Abstract
خلال تطوير عوامل فعال في الأوعية الجديد، مراقبة ضغط الدم الشرياني هو أمر حاسم لتقييم فعالية الأدوية الجديدة المقترحة. في الواقع، والبحوث التي تركز على اكتشاف الأهداف العلاجية الجديدة المحتملة باستخدام الفئران المعدلة وراثيا يتطلب موثوق بها، تقييم طويل الأجل من الضغط الشرياني الجهازي الاختلاف. حاليا، عن معيار الذهب للحصول على القياسات طويلة الأجل لضغط الدم في الفئران المتنقلة يستخدم زرع راديو الإرسال، والتي تتطلب إقناء؛ إدخال القنية الشريان. هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى الربط، تقييد، أو التخدير الحيوانات الذي يعرض التوتر والقطع الأثرية أثناء أخذ العينات البيانات. ومع ذلك، الشرياني مراقبة ضغط الدم في الفئران عن طريق القسطرة يمكن أن يكون تحديا بدلا نظرا لصغر حجم الشرايين. هنا نقدم دليل خطوة بخطوة لتوضيح الممرات الرئيسية حاسمة لزرع تحت الجلد الناجح لراديو الإرسال والشريان السباتي جannulation في الفئران. نحن تشمل أيضا أمثلة من النشاط ضغط الدم على المدى الطويل المأخوذة من الفئران تتحرك بحرية بعد فترة من التعافي بعد الجراحة. وبعد هذا الإجراء يسمح التسجيلات ضغط الدم مباشرة موثوقة من الحيوانات متعددة في وقت واحد.
Introduction
ارتفاع ضغط الدم هو واحد من عوامل الخطر الرئيسية لأمراض القلب والأوعية الدموية، ويمكن القول أنها مشكلة صحية عامة رئيسية في كل من البلدان المتقدمة والنامية 1. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية من ارتفاع ضغط الدم تجريبي لتقليد ردود ارتفاع ضغط الدم مثل تلك التي لوحظت في البشر 2. من بين أمور أخرى، يمثل الماوس المتنقلة نموذجا ممتازا لدراسة نشأة وتطور ارتفاع ضغط الدم مما يسمح في التحليل المجراة من مغبة التعرض المزمن إلى ارتفاع ضغط الدم.
ضغط الدم قد ساعد (BP) للرصد في الفئران الباحثين لكشف العديد من الآليات التي تشارك في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لأمراض مثل ارتفاع ضغط الدم وفشل القلب 3 و 4. في الواقع، التلاعب في جينوم الفأر يسمح جيل المعدلة وراثيا أو النماذج التي تستهدف الجينات مناسبة لدراسة ارتفاع ضغط الدم 5، 6. ومع ذلك، وحتى التلاعب لطيفمن الفئران واعية يدفع الإثارة التي يمكن أن تساهم في دس القطع الأثرية خلال الحصول على البيانات، في حين ان استخدام التخدير أو المهدئات تؤثر تأثيرا عميقا ضغط الدم 7. هذه الجوانب مهمة للغاية ويجب أن تؤخذ في الاعتبار عند محاولة مراقبة BP على المدى الطويل.
هناك عدة طرق لتسجيل BP في الفئران، وتمت مناقشة المقارنة بين التقنيات الأكثر شيوعا المتاحة حاليا في أي مكان آخر 8 و 9. ومع ذلك، وخلصت التوصيات AHA لقياس BP أن قياس داخل الشرايين لشركة بريتيش بتروليوم ويفضل عموما بسبب قدرتها على قياس مباشرة BP على مدى فترة طويلة من الزمن 10. راديو القياس عن بعد إلى جانب القياس المباشر ضغط الدم هو طريقة للدولة من بين الفن لرصد الوظائف الفسيولوجية في مستيقظا ويتحرك بحرية حيوانات المختبر مع التقليل من التوتر والتحف المصاحب للبيئة 9 و 11.راديو القياس عن بعد يوفر القدرة على جمع ضغط الدم ومعدل ضربات القلب، درجة حرارة الجسم والنشاط حيوان من الحيوانات واعية متعددة تلقائيا.
