Abstract
新しい血管作用薬の開発中に、動脈血圧の監視は新しい提案された薬の有効性を評価するために重要です。実際、遺伝子改変マウスを用いて、新しい潜在的な治療標的の発見に焦点を当てた研究は、全身動脈圧変動の信頼性が高く、長期的評価を必要とします。現在、外来マウスでは血圧の長期的な測定値を得るためのゴールドスタンダードは、動脈カニューレ挿入を必要とする移植可能な無線送信機を使用しています。この技術は、テザリング、規制の必要性を排除する、またはデータサンプリング時の応力とアーチファクトを導入動物を麻酔します。しかし、カテーテル挿入を介したマウスにおける動脈血圧監視が原因で動脈のサイズが小さいため、むしろ挑戦することができます。ここでは、無線送信機と頸動脈cの成功皮下移植のための重要な鍵の通路を説明するためにステップバイステップガイドを提示しますマウスでの環化。我々はまた、術後の回復期間の後、自由に動くマウスから採取した長期血圧活性の例を含みます。この手順に従うことで、同時に複数の動物からの信頼性の直接的な血圧の録音が可能になります。
Introduction
高血圧は間違いなく、それが1先進国と途上国の両方で主要な公衆衛生問題である、心血管疾患の主要な危険因子の一つです。実験的な高血圧症のいくつかの動物モデルは、ヒト2で観察されたもののような高血圧の応答を模倣するために開発されてきました。なかでも、歩行マウスが起源と高血圧への慢性暴露の影響をin vivo分析で可能に高血圧の進行を研究するための優れたモデルを表しています。
マウスでの血圧(BP)の監視は、高血圧や心不全3、4などの疾患の生理学および病態生理に関与するいくつかのメカニズムを解明するための研究を支援してきました。実際、マウスゲノムの操作は、高血圧5、6を研究するためのトランスジェニックまたは遺伝子標的モデルの生成は、適切な許可しました。しかし、穏やかな操作意識のあるマウスの鎮静や精神安定剤の使用は深く血圧7に影響を与えながら、潜在的に、データ収集中にアーティファクトを導入することができ興奮を誘発します。これらの態様は、特に重要であり、長期的な血圧の監視をしようとしたときに考慮に入れなければなりません。
そこマウスにおいて血圧を記録するいくつかの方法があり、現在入手可能な最も一般的な技術との比較は他8,9議論されています。しかし、血圧測定のためのAHAの推奨事項は、BPの動脈内測定は、一般的にあるため、直接時間10の長期間にわたってBPを測定する能力のために好ましいと結論付けました。動脈圧の直接測定と相まってラジオテレメトリは目を覚ましに生理機能を監視し、ストレスや環境関連のアーティファクト9、11を最小限に抑えながら、自由に実験動物を移動するための最先端の方法です。ラジオテレメトリは、自動的に複数の意識のある動物から血圧、心拍数、体温や動物の活動を収集する機能を提供しています。
この方法は多くの研究室では非常に人気が高まっていますが、マウスでのラジオテレメトリー注入は技術的に挑戦することができます。ここでは、マウスでの圧力変換器を移植する方法を示してステップバイステップのプロトコルを示しています。技術はマウス本体内にプローブの皮下に挿入することを含む、首にカテーテルチャンネルと左頸動脈を介して大動脈弓の近くに転送します。リモートで取得されたデータは、コンピュータモニタ上にライブ表示されます。データはまた、「オフライン」分析のために保存されています。
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Protocol
倫理の声明:このビデオ資料に記載されたすべての動物の手順を見直し、テネシー健康科学センターの大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました。
注:外科的処置を通して無菌の顕微手術器具を使用してください。外科用器具は、1,500°F(815.6°C)の最適な殺菌温度で赤外線殺菌を利用して滅菌することができます。テレメータを再利用することができるが、動物に挿入する前に、製造業者の指示に従って、全体の送信機を殺菌し、カテーテルの先端は、メーカーが提供する特殊なゲルを補充されたことにしてください。
1.実験動物
- 実行されるすべての実験のためのIACUCの承認を得ます。制度的IACUCとの協議は非常にこの手順後の術後の鎮痛剤使用のための要件に関する推奨します。
