'un essai de contractilité est représenté sur la figure 1. Ici, les cellules 4T1 50.000 sont noyées dans eithera 2 mg / ml ou 3,5 mg / ml de gel de collagène pendant 5 jours. La lignée cellulaire 4T1 est une très contractile, la ligne du cancer métastatique, mais est seulement capable de contracter le gel à haute densité d'environ 10% (figure 1a, c). Ce faible niveau de contraction est typique pour une classification de gel rigide. Des gels à faible densité comparables (2 mg / ml, la figure 1b, c) sont contractés 57% (n = 4) pendant le même laps de temps. Il est important de noter que l'augmentation de la quantité de ligand de collagène peut influer sur les voies de signalisation cellulaire, par conséquent, un second moyen pour faire varier la raideur est de maintenir constante la concentration de collagène et de comparer les gels qui sont retenus (rigides) en étant laissée fixée à la partie inférieure de le plat ou contractile (conforme) parce qu'ils ont été libérés à flotter librement dans le milieu cellulaire. Cela peut servir comme un bon contrôle afin de déterminer si des changements dans la signalisation cellulaire résultent de l'augmentation du ligand du collagène ou de la rigidité de la matrice.
Une fois que la maîtrise de l'incorporation des cellules dans des matrices 3D est obtenue, les dosages peuvent être modifiés pour modifier l'organisation et l'orientation des fibres de collagène. Ceci est réalisé par l'utilisation des canaux microfluidiques PDMS (figure 2). Aux fins de ce manuscrit, deux conformations similaires ont été utilisées, étroite et un canal large, avec des ouvertures ou des orifices 3 (figure 2b). Dans une expérience typique pour déterminer la réponse cellulaire au hasard par rapport aux matrices alignées, le collagène non polymérisé est aspirée à travers le canal microfluidique de l'orifice A à l'orifice C avec des cellules étant ajouté au port B. Le degré d'alignement du collagène est modulée en fonction du taux de collagène flux tels que les taux d'écoulement de collagène supérieur donnent un meilleur alignement. L'utilisation de canaux plus étroits couplé avec une plus grandedes pressions de vide améliore l'alignement du réseau de collagène, tandis qu'un canal plus large est utilisé conjointement avec de faibles pressions de vide génère des matrices aléatoires. L'organisation du réseau fibrillaire peut être visualisée par génération de second harmonique, tel que représenté dans les images représentatives (figure 2c, d). Dans ces images, les fibres de collagène (indiquées par les flèches et pseudocolored en violet) aligner de manière plus cohérente avec l'axe d'écoulement de collagène dans les canaux étroits (figure 2d). Les fibres de collagène dans des canaux larges ont une variété d'orientations, et ont une distribution plus aléatoire (figure 2c).
La différence entre les canaux larges et étroites est perceptible à l'oeil humain, mais peut également être analysé par un logiciel développé spécialement pour l'analyse des fibres. CT-FIRE, un open source et le logiciel librement disponible, utilise un algorithme basé curvelet-pré-traitement suivi parun algorithme d'extraction des fibres de quantifier l' angle de la fibre, l' épaisseur, la longueur et la rectitude 21. Pour chaque condition, plus de 500 images ont été échantillonnées au hasard à partir de différents endroits dans les canaux, et plus de 125.000 fibres ont été extraites et analysées par CT-FIRE. L'histogramme d'angle de fibre ultérieure généré pour les canaux étroits (Figure 2f) montre un enrichissement clair de fibres orientées parallèlement à la direction de l' écoulement. En revanche, les canaux larges ont une distribution angulaire de la fibre plus équivalente (figure 2e) , qui est compatible avec une matrice plus aléatoire.
Surtout, l'utilisation de dispositifs microfluidiques, comme une technique pour contrôler l'organisation et l'orientation des fibres de collagène, permet l'évaluation de diverses réponses cellulaires à des conditions de matrice modifiées. Par exemple, Sung et al. a déterminé que la viabilité des fibrobasts mammaires humaines dépend de la fibre de collagène.15 De plus, des travaux récents dans notre laboratoire démontrent que les cellules de carcinome du sein migrent plus persistante sur les fibres de collagène alignées par rapport aux matrices de collagène aléatoires. 3 Ces résultats aident à mieux définir le rôle du micro - environnement dans le cadre de la biologie mammaire et le cancer du sein. Aller de l'avant, la possibilité de contrôler précisément le microenvironnement cellulaire 3D permettra la poursuite des recherches de réponses cellulaires importantes dans le contexte de nombreux états pathologiques.