على الرغم من أن هذه المنهجية أصبحت شعبية جدا في العديد من المختبرات، زرع راديو القياس عن بعد في الفئران يمكن أن يكون تحديا تقنيا. هنا نعرض بروتوكول خطوة بخطوة يوضح كيفية زرع محول الضغط في الفئران. والأسلوب الذي ينطوي على الإدراج تحت الجلد لجنة التحقيق في جسم الفأر، توجيه القسطرة في الرقبة وإلى الأمام بالقرب من قوس الأبهر عن طريق الشريان السباتي الأيسر. وأظهرت البيانات التي تم التقاطها عن بعد مباشرة على شاشة الحاسوب. يتم تخزين البيانات أيضا لتحليل "خارج الخط".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الأخلاق البيان: جميع الإجراءات الحيوانية المذكورة في هذا الفيديو المقالات التي تم مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة مركز العلوم الصحية ولاية تينيسي.
ملاحظة: استخدام أدوات معقمة المجهرية طوال العملية الجراحية. يمكن تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام معقم الأشعة تحت الحمراء في درجة حرارة تعقيم المثلى من 1500 درجة فهرنهايت (815.6 درجة مئوية). Telemeters يمكن إعادة استخدامها، ولكن، قبل إدراجه في الحيوان للتأكد من تعقيم الارسال بأكمله وفقا لتعليمات الشركة الصانعة والتي تم تعبئتها من طرف القسطرة مع هلام خاص المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
1. حيوانات التجارب
- الحصول على موافقة IACUC لجميع التجارب التي سوف يتم تنفيذها. بالتشاور مع IACUC المؤسسي ينصح بشدة بشأن متطلبات لاستخدام مسكن بعد العملية بعد هذا الإجراء.
- الحفاظ على الحيوانات في جالغرف التي تسيطر عليها limate وجود درجة حرارة الغرفة من 21 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60٪، وعلى بعد 12 ساعة ضوء الظلام دورة مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
ملاحظة: نظرا لأن جسم الفأر أن تستوعب التحقيق القياس عن بعد (بشكل تقريبي 1 سم قطر × 2 سم طويلة)، فمن الأفضل استخدام الفئران التي تزن 20 غراما أو أكثر.
2. التخدير وتحضير المنطوق
- وزن الماوس باستخدام مقياس الدقة وتسجيل وزنه. تأكد من التعامل مع الحيوان برفق وهدوء.
- وضع الحيوانات في غرفة تحريض وإغلاقه. تعيين معدل تدفق الأوكسجين عند 0.5 لتر / دقيقة ووضع تركيز الأيزوفلورين في 4-5٪.
- عندما يفقد وعيه الماوس، وضعه على لوحة ظاهرة الاحتباس هيئة الحفاظ على 36-37 درجة مئوية. الحفاظ على التخدير عن طريق الرؤوس مع مجموعة الأيزوفلورين في 2٪ (الحفاظ على معدل التدفق عند 0.5 لتر / دقيقة).
- إعداد مناطق العملية عن طريق إزالة الشعر من الجزء الخلفي من الرقبة وركان الجانب البطني من الرقبة عن طريق تطبيق كريم إزالة الشعر.
- علاج موقع شق مع 3 تطبيقات فرك الجراحية (حل betadine) بالتناوب مع 70٪ ايزوبروبيل.
3. جراحة
- ضع الماوس في موقف ضعيف. تحقق من ردود الفعل من قبل معسر القدم، وضبط التخدير حتى لا يكون هناك أي رد. تقديم حوالي 1 سم شق خط الوسط تحت رقبة الفأر مع مشرط. في الجانب الأيسر من قطع خلق مساحة تحت الجلد عن طريق فصل بعناية البشرة من النسيج الضام الكامنة.
- الوجه الماوس، واستخدام مشرط لجعل شق الجلد من حوالي 1.5 سم في الجانب الظهري خلفها لوح الكتف. إنشاء جيب تحت الجلد على طول الجناح الحيوان كبيرة بما يكفي لاستيعاب الجهاز. إدراج الارسال في الجيب.
- إدراج المشبك مرقئ صغير في شق الظهر والمناورة هو تحت الجلد نحو الجزء الأماميافتتاح الرقبة. باستخدام المشبك إدراجها-مرقئ، فهم بلطف أنبوب البولي ايثيلين غير سامة (4 سم طول × 1 مم ID).
- سحب مرقئ مرة أخرى من خلال نفق من شق الجانبي في الخلف حتى يبرز أنابيب من كل من البطن وظهري شق، والإفراج عن أنبوب من مرقئ. من الخلف، إدراج استشعار قسطرة في أنبوب إلى نفق غيض من القسطرة الاستشعار عن الضغط من خلال الرقبة. من الأمامي الرقبة، وسحب وإزالة أنبوب البولي اثيلين وإغلاق شق ظهري باستخدام مقاطع معدنية.
