Abstract
Under utviklingen av nye vasoaktive midler, er arterielle blodtrykksmåling avgjørende for å vurdere effektiviteten av de nye foreslåtte stoffer. Faktisk forskning med fokus på oppdagelsen av nye potensielle terapeutiske mål ved hjelp av genetisk endrede mus krever en pålitelig og langsiktig vurdering av systemisk arterietrykk variasjon. Foreløpig gullstandarden for å oppnå langsiktige målinger av blodtrykket i ambulerende mus bruker implanterbare radiosendere, som krever arterie kanylering. Denne teknikk eliminerer behovet for deling, tilbakeholdende, eller bedøvelse dyrene som innfører stress og gjenstander i løpet av datasampling. Imidlertid kan arterielle blodtrykksmåling i mus via kateterisering være ganske vanskelig på grunn av den lille størrelsen av arteriene. Her presenterer vi en steg-for-steg guide til å illustrere de avgjørende viktige passasjer for en vellykket subkutan implantasjon av radiosendere og halspulsåren cannulation i mus. Vi har også eksempler på langsiktige blodtrykk aktivitet hentet fra fritt bevegelige mus etter en periode med post-kirurgi utvinning. Etter denne prosedyren vil tillate pålitelige direkte blodtrykk opptak fra flere dyr samtidig.
Introduction
Hypertensjon er en av de viktigste risikofaktorene for hjerte- og karsykdommer, kanskje det er et stort folkehelseproblem både i utviklede og utviklingsland 1. Flere dyremodeller for eksperimentell hypertensjon har blitt utviklet for å etterligne hypertensive reaksjoner som de som er observert hos mennesker 2. Blant annet den ambulerende musen representerer en utmerket modell for å studere dannelsen og utviklingen av hypertensjon slik in vivo-analyse av konsekvensene av kronisk eksponering for hypertensjon.
Blodtrykk (BP) overvåking i mus har bidratt forskere til å løse flere mekanismer som er involvert i fysiologi og patofysiologi av sykdommer som høyt blodtrykk og hjertesvikt 3, 4. Faktisk, manipulering av musegenomet tillot dannelse av transgent eller gen-rettet modeller er egnet for å studere hypertensjon 5, 6. Men selv milde manipulasjonav bevisst mus induserer excitements som potensielt kan introdusere artifakter under datainnsamling, mens bruk av beroligende eller beroligende midler dypt påvirke blodtrykket 7. Disse aspektene er spesielt viktig og må tas i betraktning når du forsøker langsiktig BP overvåking.
Det er flere måter å registrere BP i mus, og en sammenligning mellom de vanligste teknikker for tiden tilgjengelig har vært diskutert andre steder 8, 9. Imidlertid AHA anbefalinger om BP måling konkludert med at intra-arteriell måling av BP er generelt foretrukket på grunn av deres evne til direkte å måle BP over en lengre periode ti. Radiotelemetri kombinert med direkte måling av blodtrykk er state-of-the-art metode for overvåking av fysiologiske funksjoner i våken og fritt bevegelige forsøksdyr mens stress og miljø tilhørende gjenstander 9, 11 minimere.Radiotelemetri tilbyr muligheten til automatisk å samle blodtrykk, hjertefrekvens, kroppstemperatur og dyr aktivitet fra flere bevisste dyr.
Selv om denne metoden er blitt svært populært i mange laboratorier, kan radiotelemetri implantering i mus være teknisk utfordrende. Her viser vi en steg-for-steg-protokoll som viser hvordan å implantere en trykkgiver i mus. Teknikken innebærer subkutan innføring av sonden i musekroppen, kanal kateteret til nakken og videresende nær aortabuen via den venstre arteria carotis. Remotely fanget data vises live på dataskjermen. Data lagres også for "off-line" analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle dyre prosedyrene som er nevnt i denne video-artikkelen ble gjennomgått og godkjent av Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Universitetet i Tennessee Health Science Center.
Merk: Bruk sterile mikrokirurgi instrumenter gjennom den kirurgiske prosedyren. Kirurgiske instrumenter kan steriliseres under anvendelse av en infrarød varmebehandling ved en optimal steriliseringstemperatur på 1500 ° F (815,6 ° C). Telemeters kan gjenbrukes, men før du setter den inn i dyret sørg for å sterilisere hele senderen i henhold til produsentens instruksjoner og at spissen av kateteret er blitt etterfylt med en spesiell gel gitt av produsenten.
1. forsøksdyr
- Skaff en IACUC godkjenning for alle eksperimenter som skal utføres. Konsultasjon med institusjonelle IACUC er sterkt anbefalt om krav til postoperativ smertestillende bruk etter denne prosedyren.