- (c)に動物を飼います食料と水に自由にアクセスで、21℃、相対湿度60%、周囲温度と12時間の明暗サイクルを持つlimateを制御した部屋。
注:マウス本体は、テレメトリプローブ(×2センチ近似的直径1cm)を収容しなければならないので、20 g以上の重マウスを使用することが好ましいです。
2.麻酔や手術の準備
- 精密スケールを用いてマウスを計量し、その重量を記録します。静かに静かに動物を処理することを確認します。
- 誘導室に動物を置き、それを閉じます。 0.5 L / minで酸素流量を設定し、4でイソフルラン濃度を設定 - 5%。
- 37°C - マウスが意識を失うと、36で維持ボディ温暖化プレートの上に置きます。 2%イソフルランがセットされたノーズコーンを介して麻酔を維持する(0.5 L /分に流量を維持します)。
- 首とトンの後ろから髪を除去することにより、操作領域を準備します彼脱毛クリームを適用することにより、首の腹側面。
- 70%イソプロピルアルコールで交互に手術用スクラブ(ベータダイン液)の3アプリケーションとの切開部位を扱います。
3.手術
- 仰臥位でマウスを置きます。足をつまんで反射神経をチェックし、応答がないまで、麻酔を調整します。メスでマウスの首下約1 cmの正中切開を行います。カットの左側には慎重に下にある結合組織から皮膚を分離することにより、皮下スペースを作成します。
- マウスを裏返して、肩甲骨の後ろに背左側に約1.5 cmで皮膚切開を作るためにメスを使用しています。デバイスを収容するのに十分な大きさの動物の脇腹に沿って皮下ポケットを作成します。ポケットに送信機を挿入します。
- バック切開の小さな止血クランプを挿入し、前方に向かって皮下にそれを操縦首の開口部。挿入、止血クランプを使用して、穏やかに非毒性のポリエチレンチューブ(4センチメートル長×1ミリメートルID)を把握します。
- チューブは両方の腹部と背部切開部から突出するまで、バックの横切開アウトトンネルを通って戻って止血剤を引き出し止血剤からチューブを解放します。背面から、首を通ってトンネルにチューブに圧力感知カテーテルの先端をカテーテルセンサーを挿入します。首の前部からは、引き、ポリエチレンチューブを除去し、金属製のクリップを使用して、背側切開部を閉じます。
- 慎重に滅菌綿棒アプリケーターを使用して、下顎腺を分離し、弾性ステーフックを使用して、左の下顎腺を撤回。先の細い湾曲した鉗子を使用して、気管の左側に頸動脈を見つけます。滅菌ドレープを配置し、固定することにより、無菌手術部位を保管してください。
- 慎重に周囲の組織から血管を分離し、静かに分離迷走神経(色は白っぽい)離れて動脈からの頸動脈に沿っています。カットまたは神経や動脈を傷つけないように注意してください。
- 孤立した頸動脈のセクションの下に7-0非吸収性縫合糸の3枚を渡します。血流を閉鎖する頭蓋縫合糸を結びます。一時的に大動脈からの血流を閉塞するために胸骨に最も近い縫合糸を引き出します。
- 中央の縫合糸を使用して、緩い結び目を作ります。これは、容器内にカテーテルを固定するために使用されます。頭蓋とマイクロはさみを使用して、胸骨縫合糸の間の動脈に小さな切開をカット。
- プローブからのゲルの損失を防ぐためにカテーテルを圧迫しないように注意して、特殊な血管カニュレーション鉗子でカテーテルをつかみます。優しく、細かい先端湾曲したピンセットをピンセットで動脈をつかむカテーテルを取り出し、小さな切開を通って容器に挿入します。
- 動脈の中間辺り縫合ノードを締めて、優しく猫を進めますheter。ゆっくり胸骨の近位にある縫合糸を解放し、横大動脈に向かってカテーテルを前進させ続けます。
- カテーテルを挿入する必要がどこまでのおおよその指標を与えるカテーテル上のマークを観察します。ポイントに達すると、そっと下カテーテルの周りの上部に縫合糸の両方を締めます。カテーテルは、縫合糸の結び目によって頚動脈に固定されています。
- 非吸収性5-0縫合糸で皮膚切開を閉じます。閉じられた後は、組織接着剤で切開部をシールします。
4.外科回復とBP測定
- 通常の姿勢や行動の復帰のために密接に動物を監視します。スタッフの獣医師の指示通りに24時間術後期間中鎮痛を管理します。
- 動物が回復したら(5から7日後に手術)、テレメトリーレシーバープレートの上に置かれ、通常のマウスのケージに個別に収容します。
- 移植TRを回し簡単にケージの外から動物の近くに位置する磁気デバイスを使用して、そして「オン」と「オフ」ansmitters。
