Abstract
במהלך הפיתוח של סוכני vasoactive חדשים, ניטור לחץ דם העורקי הוא חיוני על מנת לאמוד את היעילות של התרופות החדשות המוצעות. ואכן, מחקר התמקדות לגילוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות חדשות באמצעות עכברי שינוי גנטי שגרמו דורש הערכה אמינה, לטווח ארוך של הווריאציה בלחץ העורקי המערכתית. נכון לעכשיו, תקן הזהב עבור קבלת מדידות ארוכות טווח של לחץ דם בעכברים אמבולטורי משתמש רדיו-משדרים מושתלים, הדורשים cannulation העורק. טכניקה זו מבטלת את צורך קשירה, ריסון, או הרדמת החיות אשר מציגות מתח וחפץ במהלך דגימת נתונים. עם זאת, ניטור לחץ הדם העורקי בעכברים באמצעות צנתור יכול להיות מאתגר למדי בשל גודלו הקטן של העורקים. כאן אנו מציגים צעד אחר צעד מדריך כדי להמחיש את פסוקי מפתח קריטיים עבור השתלה תת עורית מוצלחת של משדרי רדיו ג עורק התרדמהannulation בעכברים. אנו גם דוגמאות של פעילות לחץ דם לזמן ארוך שנלקחו מעכברים לנוע בחופשיות לאחר תקופה של התאוששות לאחר ניתוח. בעקבות הליך זה יאפשר הקלטות לחצו דם ישיר אמינות מחיות מרובות בו זמנית.
Introduction
יתר לחץ דם הוא אחד מגורמי הסיכון העיקריים למחלות לב וכלי דם, ניתן לטעון שזה בעיה בריאותית ציבורית גדולה הן במדינות מפותחות ומתפתחות 1. במודלים של בעלי חיים כמה לחץ דם ניסיוני פותחו לחקות תגובות יתר לחץ דם כמו אלה שנצפו אצל בני אדם 2. בין היתר, את העכבר אמבולטורי מייצג מודל מצוין ללמוד את ספר בראשית ואת ההתקדמות של יתר לחץ דם המאפשר בניתוח vivo של התוצאות של חשיפה כרונית ליתר לחץ דם.
לחץ דם (BP) ניטור בעכברים סייע לחוקרים לפענח מספר מנגנונים המעורבים בתחום הפיזיולוגיה פתופיזיולוגיה של מחלות כגון כשל יתר לחץ דם ולב 3, 4. ואכן, מניפולציה של גנום העכבר מותר דור מהונדס או מודלים במיקוד הגן מתאים ללימוד יתר לחץ דם 5, 6. עם זאת, אפילו מניפולציה עדינהשל עכברים מודעים גורם ריגושים שיכולים להציג ממצאים פוטנציאליים במהלך רכישת נתונים, תוך שימוש הרגעה או כדורי הרגעת הערכה משפיע לחץ דם 7. היבטים אלה חשובים במיוחד וחייב להילקח בחשבון כאשר מנסים ניטור BP לטווח ארוך.
ישנן מספר דרכים כדי להקליט BP בעכברים, וכן השוואה בין הטכניקות הנפוצות ביותר הזמינים כיום נדונה במקום אחר 8, 9. עם זאת, המלצות AHA למדידת BP למסקנה כי מדידת תוך עורקים של BP הם העדיפו בדרך כלל בגלל יכלו למדוד ישירות BP על פני תקופה ארוכה של זמן 10. רדיו-טלמטריה בשילוב עם מדידה ישירה של לחץ הדם הוא המדינה- of-the-art שיטה לניטור תפקודים פיזיולוגיים ב ער לנוע בחופשיות בחיות מעבדה תוך מזעור מתח וחפצים הקשורים לסביבה 9, 11.הרדיו-טלמטריה מציעה את היכולת לאסוף לחץ דם אוטומטי, קצב לב, טמפרטורת גוף ופעילות חיה מחיות מודעות מרובות.
