Abstract
Bij de ontwikkeling van nieuwe vasoactieve middelen, arteriële bloeddrukmeting is cruciaal voor het evalueren van de doeltreffendheid van de voorgestelde nieuwe geneesmiddelen. Inderdaad, onderzoek gericht op de ontdekking van nieuwe potentiële therapeutische strategieën om genetisch veranderde muizen is een betrouwbare, langdurige beoordeling van de systemische arteriële drukvariatie. Momenteel is de gouden standaard voor het verkrijgen van langdurige metingen van de bloeddruk in de ambulante muizen gebruikt implanteerbare radio-zenders, die slagader infusen nodig. Deze techniek elimineert de noodzaak voor tethering, beperken of verlamming van de dieren die stress en artefacten te introduceren tijdens de data sampling. Echter, arteriële bloeddruk bij muizen via catheterization nogal moeilijk zijn vanwege de kleine omvang van de slagaders. Hier presenteren we een stap-voor-stap handleiding voor de cruciale sleutel passages voor een succesvolle onderhuidse implantatie van radio-zenders en halsslagader c illustrerenannulation bij muizen. Ook omvatten voorbeelden van langdurige bloeddruk activiteit uit vrij bewegende muizen na een periode van herstel na de operatie. Na deze procedure zal betrouwbare directe bloeddruk opnamen van meerdere dieren tegelijk toe te staan.
Introduction
Hypertensie is een van de belangrijkste risicofactoren voor hart- en vaatziekten, misschien wel het is een belangrijke zaak voor de volksgezondheid, zowel in ontwikkelde als ontwikkelingslanden 1. Verschillende diermodellen van experimentele hypertensie ontwikkeld hypertensieve reacties zoals die bij de mens 2 bootsen. Onder andere de ambulante muis vertegenwoordigt een zeer goed model voor het ontstaan en de progressie van hypertensie waardoor in vivo analyse van de gevolgen van chronische blootstelling aan hypertensie bestuderen.
Bloeddruk (BP) bij muizen toezicht heeft geholpen onderzoekers verschillende mechanismen betrokken bij de fysiologie en pathofysiologie van ziekten zoals hypertensie en hartfalen 3, 4 ontrafelen. Inderdaad, manipulatie van de muis genoom mogen genereren van transgene of van transgene modellen geschikt voor het bestuderen hypertensie 5, 6. Maar zelfs zachte manipulatievan bewuste muizen induceert opwinding die mogelijk artefacten kunnen introduceren tijdens data-acquisitie, terwijl het gebruik van sedatie of kalmeringsmiddelen diepgaand invloed op de bloeddruk 7. Deze aspecten zijn bijzonder belangrijk en moet rekening gehouden worden bij een poging langdurige BP monitoring.
Er zijn verschillende manieren om BP opnemen in muizen, en een vergelijking van de meest gebruikte technieken momenteel beschikbaar elders besproken 8, 9. De AHA aanbevelingen voor bloeddrukmeting geconcludeerd dat intra-arteriële meting van BP algemeen de voorkeur verdienen vanwege hun vermogen om BP direct te meten over een langere periode 10. Radio-telemetrie combinatie met rechtstreekse meting van de arteriële druk state-of-the-art methode voor het bewaken van fysiologische functies door wakkere en vrij bewegende proefdieren met minimale spanning en milieuvriendelijke geassocieerde artefacten 9, 11.Radio-telemetrie biedt de mogelijkheid om automatisch te verzamelen bloeddruk, hartslag, lichaamstemperatuur en dierlijke activiteit van meerdere dieren bij bewustzijn.
Hoewel deze methode is steeds zeer populair in veel laboratoria, kunnen radio-telemetrie implanteren in muizen technisch uitdagende zijn. Hier laten we een stap-voor-stap protocol dat illustreert hoe een drukomzetter in muizen geïmplanteerd. De techniek omvat subcutaan inbrengen van de sonde in het lichaam muis, kanaliseren de katheter om de hals en zendt bij de aortaboog via de linker halsslagader. Op afstand vastgelegde gegevens worden weergegeven live op de computer monitor. De gegevens worden ook opgeslagen voor analyse "off-line".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Alle in deze video-artikel genoemde dierlijke procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Tennessee Health Science Center goedgekeurd.
Opmerking: Gebruik steriele microchirurgie instrumenten gedurende de chirurgische procedure. Chirurgische instrumenten kunnen worden gesteriliseerd met behulp van een infrarood sterilisator bij een optimale sterilisatie temperatuur van 1500 ° F (815,6 ° C). Telemeters kan worden hergebruikt, maar alvorens hem in de dierlijke zorg ervoor dat de gehele transmitter steriliseren volgens de instructies van de fabrikant en dat de punt van de katheter opnieuw is gevuld met een speciale gel van de fabrikant.
1. Proefdieren
- Verkrijg een IACUC goedkeuring voor alle experimenten die zullen worden uitgevoerd. Overleg met institutionele IACUC wordt ten zeerste aanbevolen ten aanzien van eisen voor postoperatieve pijnstillende gebruik na deze procedure.