Figure 1. 3D collagène Gels pour la cellule de mesure contractilité et les réponses cellulaires à l' ECM Rigidité. 4T1 cellules ont été étalées dans les deux (A) 3,5 mg / ml et (B) 2 mg / ml de gels de collagène et on a laissé croître pendant 5 jours. Au fil du temps, le gel de collagène (zone grisedans la ligne pointillée) contracteront et le diamètre est mesuré et quantifié (c, test t de Student, les barres d'erreur +/- SD). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Génération aléatoire et alignés collagène Matrices Utiliser PDMS microcanaux. Une tranche de six pouces de silicium (a) a été utilisé comme modèle pour PDMS à la fois larges et étroites microcanaux (b). Les concentrations de collagène identiques ont été tirées à travers les deux types de canaux et des fibres individuelles (pointes de flèches, c, d) aligner la direction d'écoulement (flèches) dans des micro - canaux étroits (D). microcanaux larges ont donné des matrices plus aléatoires. Fiber angles par rapport au fond de l' image ont été comptées et représenté en (e) et (f). Barre d'échelle = 26 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
gels de collagène 3D sont un ajout précieux à notre boîte à outils pour comprendre comment les cellules interprètent et répondre à leur microenvironnement local. Ce manuscrit a fourni un protocole très simple pour l'intégration des cellules dans une matrice de collagène 3D et pour générer de manière reproductible des matrices de fibres de collagène ou aléatoires alignées. Les deux protocoles fonctionnent comme des plates-formes adaptables où les différentes isoformes de collagène, des agents de réticulation, ou d'autres protéines de la matrice pourraient être ajoutés au moment de la polymérisation. Il est également facile de modifier les plates-formes pour évaluer les différents délais et paramètres pour l'expression génique et la production de protéines. Imaging, l'évaluation des protéines et des niveaux d'ARN, et les profils métaboliques de lecture sont très compatibles avec ces techniques 3D.
Comme cela est important dans toutes les techniques, il est important d'évaluer la qualité du gel et de dosage. Un signe d'un bon gel de collagène de qualité est celui qui peut gérer la manipulation manuelle. Par exemple, 1 ml [1 mg / ml] Gel de collagène versé dans une plaque à six devrait être facilement capté avec une pince et manipulée. Si les larmes de gel ou de fragments, la qualité du gel est suboptimale, et des mesures doivent être prises pour améliorer la polymérisation du collagène. La température et le pH sont les paramètres les plus importants nécessaires à une bonne formation de fibres et de gélification. Commencez le processus de dépannage en vous assurant que tous les composants sont conservés sur de la glace jusqu'au moment de la gélification se produise. Il est également très important de veiller à ce que le tampon de neutralisation et de collagène solution mère sont bien mélangés. Ensuite, vérifier que le pH du tampon de neutralisation est à un pH de 7,4. Un tampon HEPES PBS est recommandée car elle est très compatible avec la culture de tissus, a une large zone tampon, et des solutions d'achat d'actions ont tendance à être très stable à 4 ° C pendant de longues périodes de temps. Il a également l'avantage supplémentaire de produire plus de fibres, plus incurvées qui sont plus semblables à l'état physiologique 15. NaOH est un autre commoeul a utilisé une solution de neutralisation, mais doit être titré plus étroitement. Il semble aussi avoir pour effet de produire plus courtes, des fibres plus épaisses 15. Quoiqu'il en soit, le pH du collagène neutralisé doit être à un pH de 7,4. Si toutes ces conditions sont satisfaites, et l'intégrité des gels est toujours pas satisfaisante, le problème réside dans la solution mère de collagène. Bien que la solution mère de collagène a une durée de vie cotée de 6 mois à 4 ° C, nous avons constaté qu'il est généralement plus courte que les sources commerciales affirment lorsqu'il est utilisé pour les gels 3D. Jeter la vieille bouteille, et l'ordre d'un nouveau lot. Il est pas rare que la qualité du collagène du fabricant pour faire varier de manière significative d'un lot à.