למרות מתודולוגיה זו הופכת לפופולרית מאוד במעבדות רבות, השתלת הרדיו-טלמטריה בעכברים יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית. כאן אנו מראים צעד-אחר-צעד פרוטוקול הממחיש כיצד להשתיל מתמר לחץ בעכברים. הטכניקה כוללת החדרת תת עורית של החללית בגוף העכבר, לתעל את הקטטר לצוואר וקדימה ליד קשת אבי העורקים דרך עורק התרדמה השמאלי. נתונים מתועדים מרחוק מוצגים חיים על צג המחשב. נתונים מאוחסנים גם עבור "off-line" ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרה אתיקה: כל הנהלים בעלי חיים המוזכרים המאמר וידאו זה היו נבדקה ואושרה על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת מרכז המדע טנסי הבריאות.
הערה: השתמש מכשירים המיקרו-כירורגיה סטרילי לאורך כל ההליך הכירורגי. מכשירי ניתוח עשויים להיות מעוקר ניצול מעקר אינפרא אדום בטמפרטורת חיטוי אופטימלית של 1,500 ° F (815.6 מעלות צלזיוס). Telemeters ניתן לעשות שימוש חוזר, עם זאת, לפני הכנסתו בשנת החיה לוודא לעקר את המשדר כולו בהתאם להוראות היצרן וכי קצה הצנתר כבר ומלא עם ג'ל מיוחד המסופק על ידי היצרן.
1. בחיות מעבדה
- לקבל אישור IACUC עבור כל הניסויים אשר יבוצעו. התייעצות עם מוסדיים IACUC מומלץ מאוד בנוגע לדרישות לשימוש כאבים שלאחר הניתוח לאחר הליך זה.
- שמור את החיות גחדרי שבשליטת limate בעל טמפרטורת סביבה של 21 מעלות צלזיוס, 60% לחות יחסית, ואת מחזור אור כהה 12-hr עם גישה חופשית למזון ומים.
הערה: מכיוון שהגוף העכבר צריך להתאים את החללית טלמטריה (approximatively 1 ס"מ קוטר x 2 ס"מ), עדיף להשתמש בעכברים השוקלים 20 גרם או יותר.
2. הרדמה והכנה Operative
- לשקול את העכבר באמצעות סולם דיוק ולהקליט את משקלו. הקפד להתמודד עם החיה בעדינות ובשקט.
- מניחים את החיה לתוך תא אינדוקציה ולסגור אותו. גדר קצב זרימת חמצן ברמה של 0.5 ליטר / דקה ולהגדיר ריכוז isoflurane ב 4 - 5%.
- כאשר העכבר מאבד את הכרתו, למקם אותה על צלחת התחממות גוף נשמרה ב 36 - 37 מעלות צלזיוס. לשמור על הרדמה באמצעות nosecone עם סט isoflurane ב -2% (לשמור על קצב הזרימה ב 0.5 L / min).
- הכן את אזורי פעולה על ידי הסרת השיער מהחלק האחורי של הצוואר tהוא היבט הגחון של הצוואר על ידי החלת קרם להסרת שיער.
- פנק את אתר החתך עם 3 בקשות של שיחים כירורגית (פתרון בבטאדין) לסירוגין עם אלכוהול איזופרופיל 70%.
3. כירורגיה
- מניחים את העכבר במצב שכיבה. בדוק רפלקסים על ידי צובט את הרגל, ולהתאים הרדמה עד שאין תגובה. עושים חתך קו האמצע כ 1 ס"מ מתחת לצוואר של העכבר באמצעות אזמל. בצד השמאלי של החתך ליצור מרחב תת עורית על ידי הפרדת העור בקפידה מתוך רקמת חיבור הבסיסית.
- הפוך את העכבר, ולהשתמש אזמל לעשות חתך בעור של כ 1.5 ס"מ בצד שמאל הגבי מאחורי עצם השכם. צור בכיס תת עורית לאורך האגף של חיה גדולה מספיק כדי להכיל את התקן. הכנס את המשדר לכיס.
- הכנס מהדק hemostat קטן חתך הלוך לתמרן אותו מתחת לעור לכיוון הקדמיפתיחת צוואר. באמצעות מהדק hemostat מוכנס, לתפוס בעדינות צינור פוליאתילן רעיל (4 ס"מ אורך x 1 מ"מ ID).