- Houd de dieren in c-Limate gecontroleerde kamers met een omgevingstemperatuur van 21 ° C, 60% relatieve vochtigheid, en een 12-uur licht-donker cyclus met vrije toegang tot voedsel en water.
Opmerking: Omdat de muis instantie de telemetrie probe (bij benadering 1 cm diameter x 2 cm lang) tegemoet te komen, verdient het de voorkeur muizen die 20 g of meer weegt gebruiken.
2. Anesthesie en Operative Voorbereiding
- Weeg de muis met behulp van een precisieweegschaal en het gewicht op te nemen. Zorg ervoor dat het dier voorzichtig en rustig behandelen.
- Plaats het dier in de inductie kamer en sluit het. Stel zuurstof debiet van 0,5 l / min en stel isofluraan concentratie 4-5%.
- Wanneer de muis het bewustzijn verliest, leg het op een lichaam warmhoudplaat gehandhaafd op 36-37 ° C. Handhaving van de narcose via neuskegel met isofluraan ingesteld op 2% (houden debiet van 0,5 l / min).
- Bereid de operatie regios op de ontharing van de achterkant van de nek en thij ventrale aspect van de nek door het toepassen van ontharingscrème.
- Behandel de incisie site met 3 toepassingen van chirurgische scrub (Betadine oplossing) afgewisseld met 70% isopropylalcohol.
3. Chirurgie
- Plaats de muis in rugligging. Controleer op reflexen door knijpen de voet, en pas anesthesie totdat er geen reactie. Maak ongeveer 1 cm middellijn incisie onder de hals van de muis met een scalpel. Aan de linkerkant van de snede te maken een subcutane ruimte door voorzichtig scheiden de huid van het onderliggende bindweefsel.
- Flip de muis, en gebruik een scalpel een incisie in de huid van ongeveer 1,5 cm te maken in de dorsale links achter het schouderblad. Een subcutane pocket langs flank van het dier groot genoeg om het koppelstuk. Plaats de zender in de zak.
- Steek een kleine hemostat klem in de rug incisie en manoeuvreren subcutaan in de richting van de voorstehals opening. Met de ingevoegde-hemostaat klem voorzichtig grijpen een niet-toxisch polyethyleen buis (4 cm lang x 1 mm ID).
- Trek de hemostaat terug door de tunnel uit de laterale incisie in de rug totdat de buis uitsteekt uit zowel de buik en de dorsale incisie, laat de buis van de hemostaat. Vanaf de achterzijde, een katheter sensor in de buis tunnel de punt van de drukgevoelige katheter door de hals. Vanaf de nek anterior, trek en verwijder de polyethyleen buis en sluit de dorsale incisie met behulp van metalen clips.
- scheiden voorzichtig de onderkaak klieren met behulp van steriele katoenen tip applicators en schuif de linker onderkaak klier met behulp van een elastische verblijf haak. Met behulp van fijne punt gebogen pincet, zoekt de halsslagader aan de linkerkant van de luchtpijp. Houd de operatiewond steriel door het plaatsen en het veiligstellen van een steriel laken.
- Zorgvuldig isoleren het vaartuig uit het omringende weefsel en voorzichtig scheidennervus vagus (witachtige kleur) die langs de halsslagader verwijderd van de slagader. Wees voorzichtig niet te snijden of beschadiging van de zenuw of de slagader.
- Pass drie stukken van niet-absorbeerbare 7-0 hechtdraad onder de geïsoleerde halsslagader sectie. Bind de craniale hechtdraad om de bloedstroom af te sluiten. Trek de hechtdraad die het dichtst bij het borstbeen om de bloedstroom vanuit de aorta tijdelijk af te sluiten.
- Maak een losse knot met de middelste hechtdraad. Deze wordt gebruikt om de katheter te verzekeren in het vat. Snijd een kleine incisie in de slagader tussen de craniale en de sternale hechtingen met behulp van micro-schaar.
- Pak de katheter met een speciale schip infusen tang, zorg dat u de katheter gel verlies uit de sonde te voorkomen niet te knijpen. Voorzichtig, pak de slagader met een fijne tip gebogen pincet tang, ophalen van de katheter, en steek deze in het vat door de kleine incisie.
- Draai het midden hechtdraad knooppunt rond de slagader en voorzichtig vooraf de katheter. Voorzichtig de hechtdraad die proximaal van het borstbeen vrij en blijven de katheter vooruit naar de dwarse aorta.
- Let op de markering op de katheter die bij benadering index in hoeverre de katheter moet worden ingebracht geeft. Zodra het punt wordt bereikt, voorzichtig draai zowel de onderste en bovenste hechting rond de katheter. De katheter wordt bevestigd aan de halsslagader door hechtdraad knopen.
- Sluit de incisie in de huid met niet-absorbeerbare 5-0 hechtdraad. Eenmaal gesloten, sluit de incisie met weefsel lijm.