En plus d'identifier des gels de collagène de qualité, il est également important d'identifier les étapes qui sont essentielles pour la production d'un bon alignement au sein du microcanal PDMS. Le principe de cette technique est que le taux de Collécoulement agen à travers les microcanaux induit ensuite l'alignement du filament. Par conséquent, l'étape la plus critique dans le contrôle du degré d'alignement des fibres est bonne modulation de la pression de vide. Pour l'alignement du collagène aléatoire dans un micro-canal, la pression de vide doit être faible, et le collagène doit couler lentement le long du canal. Si le collagène coule trop rapidement, les fibres commencent à aligner. Un canal plus large rend cette proposition plus facile. Par contre, pour un bon alignement du collagène, des pressions de vide plus élevés doivent être utilisés, et la solution de collagène doit être tiré à travers plus rapidement. Une deuxième étape critique dans la production de matrices alignées est la température. Il est très important de vous assurer que tous les composants et solutions sont refroidies sur de la glace avant de l'utiliser. Si les canaux ne sont pas refroidis avant de les utiliser, le collagène dans les canaux va polymériser trop rapidement, et se traduira par des fibres plus petites plus minces. Si le collagène neutralisé est refroidi à 4 ° C et non pas sur la glace, le enhanced nucléation donnera lieu à des diamètres de fibres plus grandes qui sont plus difficiles à aligner par le flux. Il est également important de refroidir le micro-canal lui-même. Sans refroidissement préalable, le petit volume de collagène se réchauffe très rapidement donnant des résultats médiocres.
Les microcanaux de collagène sont une technique très utile, mais il y a certaines limitations. D'une part, l'alignement dans un microcanal induites par l'écoulement est jamais parfait, et ne sera jamais égale à une technique d'alignement induite par déformation. Il y aura toujours des fibres orientées perpendiculairement à la direction de l'écoulement, mais la reproductibilité, l'adaptabilité et la facilité d'utilisation l'emportent sur les petites variations dans l'alignement dans le canal. Plus important encore , les cellules ont été montrés pour détecter efficacement les petits changements dans l' alignement, et de répondre à la migration plus persistante dans ces canaux 3,15. Les cellules permettra également d'améliorer l'alignement du canal que leur nombre augmente et ils commencent à migrer. Si un plus grand alignement is requis, les microcanaux PDMS peuvent facilement être modifiées à des dimensions plus étroites ou d'avoir de petites constrictions pour améliorer l'alignement. Tous deux ont été montré pour être efficace, mais ont d' autres compromis associés 16. Une autre limitation de la technique à microcanaux est que le canal de PDMS a peu la perméabilité à la drogue ou des colorants fluorescents. Cela signifie que ces composés doivent se diffuser dans le canal à partir des orifices, ce qui est étonnamment faible, et peut poser des difficultés à se laver des traitements.
Bien qu'il existe certaines limites à cette plate-forme de microcanaux, elle offre plusieurs avantages par rapport aux techniques existantes. Il est plus accessible expérimentalement car il ne nécessite pas d' instruments encombrants 3,13 ou de petites populations de cellules pour produire l' alignement. Elle ne nécessite pas des billes magnétiques exogènes 13,14 qui tendent à être autofluorescente et pourrait réticuler artificiellement le réseau de collagène. Le microcanal de collagène estaussi tout simplement plus rentable et économique. En plus des avantages actuels, il a également de nombreux avantages qui pourraient être mises à profit dans les applications futures. Pour l'un, le microcanal de collagène peut être conçu ou modifié dans presque toute configuration ou de l'expérience. Conceptions avancées permettent les canaux pour créer des tubes de collagène creux ou structures 3D pour imiter l'architecture des organes ou des tumeurs 22 simplifiées. En outre, les canaux peuvent être réalisés dans des matériaux autres que des PDMS. Cela pourrait transmettre des propriétés mécaniques différentes aux réseaux de collagène embarqués ou des matrices. Enfin, la faible quantité de réactifs utilisés pour cet essai peut également rendre attrayante et économique pour les écrans à haut débit plus petites.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les numéros de subvention UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 et T32-GM008692-18 pour le financement de ce travail. Nous reconnaissons également Jeremy Bredfelt et Yuming Liu de LOCI pour le développement et l'assistance à l'analyse CT-FIRE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M.
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
- Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
- Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
- Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
- Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
- Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).