- משוך את hemostat חזרה דרך המנהרה את חתך לרוחב בחלק האחורי עד בצינור שבולט משני חתך בבטן ועל הגב, לשחרר את הצינור מתוך hemostat. מאחור, הכנס את חיישן קטטר לתוך הצינור למנהרת קצה הקטטר חישת לחץ דרך הצוואר. מתוך קדמי הצוואר, למשוך ולהסיר את צינור פוליאתילן לסגור את החתך הגבה באמצעות קליפים מתכת.
- הפרד בזהירות את בלוטות mandibular באמצעות applicators טיפ גפן סטרילי לסגת בלוטת mandibular שמאל באמצעות וו ושהייה אלסטי. באמצעות קנס שקצו מלקחיים מעוקלים, לאתר את העורק הראשי בצדו השמאלי של קנה הנשימה. שמור את האתר כירורגית סטרילית ידי הצבת ואבטחת וילון סטרילית.
- בזהירות לבודד את הכלי מן הרקמה הסובבת בעדינות להפריד אתהעצב התועה (לבנבן בצבע) כי הוא לאורך עורק התרדמה מן העורק. היזהר שלא לחתוך או נזק עצבי או העורק.
- לעבור שלוש חתיכות של לא נספגים 7-0 תפר מתחת לקטע עורק התרדמה מבודד. לקשור את תפר גולגולתי לסגור את זרימת הדם. משוך את התפר קרוב עצם החזה כדי לחסום זמני של זרימת דם מאבי העורקים.
- הפוך קשר רופף באמצעות התפר באמצע. זה ישמש כדי לאבטח את הקטטר הספינה. חותכים חתך קטן לתוך העורק בין הגולגולת ואת התפרים sternal באמצעות מיקרו מספריים.
- תפוס את הקטטר עם מלקחי cannulation כלי מיוחדים, נזהר שלא לסחוט את הקטטר כדי למנוע אובדן ג'ל מן החללית. בעדינות, לתפוס את העורק עם מלקחי פינצטה בסדר קצה מעוגל, לאחזר את הקטטר, ולהכניס אותו הספינה דרך החתך הקטן.
- הדקו את הצומת תפר באמצע סביב עורק בעדינות לקדם את החתולמכירה. משחררים בעדינות את תפר כי הוא הפרוקסימלי אל עצם החזה ולהמשיך לקדם את הקטטר אל אבי העורקים רוחבי.
- שים את הסימן על קטטר שנותן מדד משוער של כמה רחוק את הקטטר צריך להיות מוכנס. לאחר הנקודה הוא הגיע, בעדינות להדק הן נמוך יותר התפר העליון סביב הקטטר. קטטר מאובטח על עורק הצוואר על ידי קשרי תפר.
- סגירת החתך בעור עם תפר 5-0 שאינם נספגים. לאחר סגור, לאטום את החתך עם דבק רקמות.
4. מדידות Recovery ו- BP כירורגי
- צג בעלי חיים מקרוב לשובו של תנוחות נורמלי והתנהגויות. במהלך שיכוך כאבי ניהול 'תקופה של 24 שעות לאחר ניתוח עפ"י הוראות על ידי וטרינר צוות.
- לאחר החיות התאוששו (5 - 7 ימים לאחר הניתוח), לשכן אותם בנפרד בכלוב עכבר רגיל מונח על גבי צלחת מקלט טלמטריה.
- סובבו את TR מושתלansmitters "על" ו "off" באמצעות מכשיר מגנטי ממוקם קרוב בקצרה את החיה מן מחוץ לכלוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתונים אלו יכולים להירכש מרחוק על ידי כונס נכסים; עקבות הם דמיינו על מסך מחשב עבור בקרת איכות (איור 1 א). פרטים כגון זיהוי בעלי חיים, לחץ דם דיאסטולי, לחץ דם סיסטולי גם מוצגים (איור 1b). עורקי BP ניתן להקליט ברציפות (24/7), או עבור בפרקי זמן קצרים מתוכנת (כלומר, 60 שניות רכישת כל שעה). נתונים אלו יכולים להיות מאוחסנים באופן אוטומטי דיסק קשיח לצורך ניתוח מאוחר יותר. בממוצע נתוני BP מתוך הקלטה רציפה 3 ימים מוצגים (איור 2), ניתן להעריך את וריאצית קצב היממה בין מחזור החושך ואור. ממוצע של שיעור וריאציה ולב לחץ חושב זמם נגד זמן.