- Holde dyr i climate-kontrollerte rom med en omgivelsestemperatur på 21 ° C, 60% relativ fuktighet, og en 12-timers lys-mørke-syklus med fri adgang til mat og vann.
Merk: Siden musekroppen har til å betjene den telemetri sonden (approximatively 1 cm diameter x 2 cm lange), er det foretrukket å anvende mus som veier 20 g eller mer.
2. Anestesi og Operative Forberedelse
- Vei musen med en presisjon skala og registrere sin vekt. Sørg for å håndtere dyret forsiktig og stille.
- Plasser dyret i induksjon kammer og lukke den. Sett oksygen strømningshastighet på 0,5 l / min og sette isofluran konsentrasjon på 4-5%.
- Når musen mister bevisstheten, legg det på en kropp varmeplate holdes på 36 - 37 ° C. Opprettholde anestesi via nosecone med isofluran sett på 2% (holde strømningshastighet på 0,5 l / min).
- Forbered drifts regionene ved å fjerne hår fra nakken og than ventral aspekt av nakken ved å bruke hårfjerningskrem.
- Unn innsnitt området med 3 anvendelser av kirurgisk kratt (Betadine løsning) alternerer med 70% isopropylalkohol.
3. Surgery
- Plasser musen i liggende stilling. Sjekk for reflekser ved å klemme foten, og juster anestesi inntil det er ingen respons. Foreta en tilnærmet 1 cm midtlinjesnitt under halsen av musen med en skalpell. I den venstre side av snittet skape en subkutan plass ved forsiktig å skille skinnet fra det underliggende bindevev.
- Snu musen og bruke en skalpell til å lage et snitt i huden på ca 1,5 cm i rygg venstre side bak skulderblad. Lag en subkutan lomme langs dyrets flanke stor nok til enheten. Sett senderen i lommen.
- Sett inn en liten pinsetten klemme i ryggen snitt og manøvrere den subkutant mot fremrehalsåpningen. Ved hjelp av den innførte-pinsetten klemme forsiktig tak i et ikke-toksisk polyetylenrør (4 cm lengde x 1 mm ID).
- Trekk pinsetten tilbake gjennom tunnelen ut den laterale snitt i ryggen til slangen stikker ut fra både mage- og rygg snitt, slipper røret fra pinsetten. Fra baksiden, føre inn katetret sensoren inn i røret for å tunnel spissen av trykkføler kateteret gjennom halsen. Fra halsen anterior, trekk og fjern polyetylen rør og lukke dorsal snitt bruker metallklips.
- Nøye skille underkjevens kjertler som bruker sterile bomulls tips applikatorer og trekke venstre kjeve kjertel ved hjelp av en elastisk opphold kroken. Ved hjelp av fin-tipped buede tang, finn halspulsåren langs venstre side av luftrøret. Hold kirurgiske området steril ved å plassere og sikre en steril drapere.
- isolere nøye fartøyet fra det omgivende vev og forsiktig skillenervus vagus (hvitaktig farge) er langs halspulsåren bort fra arterien. Vær forsiktig med å kutte eller skade nerve eller arterien.
- Pass tre biter av ikke-absorberbare 7-0 sutur under den isolerte halspulsåren delen. Bind cranial sutur for å stenge av blodstrømmen. Trekk sutur som er nærmest brystbenet for midlertidig å tilstoppe blodstrømmen fra aorta.
- Lag en løs knute bruker midten sutur. Dette vil bli brukt til å feste kateteret i beholderen. Skjær et lite snitt i arterien mellom kranie og sternale sting ved hjelp av mikro-saks.
- Grab kateteret med spesialfartøy kanylering tang, være forsiktig med å presse kateteret for å hindre gel tap fra sonden. Forsiktig, ta tak i arterien med en fin spiss buet pinsett tang, hente kateteret, og sett den inn i karet gjennom lite snitt.
- Stram midten sutur node rundt arterien og forsiktig videre kattenheter. forsiktig slipper sutur som er proksimalt til brystbenet og fortsetter å avansere kateteret mot den tverrgående aorta.
- Observer merket på kateteret som gir en omtrentlig indeks over hvor langt kateteret må settes inn. Når punktet er nådd, forsiktig stramme både den nedre og den øvre sutur rundt kateteret. Kateteret er festet til halspulsåren ved sutur knop.
- Lukk huden innsnitt med ikke-absorberbare 5-0 sutur. Når lukket, forsegle såret med vev lim.
4. Kirurgiske Recovery og BP Målinger
- Overvåk dyr tett for retur av normale stillinger og atferd. I løpet av 24 timer etter operasjonen periode administrere analgesi som ledes av en stab veterinær.