- بعناية فصل الغدد الفك السفلي باستخدام أدوات تطبيقها طرف القطن المعقم وسحب الغدة الفك السفلي الأيسر باستخدام ربط البقاء مرنة. باستخدام ملقط المنحنية غرامة الرؤوس، حدد موقع الشريان السباتي على طول الجانب الأيسر من القصبة الهوائية. الحفاظ على موقع الجراحية المعقمة عن طريق وضع وتأمين ثنى العقيمة.
- بعناية عزل السفينة من الأنسجة المحيطة بها وبلطف فصلالعصب المبهم (بيضاء اللون) التي هي على طول الشريان السباتي بعيدا عن الشرايين. يجب الحرص على عدم قطع أو تلف العصب أو الشريان.
- تمرير ثلاث قطع من غير قابل للامتصاص 7-0 خياطة تحت قسم الشريان السباتي معزولة. ربطة عنق خياطة الجمجمة لإغلاق تدفق الدم. سحب الخيط الذي هو أقرب إلى القص لانسداد مؤقت في تدفق الدم من الشريان الأورطي.
- جعل عقدة فضفاضة باستخدام خياطة الوسطى. وسوف تستخدم هذه لتأمين القسطرة في وعاء. قطع شق صغير في الشريان بين الجمجمة والغرز القصية باستخدام مقص الصغرى.
- انتزاع القسطرة مع ملقط إقناء؛ إدخال القنية السفينة الخاصة، والحرص على عدم الضغط على القسطرة لمنع فقدان جل من لجنة التحقيق. بلطف، والاستيلاء على الشريان مع طرف على ما يرام منحني الملقط الملقط، استرداد القسطرة، وأدخله في السفينة من خلال شق صغير.
- تشديد عقدة خياطة الوسطى حول الشريان ودفع بلطف القطheter. إطلاق سراح بلطف خياطة الجروح التي هي الأقرب إلى القص ومواصلة التقدم القسطرة نحو الشريان الأورطي عرضية.
- لاحظ علامة على القسطرة التي تعطي مؤشر تقريبي لمدى حاجة القسطرة لإدراجها. مرة واحدة يتم الوصول إلى نقطة، وتشديد بلطف كلا من الدنيا وخياطة العليا حول القسطرة. يتم تأمين القسطرة إلى الشريان السباتي عن طريق عقدة الخيط.
- إغلاق شق الجلد مع غير قابل للامتصاص 5-0 خياطة. مرة واحدة مغلقة، وختم الجرح بمادة لاصقة الأنسجة.
4. الجراحية الإنعاش وBP القياسات
- مراقبة الحيوانات عن كثب لعودة المواقف العادية والسلوكيات. خلال 24 ساعة بعد الجراحة تسكين فترة إدارة وفقا لتوجيهات من قبل طبيب بيطري الموظفين.
- وبمجرد أن الحيوانات قد تعافى (5-7 أيام بعد الجراحة)، إيوائهم بشكل فردي في قفص الفأر العادي وضعها على الجزء العلوي من لوحة القياس الاستقبال.
- تحويل آر مزروعansmitters "على" و "إيقاف" باستخدام جهاز مغناطيسي وضع لفترة وجيزة على مقربة من الحيوانات من خارج القفص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن الحصول على البيانات عن بعد بواسطة جهاز استقبال. وتصور آثار على شاشة الكمبيوتر لمراقبة الجودة (الشكل 1A). وترد تفاصيل مثل هوية الحيوان، ضغط الدم الانبساطي والانقباضي ضغط الدم أيضا (الشكل 1B). الشرايين BP يمكن تسجيلها بشكل مستمر (24/7)، أو لفترات مبرمجة قصيرة (أي 60 اكتساب ثانية كل ساعة). البيانات التي يمكن تخزينها تلقائيا في القرص الصلب لتحليلها لاحقا. بلغ متوسط تظهر بيانات ميزان المدفوعات من التسجيل المتواصل لمدة 3 أيام (الشكل 2)، فمن الممكن أن نقدر الاختلاف إيقاع الساعة البيولوجية بين دورة الظلام والضوء. تم حساب متوسط الاختلاف الضغط ومعدل ضربات القلب وتآمر ضد الزمن.
