Abstract
새로운 혈관 활성 제제의 개발 동안, 동맥 혈압 모니터링은 새로운 제안 된 약물의 효능을 평가하는데 중요하다. 실제로, 유전자 변형 마우스를 이용하여 새로운 잠재적 인 치료 표적의 발견에 집중 조사 전신 동맥압 변화 안정적 장기 평가를 필요로한다. 현재 외래 마우스에서 혈압 장기간 측정을 얻기위한 금 표준 동맥 삽관을 필요 이식 무선 송신기를 사용한다. 이 기술은 억제 또는 데이터 샘플링 동안에 응력 아티팩트를 도입 동물을 마취, 테 더링에 대한 필요성을 제거한다. 그러나, 도관을 통해 마우스에서 동맥 혈압 모니터링 인해 동맥의 작은 크기에 다소 어려울 수있다. 여기에서 우리는 무선 송신기 및 경동맥 (c)의 성공적인 피하 주입을위한 중요한 핵심 구절을 설명하는 단계별 가이드를 제시마우스의 고리 화. 또한 수술 후 회복 기간 후 자유롭게 움직이는 마우스로부터 취한 장기 혈압 행위의 예를 포함한다. 이 절차를 수행하면 동시에 여러 동물의 신뢰성 직접 혈압 녹음을 수 있습니다.
Introduction
고혈압은 논란의 여지가 선진국과 개발 도상국의 1에 모두 중요한 공중 보건 문제이며, 심혈관 질환의 주요 위험 요인 중 하나입니다. 실험 고혈압의 여러 동물 모델이 인간에서 관찰되는 것과 같은 고혈압 성 반응을 모방하기 위해 개발되었다. 다른 중, 외래 마우스 기원과 고혈압에 만성 노출의 결과 생체 분석에 허용 고혈압의 진행을 연구하는 훌륭한 모델을 나타냅니다.
혈압은 마우스 (BP) 모니터링은 생리와 고혈압과 심장 장애 3, 4과 같은 질병의 병태 생리에 관여하는 여러 메커니즘을 해명하는 연구를 도왔다. 사실, 마우스 게놈의 조작은 고혈압 5, 6을 공부 유전자 변형 또는 유전자 대상 모델에 적합한의 생성을 허용했다. 그러나, 부드러운 조작의식 마우스의 진정 또는 안정제의 사용은 근본적으로 혈압 7에 영향을하면서 잠재적으로 데이터 수집시 유물을 소개 할 수 감동이를 유도한다. 이러한 측면은 특히 중요 장기 BP 모니터링을 시도 할 때를 고려하여 수행되어야한다.
생쥐가 BP를 기록하는 여러 가지 방법이 있고, 현재 가장 일반적인 기술 사이의 비교는 다른 곳 (9) (8)을 설명하고있다. 하지만 BP 측정 용 AHA 권장 BP의 동맥 측정은 일반적으로 인해 직접 10 시간의 연장 된 기간 동안 BP 측정을 선택하는 것이 바람직하다 결론 지었다. 동맥압 직접 측정과 결합 된 무선 원격 깨어 생리 기능 모니터링 및 환경 스트레스 - 관련 이슈 9, 11을 최소화하면서 자유롭게 실험 동물을 이동하는 첨단 방법이다.무선 원격 자동 여러 의식 동물의 혈압, 심박수, 체온 및 동물 활성을 수집하는 능력을 제공한다.
이 방법은 많은 실험실에서 매우 인기를 끌고 있지만, 마우스의 무선 원격 측정 주입은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여기에서 우리는 마우스에 압력 변환기를 이식하는 방법을 보여줍니다 단계별 프로토콜을 보여줍니다. 기술은 마우스 본체 프로브의 피하 삽입을 수반 목에 카테터 채널 및 좌측 경동맥을 통해 대동맥 궁 근처 전달. 원격으로 수집 된 데이터는 컴퓨터 모니터에 실시간 나타낸다. 데이터는 또한 "오프라인"분석을 위해 저장됩니다.
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Protocol
윤리 문 :이 비디오 문서에서 언급 된 모든 동물 절차를 검토하고 테네시 건강 과학 센터의 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
참고 : 수술을 통해 멸균 미세 악기를 사용합니다. 수술 장비는 1500 ° F (815.6 ° C)의 최적의 살균 온도에서 적외선 살균기를 이용하여 멸균 할 수있다. 제조업체의 지침에와 카테터의 끝이 제조 업체에서 제공하는 특수 젤 리필되었는지에 따라 전체 송신기를 소독해야합니다 동물에 넣기 전에 Telemeters 그러나, 재사용 할 수 있습니다.
1. 실험 동물
- 수행 할 모든 실험에 대한 IACUC 승인을 얻습니다. 기관 IACUC와 상담이 높은이 절차 후 수술 후 진통제 사용을위한 요구 사항에 대한 권장합니다.
- C에서 동물을 유지21 ° C, 상대 습도 60 %의 주위 온도와 음식과 물을 무료로 이용할와 12 시간의 명암주기를 갖는 limate 제어 객실을 보유하고 있습니다.