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Representative Results
データは、受信機によってリモートで取得することができます。トレースは、品質管理( 図1a)は、コンピュータ画面上に視覚化されます。このような動物ID、拡張期血圧と収縮期血圧などの詳細は、( 図1b)に示されています。動脈BPを連続的に(24/7)を記録することができ、または短いプログラム間隔で( すなわち 、60秒の取得時間ごと)。データは自動的に後の分析のためにハードディスクに格納することができます。 3日間の連続記録からBPデータが( 図2)が示されている平均、明暗サイクルの間の概日リズムの変化を鑑賞することが可能です。圧力変動および心拍数の平均値を計算し、時間に対してプロットしました。
図1.標準的な血圧トレーシング 遠隔測定デバイスを移植した4匹の異なるマウスの 。 5分間隔でのリアルタイムの動脈血圧の変化(mmHgで)を示す(A)トレーシング。データは、5日目注入後4の異なる成体マウスから同時に取得されます。 (B)Aから抽出された高い時間分解能でのトレース、血圧拡張期と収縮期値、BPのサイクル持続時間、および心拍数を鑑賞することが可能である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. 長期動脈血圧は、概日リズム変化を示している。(A)収縮期血圧(SP)、(B)拡張期血圧(DP)、(C)平均動脈圧(MAP)の値を示す平均化圧力データ、および(D)心臓RAteが拍/分で表しました。データは、日中に撮影した連続録画(ライトサイクル、L)から抽出した、または夜間(暗サイクル、D)。記録は、手術後7日に開始しました。すべてのデータは、平均値として表されているSEM(n = 4のマウス)±。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
埋め込み可能な無線遠隔測定は、過去10年間で大幅に改善されました。小さいプローブサイズは、動物のためのインプラントが少ない外傷なり、長時間のバッテリ寿命は、コストを削減するのに役立ち、かつ独立したテレメータ周波数は受信機間のクロストークを排除します。テレメトリーは自由に他の技術8,9によって必要とされている拘束、人間の相互作用、または麻酔の使用に関連するアーティファクトなしに動物を移動する生理学的パラメータを幅広く収集するための最先端の方法であると考えられています。
しかし、彼の技術の欠点のいくつかは、機器とソフトウェアの初期コストと関連しています。送信機は損傷に脆弱で影響を受けやすい、とバッテリは、最終的には電力が不足すると交換する必要がありません。同社は低コストでこれらの損傷を受けたプローブを一新するために提供していますが、コストはまだいくつかの研究室のために法外することができます。さらに、この手順は、技術的に困難であることができ、実際には信頼性の高い血圧測定を達成するために必要とされます。最後に、私たちの手の中に約5%であり、いくつかの手術後の死亡率は、そこにあります。特定の治療を試験しなければならない場合、または遺伝子操作マウスの健康を危うくする場合、これは劇的に増加させることができます。
手順全体を通して滅菌生理食塩水を用いて組織の水和を維持するため、次の重要な要素は、プロシージャの実行が成功に不可欠です。常に細心の注意を払って送信機を扱います。これはゲルが漏れまたは送信機を破損する原因となり、圧力センサによって、それを保持することは避けてください。カテーテルを挿入する場合、容器を出るカテーテルになりますそうする失敗として、ダブルノットで、中央縫合糸を結びます。頸動脈に挿入しなければならないカテーテルの必要な長さは、そのparticuで使用されるマウス系統および体重に応じて変更することができLAR研究。したがって、非常にカテーテルが大動脈の閉塞を回避するために挿入する必要がある方法を深く決定するためにいくつかの予備実験を実行することをお勧めします。最後に、毎日動物を監視し、送信機上の皮膚が伸び又は壊死されていないことを確認してください。拡張壊死や感染症が発生した場合は、施設の方針に従って、動物を安楽死させます。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
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