- Når dyrene har restituert (5 - 7 dager etter operasjonen), huse dem enkeltvis i en vanlig mus bur plassert på toppen av telemetri mottaker plate.
- Snu implantert transmitters "på" og "off" ved hjelp av en magnetisk enhet kort plassert nær dyret fra utsiden av buret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data kan bli kjøpt eksternt av en mottaker; traser blir visualisert på en dataskjerm for kvalitetskontroll (Figur 1a). Detaljer som dyr ID, diastolisk blodtrykk og systolisk blodtrykk er også vist (figur 1b). Arteriell BP kan registreres kontinuerlig (24/7), eller for korte programmerte intervaller (dvs. 60 sek oppkjøpet hver time). Data kan lagres automatisk i en harddisk for senere analyse. Gjennomsnitt BP data fra en 3-dagers kontinuerlig opptak blir vist (figur 2), er det mulig å sette pris på døgnrytmen variasjon mellom mørke og lys syklus. Gjennomsnitt av trykkvariasjon og hjertefrekvens ble beregnet og plottet mot tiden.
Figur 1. Typiske blodtrykk tracings av 4 forskjellige mus implantert med telemetrisk enhet. (A) tracings viser arterielle blodtrykket endres i sanntid (mmHg) over en 5 min intervall. Data er kjøpt samtidig fra fire forskjellige voksne mus 5 dager etter implantasjon. (B) Tracing ved høyere tidsoppløsning hentet fra A, er det mulig å sette pris på blodtrykk diastolisk og systolisk verdier, BP syklus varighet og puls. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Langtids arterielt blodtrykk viser døgnrytme Variant. Gjennomsnittlige trykkdata som illustrerer verdiene for (A) systoliske trykk (SP), (B) det diastoliske trykk (DP), (C) gjennomsnittlig arterietrykk (MAP), og (D) hjerte rate uttrykt i slag / min. Data ble hentet fra kontinuerlige opptak tatt i løpet av dagen (lys syklus, L) eller natt (mørk syklus, D). Opptak opprettet 7 dager etter operasjonen. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 4 mus). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Implanterbare radiotelemetri har bedret seg betydelig i løpet av det siste tiåret; mindre sonde størrelsen gjør implantatet mindre traumatisk for dyret, forlenget batterilevetid bidrar til å redusere kostnadene, og uavhengige telemeter frekvenser eliminere crosstalk mellom mottakere. Telemetri regnes state-of-the-art metode for å samle en rekke forskjellige fysiologiske parametre fra fritt bevegelige dyr uten artefakter forbundet med bruk av tvang, menneskelig interaksjon, eller bedøvelse som kreves ved andre teknikker 8,9.
Imidlertid er noen av ulempene ved sin teknikk knyttet til de innledende kostnadene ved apparatet og programvare. Senderne er skjøre og utsatt for skade, og batteriet til slutt går tom for strøm og må byttes. Selv om selskapet tilbyr å pusse opp de skadede sonder til en lavere kostnad, kan kostnadene bli fortsatt uoverkommelige for enkelte laboratorier.Videre kan denne fremgangsmåten være teknisk utfordrende og praksis er nødvendig for å oppnå pålitelig BP måling. Til slutt er det noen post-kirurgi forbundet dødelighet, som i våre hender er omtrent 5%. Dette kan dramatisk øke dersom en spesifikk behandling må testes, eller hvis en genetisk manipulasjon kompromisser musen helse.
De følgende kritiske faktorer er avgjørende for en vellykket gjennomføring av fremgangsmåten: å opprettholde vev hydrering med sterilt saltvann under hele prosedyren. Alltid håndtere senderen med stor omhu; unngå å holde det ved trykksensoren, da dette kan føre til at gel å lekke ut eller skade transmitteren. Når du setter inn kateteret, knytte sentrale sutur med en dobbel knute, som unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i kateteret spennende fartøyet. Den nødvendige lengde av kateteret som skal innføres i den karotide kan endres i henhold til musestamme og vekt som brukes i den spesiLar studie. Derfor er det sterkt anbefalt å kjøre noen innledende forsøk for å finne ut hvor dypt kateteret må settes inn for å unngå okklusjon av aorta. Til slutt, overvåke dyret daglig og sørg for at huden over senderen ikke er strukket eller nekrotisk. Hvis utvidet nekrose eller infeksjon oppstår, avlive dyrene i henhold til institusjonell politikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
- Danaei, G., et al. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. PLoS Med. 6 (4), e1000058 (2009).
- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H. Models of experimental hypertension in mice. Hypertension. 28 (6), 1064-1069 (1996).
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al. Arterial Pressure Monitoring in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 105-122 (2011).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