주 : 마우스 본체는 원격 프로브 (긴 approximatively 1cm X 직경 2cm)을 수용하기 때문에, 그것을 20g 이상의 체중 쥐를 사용하는 것이 바람직하다.
2. 마취 및 수술 준비
- 정밀 저울을 사용하여 마우스를 달아 무게를 기록한다. 부드럽게 조용히 동물을 처리해야합니다.
- 유도 챔버에 동물을 배치하고 닫습니다. 0.5 L / min의 산소 유속을 설정 및도 4에 이소 플루 란 농도 세트 - 5 %.
- 37 °의 C - 마우스가 의식을 잃을 때, 36로 유지 몸 온난화 판에 놓습니다. 2 % 이소 플루 란으로 설정된 원추형 두부를 통해 마취를 유지 (0.5 L / 분의 유량을 유지).
- 목부 및 t의이면으로부터 모발을 제거하여 작업 영역을 준비그는 머리 제거 크림을 적용하여 목의 복부 측면.
- 70 % 이소 프로필 알코올 교대 수술 스크럽 (betadine 용액) 3 애플리케이션 절개 부위를 치료.
3. 수술
- 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 발을 곤란하게하여 반사를 확인하고 응답이 없을 때까지 마취를 조정합니다. 메스와 마우스의 목 아래 약 1 cm의 중간 선 절개를합니다. 절단의 왼쪽에서주의 깊게 기본 결합 조직에서 피부를 분리하여 피하 공간을 만들 수 있습니다.
- 마우스를 플립, 그리고 견갑골 뒤에 지느러미 왼쪽에 약 1.5 cm의 피부 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 장치를 수용 할 수있을만큼 큰 동물의 측면을 따라 피하 주머니를 만듭니다. 주머니에 송신기를 삽입합니다.
- 다시 절개의 작은 지혈 클램프를 삽입하고 전방을 향해 피하을 기동목 개방. 삽입 - 지혈제 클램프를 사용하여 부드럽게 무독성 폴리에틸렌 관 (X 4cm 길이 1mm의 ID)를 파악.
- 튜브는 모두 복부와 지느러미 절개에서 돌출 될 때까지, 뒤쪽에 횡 절개 밖으로 터널을 통해 다시 지혈을 당겨 지혈에서 튜브를 놓습니다. 후면에서 목을 통해 터널로 튜브에 압력 감지 카테터의 팁 카테터 센서를 삽입한다. 목 앞쪽에서 당겨 폴리에틸렌 튜브를 제거하고 금속 클립을 사용하는 등의 절개를 닫습니다.
- 조심스럽게 무균 면화 팁 어플리케이터를 사용하여 하악 동맥을 분리하고 탄성 숙박 후크를 사용하여 왼쪽 하악 선을 철회. 뾰족한 곡선 집게를 사용하여 기관의 왼쪽에 경동맥을 찾습니다. 배치하고 멸균 드레이프를 확보하여 무균 수술 부위를 유지합니다.
- 조심스럽게 주위 조직에서 용기를 분리하고 조심스럽게 분리멀리 동맥에서 경동맥을 따라입니다 미주 신경 (색상 희끄무레). 절단 또는 신경이나 혈관 손상되지 않도록주의하십시오.
- 격리 된 경동맥 섹션 아래에 7-0 비 흡수성 봉합사의 세 가지를 전달합니다. 혈액의 흐름을 닫습니다 두개골 봉합을 묶어. 일시적으로 대동맥에서 혈액의 흐름을 폐색하는 흉골에 가장 가까운 봉합사를 당깁니다.
- 중간 봉합사를 사용하여 느슨한 매듭을합니다. 이는 용기 내의 카테터를 고정하기 위해 사용된다. 두개골 및 마이크로 가위를 사용하여 흉골 봉합 사이의 동맥에 작은 절개를 잘라.
- 프로브에서 젤 손실을 방지하기 위해 카테터를 집어 넣은 않도록주의하면서, 특수 선박 삽관의 집게로 카테터를 잡아. 조심스럽게, 좋은 팁 곡선 핀셋 집게로 동맥을 잡아 카테터를 검색하고 작은 절개를 통해 용기에 삽입합니다.
- 동맥 주위에 중간 봉합 노드를 조 부드럽게 고양이의 발전heter. 조심스럽게 흉골에 인접되는 봉합사를 해제하고 가로 대동맥으로 카테터를 전진하는 것을 계속한다.
- 카테터를 삽입 할 필요가 얼마나 멀리의 대략적인 인덱스를 제공 카테터에 마크를 관찰한다. 지점에 도달하면, 가볍게 두 하부 카테터 주변의 상부 봉합 조인다. 카테터는 봉합 매듭으로 경동맥에 고정된다.
- 비 흡수성 5-0 봉합사로 피부 절개를 닫습니다. 폐쇄되면, 조직 접착제로 절개를 밀봉.