איור 1. העתקים לחצו דם אופייניים של 4 עכברים שונים מושתלים עם תקן telemetric. (א) העתקים מראה שינויים בלחץ הדם העורקי בזמן אמת (מ"מ כספית) על פני מרווח 5 דקות. נתונים נרכשים זמנית מארבעה עכברים שונים בוגרים 5 ימים לאחר ההשתלה. (ב) איתור ברזולוציה זמנית גבוהה מופקת א ', אפשר להעריך הדיאסטולי לחץ דם סיסטולי וערכים, משך מחזור BP, וקצב לב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
לחץ איור 2. דם עורקים לטווח ארוך מציג יממת Rhythm וריאציה. נתונים בלחץ ממוצעים הממחישים את הערכים עבור לחץ הסיסטולי (א) (SP), (ב) לחץ הדיאסטולי (עקור), (ג) ממוצע לחץ דם (MAP), ו (ד) בלב rate לידי ביטוי פעימות / דקה. נתונים חולצו מהקלטות רציפות שצולמו במהלך היום (מחזור אור, L) או בלילה (חושך מחזור, D). ההתחלה החלה 7 ימים שלאחר הניתוח. כל הנתונים הם כפי שבאו לידי ביטוי ממוצע ± SEM (n = 4 עכברים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רדיו-טלמטריה מושתלת השתפרה באופן משמעותי בעשור האחרון; גודל חללית קטן הופך את השתל פחות טראומטי עבור החיה, חיי סוללה ממושכים עוזרים להפחית את העלויות, ותדרי מַד מֶרְחָק עצמאיים למנוע crosstalk בין מקלטים. טלמטריה נחשב המדינה- of-the-art שיטה לאיסוף מגוון רחב של פרמטרים פיזיולוגיים לנוע חיות בחופשיות ללא חפצים הקשורים לשימוש של איפוק, אינטראקציה אנושית, או הרדמה אשר נדרשים על ידי טכניקות אחרות 8,9.
עם זאת, כמה מהחסרונות של הטכניקה שלו המשויכים את העלויות הראשוניות של המכשיר והתוכנה. משדרי הם שבירים רגישים נזק, ואת הסוללה בסופו של דבר אין נגמר הכוח צריך להיות מוחלף. למרות שהחברה מציעה לשפץ אלו בדיקות פגומות במחיר נמוך יותר, העלות יכולה להיות עדיין מונעת למעבדות כמה.יתר על כן, הליך זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ותרגול נדרש כדי להשיג מדידת BP אמינה. לבסוף, יש כמה שלאחר ניתוח קשור התמותה, אשר בידינו הוא כ -5%. זה יכול להגדיל באופן דרמטי אם טיפול ספציפי יש להיבדק או אם מניפולציה גנטית פוגע בריאות העכבר.
הגורמים הקריטיים הבאים חיוניים הביצוע המוצלח של הליך: לשמור על לחות רקמה עם תמיסת מלח סטרילית לאורך ההליך כולו. תמיד טפל המשדר בזהירות רבה; להימנע מחזיק אותו על ידי חיישן לחץ מכיוון שהדבר עלול לגרום ג'ל לדלוף או נזק משדר. כאשר מכניס את הקטטר, לקשור את התפר המרכזי בקשר כפול, כפי כשל לעשות זאת תגרום הקטטר יציאת הספינה. האורך נדרש של הקטטר שחייב להיות מוכנס התרדמה יכול להשתנות בהתאם לזן העכבר והמשקל המשמש כי particuמחקר Lar. לכן, מומלץ מאוד להפעיל איזה ניסוי ראשוני כדי לקבוע עד כמה עמוק קטטר צריך להיות מוכנס כדי למנוע חסימה של אב העורקים. לבסוף, לפקח על בעלי החיים מדי יום ולוודא כי העור מעל המשדר לא נמתח או נימקים. אם נימק או זיהום מורחבים מתרחש, להרדים את בעלי החיים על פי מדיניות מוסדית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
- Danaei, G., et al. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. PLoS Med. 6 (4), e1000058 (2009).
- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H.
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al.
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