الشكل 1. الإقتفاء ضغط الدم النموذجية من 4 الفئران مختلفة المزروعة مع جهاز القياس عن بعد. (A) الإقتفاء تظهر التغييرات ضغط الدم الشرياني في الوقت الحقيقي (مم زئبق) على مدى فترة 5 دقائق. يتم الحصول على البيانات في وقت واحد من أربعة فئران بالغة مختلفة بعد 5 أيام الزرع. (ب) للبحث عن المفقودين في دقة أعلى الزمنية المستخرجة من A، فمن الممكن أن نقدر الدم الانبساطي الضغط الانقباضي والقيم، ومدة دورة BP، ومعدل ضربات القلب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويبين الشكل 2. الضغط على المدى الطويل الدم الشرياني الإيقاعي التغيير. ضغط البيانات المتوسطات توضح القيم (A) الانقباضي الضغط (SP)، (ب) الضغط الانبساطي (DP)، (C) متوسط الضغط الشرياني (MAP)، و (د) را القلبوأعرب الشركة المصرية للاتصالات في نبضة / دقيقة. تم استخراج البيانات من التسجيلات المستمرة التي اتخذت خلال النهار (دورة الخفيفة، L) أو ليلة (دورة الظلام، D). بدأ تسجيل 7 أيام بعد الجراحة. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SEM (ن = 4 الفئران). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تحسنت زرع راديو القياس بشكل كبير خلال العقد الماضي. أصغر حجم المسبار يجعل عملية الزرع أقل من صدمة للحيوان، وعمر البطارية لفترات طويلة يساعد على خفض التكاليف، والترددات مقياس البعد مستقلة قضاء الحديث المتبادل بين أجهزة الاستقبال. يعتبر القياس طريقة للدولة من بين الفن لجمع مجموعة متنوعة واسعة من المعلمات الفسيولوجية من التحرك حيوانات بحرية دون القطع الأثرية المرتبطة مع استخدام ضبط النفس، والتفاعل البشري، أو التخدير التي تتطلبها التقنيات الأخرى 8،9.
ومع ذلك، ترتبط بعض من مساوئ أسلوبه مع التكاليف الأولية للصك والبرمجيات. أجهزة الإرسال هشة وعرضة للتلف، والبطارية في نهاية المطاف لا نفاد الطاقة وتحتاج إلى استبدال. على الرغم من أن الشركة تقدم لتجديد تلك التحقيقات التالفة بتكلفة أقل، يمكن أن تكون تكلفة باهظة لبعض المختبرات.وعلاوة على ذلك، يمكن لهذا الإجراء أن يكون تحديا تقنيا ومطلوب ممارسة لتحقيق قياس BP موثوق بها. وأخيرا، هناك بعض بعد الجراحة المرتبطة الوفيات، والتي في أيدينا هو حوالي 5٪. هذا يمكن أن تزيد بشكل كبير إذا كان علاج محدد لابد من اختبارها أو إذا كان التلاعب الجيني يؤثر سلبا على الصحة الماوس.
العوامل الحاسمة التالية ضرورية لنجاح تنفيذ الإجراء: الحفاظ على ترطيب الأنسجة بمحلول ملحي معقم طوال الإجراء بأكمله. التعامل دائما الارسال مع عناية كبيرة. تجنب عقد من مستشعر الضغط لأن ذلك قد يتسبب في هلام ليتسرب أو تلف جهاز الإرسال. عند إدخال القسطرة وربطة عنق خياطة المركزية مع عقدة مزدوجة، وعدم القيام بذلك سيؤدي إلى القسطرة الخروج من السفينة. الطول المطلوب من القسطرة التي لابد من إدراجها في الشريان السباتي يمكن أن تتغير وفقا للسلالة الماوس والوزن المستخدمة في تلك particuدراسة لار. ولذلك، فإنه ينصح بشدة لتشغيل بعض التجارب الأولية لتحديد مدى عمق تحتاج القسطرة لإدراجها لتجنب انسداد الشريان الأورطي. وأخيرا، ومراقبة الحيوانات يوميا وتأكد من أن الجلد فوق مرسل لا تمتد أو نخرية. في حالة حدوث نخر تمديدها أو العدوى، والموت ببطء الحيوانات وفقا لسياسة مؤسسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
- Danaei, G., et al. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. PLoS Med. 6 (4), e1000058 (2009).
- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H.
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al.
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