4. 수술 복구 및 혈압 측정
- 정상적인 자세와 행동의 반환을 위해 긴밀하게 동물을 모니터링합니다. 직원 수의사의 지시에 따라 24 시간 수술 후 기간 관리]의 진통 중.
- 동물이 회복되면 (5-7일 후 수술), 원격 측정 수신기 판의 상단에 배치 일반 마우스 케이지에 개별적으로 수용.
- 이식 TR을 돌려자기 장치를 사용하여 및 "오프" "의"ansmitters 간단히 케이지의 외부에서 동물에 가까운 위치.
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Representative Results
데이터는 원격 수신기에 의해 획득 될 수있다; 트레이스 품질 제어 (도 1a)에 대한 컴퓨터 화면에 가시화된다. 이러한 동물 ID, 확장기 혈압 및 수축기 혈압 상세도 (도 1B)를 나타낸다. 동맥 혈압이 지속적으로 (24)를 기록 할 수있다, 또는 짧은 프로그램 간격에 대한 (즉, 60 초 획득 시간마다). 데이터가 자동으로 나중에 분석을 위해 하드 디스크에 저장 될 수있다. 3 일 연속 녹화에서 BP 데이터 (그림 2) 도시 평균, 어둠과 빛주기 사이의 일주기 리듬의 변화를 감상 할 수있다. 압력 변화 및 심장 속도의 평균을 계산 시간이 역모를 꾸몄다했다.
그림 1. 일반적인 혈압 트레이싱 텔레 장치로 이식 4 다른 마우스의. 5 분 간격 동안 실시간 동맥 혈압 변화 (mmHg로)를 나타내는 (A) 트레이싱. 데이터는 오일 주입 후 네 가지 성인 마우스에서 동시에 취득한다. A로부터 추출 높은 시간 해상도로 추적 (B)는, 혈압 이완기 및 수축기 값, BP 사이클 기간, 심장 박동을 감상 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 장기 동맥 혈압 (A) 수축기 압력 (SP), (B) 확장기 혈압 (DP), (C), 평균 동맥압 (MAP), 및의 값을 도시하는 활동 일주기 변화. '평균 압력 데이터를 표시 (D) 심장 라소리지르는 비트 / 분으로 표현. 데이터는 일 (라이트 사이클, L) 밤 (어두운주기, D) 동안 찍은 연속 녹화에서 추출 하였다. 녹화 7 일을 후 수술을 시작했다. 모든 데이터는 평균으로 표현되는 SEM (N = 4 마우스) ±. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이식 무선 원격 측정은 지난 10 년간 크게 개선했다; 작은 프로브 크기는 동물에 대한 이식이 적은 외상하게, 장기간 배터리 수명 비용을 감소시키는 데 도움이 독립적 텔레 주파수는 수신기 사이의 크로스 토크를 제거한다. 텔레 자유롭게 다른 기술 8,9에 필요한 구속, 인간의 상호 작용, 또는 마취제의 사용과 관련된 아티팩트없이 동물을 이동하는 생체 변수의 다양한 수집 최신식있어서 고려된다.
그러나, 그 기술의 단점들 중 일부는 장비 및 소프트웨어의 초기 비용과 연관된다. 송신기들은 손상 깨지기 쉽다, 배터리는 결국 전력 부족 않고 교체 될 필요가있다. 이 회사는 저렴한 비용으로 그 손상 프로브를 닦다 제공하지만, 비용은 여전히 실험실 금지 될 수 있습니다.또한,이 방법은 기술적으로 어려울 수 있으며, 실제로는 신뢰할 BP 측정을 달성하기 위해 요구된다. 마지막으로, 우리의 손에 약 5 %의 사망률 관련된 몇 가지 수술 후이있다. 이것은 극적으로 특정 치료를 테스트 할 경우 증가시킬 수 있습니다 또는 유전자 조작 마우스의 건강을 위태롭게합니다.
전체 과정에 걸쳐 무균 식염수 유지 티슈 수화 다음 중요한 요인이 프로 시저의 실행 성공에 필수적이다. 항상 큰 관심과 송신기를 처리; 이 겔이 누설하거나 송신기 손상시킬 수 있으므로, 압력 센서를 보유 피한다. 카테터를 삽입 할 때 용기로부터 유출되는 카테터 될 것이다 이렇게 실패로 이중 매듭 중앙 봉합 넥타이. 경동맥에 삽입하는 카테터의 필요한 길이는이 특별히 사용되는 마우스 균주 및 중량에 따라 변경할 수있다LAR 연구. 따라서, 높은 카테터 대동맥의 폐색을 방지하기 위해 삽입 될 필요가 얼마나 깊이를 결정하는 몇 가지 예비 실험을 실행하는 것을 권장한다. 마지막으로, 매일 동물을 모니터링하고 송신기 위의 피부가 늘어나거나 괴사하는 것을 방지 할 수 있도록 보장합니다. 확장 괴사 또는 감염이 발생하는 경우, 기관 방침에 따라 동물을 안락사.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
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