4. Chirurgische Herstel en BP Metingen
- Monitor dier nauw voor de terugkeer van de normale houdingen en gedragingen. Tijdens de 24 uur na de operatie periode toedienen analgesie zoals voorgeschreven door een dierenarts personeel.
- Zodra de dieren hersteld (5-7 dagen na de operatie), huisvesten ze afzonderlijk in een normale muis kooi bovenop de telemetrieontvanger plaat.
- Draai de geïmplanteerde transmitters "aan" en "uit" met behulp van een magnetisch apparaat kort zich dicht bij de dieren vanaf de buitenkant van de kooi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gegevens kunnen op afstand worden overgenomen door een ontvanger; sporen worden gevisualiseerd op een computerscherm voor de kwaliteitscontrole (figuur 1a). Details zoals dierlijke ID, diastolische bloeddruk en systolische bloeddruk worden ook getoond (Figuur 1b). Arteriële BP kan continu (24/7) worden geregistreerd, of kortweg geprogrammeerde intervallen (dat wil zeggen, 60 sec overname elk uur). Gegevens kunnen automatisch worden opgeslagen op een harde schijf voor latere analyse. Gemiddelde BP gegevens van een 3-daagse continu opnemen getoond (figuur 2), is het mogelijk om het circadiane ritme variatie tussen donker en lichtcyclus waarderen. Gemiddelde van drukvariatie en hartslag werden berekend en uitgezet tegen de tijd.
Figuur 1. Typische Bloeddruk Tracings 4 Verschillende muizen geïmplanteerd met telemetrische Device. (A) Tracings toont real-time arteriële bloeddruk verandert (mmHg) over een 5 minuten interval. Gegevens gelijktijdig verkregen uit vier volwassen muizen 5 dagen na implantatie. (B) Tracing bij hogere tijdsresolutie geëxtraheerd uit A, is het mogelijk om de bloeddruk diastolische en systolische waarden, BP cyclus duur en hartslag te waarderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Langdurig Arteriële bloeddruk shows circadiane ritmevariatie. Averaged drukgegevens illustreert de waarden van (A) systolische druk (SP), (B) diastolische druk (DP), (C) gemiddelde arteriële druk (MAP) en (D) hart rate uitgedrukt in slagen / min. Gegevens werden verkregen uit continue registraties overdag (lichtcyclus, L) en nacht (donkercyclus, D). Opname begonnen 7 dagen na de ingreep. Alle gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n = 4 muizen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Implanteerbare radio-telemetrie is aanzienlijk in de afgelopen tien jaar verbeterd; kleiner formaat sensor maakt het implantaat minder traumatisch voor het dier, verlengde levensduur van de batterij helpt om de kosten te verlagen, en onafhankelijke telemeter frequenties elimineren overspraak tussen ontvangers. Telemetrie wordt beschouwd als de werkwijze state-of-the-art voor het verzamelen van een groot aantal fysiologische parameters van vrij bewegende dieren zonder artefacten die zich bij het gebruik van dwang, menselijke interactie, of verdoving die vereist zijn andere technieken 8,9.
Sommige van de nadelen van zijn techniek worden geassocieerd met de initiële kosten van het instrument en software. De zenders zijn kwetsbaar en gevoelig voor beschadiging, en de batterij uiteindelijk heeft opraken van de macht en moet worden vervangen. Hoewel het bedrijf biedt aan degenen beschadigde sondes tegen een lagere kostprijs te renoveren, kunnen de kosten nog steeds onbetaalbaar voor een aantal laboratoria.Bovendien kan deze procedure technische uitdaging en praktijk is vereist om betrouwbare bloeddrukmeting bereiken. Ten slotte is er een aantal post-chirurgie gerelateerde mortaliteit, die in handen is ongeveer 5%. Dit kan dramatisch toenemen als een specifieke behandeling worden getest of genetische manipulatie compromissen gezondheid muis.
De volgende kritische factoren zijn essentieel voor de succesvolle uitvoering van de procedure: handhaven weefselhydratie met steriele zoutoplossing gedurende de gehele procedure. Ga altijd de zender met grote zorg; vermijden vast te houden door de druksensor dit kan ertoe leiden dat de gel uit te lekken of beschadiging van de zender. Bij het plaatsen van de katheter, bind de centrale hechtdraad met een dubbele knoop, als een mislukking te doen zal resulteren in de katheter het verlaten van het schip. De vereiste lengte van de katheter dat is in de halsslagader wordt gestoken kan volgens de muizenstam en gewicht die volgens dat bijzonLAR studie. Daarom is het sterk aanbevolen enkele voorlopige experimenten om te bepalen hoe diep de katheter moet worden ingebracht om afsluiting van de aorta voorkomen werking. Tot slot, het toezicht op het dier dagelijks en zorg ervoor dat de huid boven de zender niet wordt uitgerekt of necrotische. Als verlengd necrose of infectie optreedt, euthanaseren van de dieren volgens de institutionele beleid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
- Danaei, G., et al. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. PLoS Med. 6 (4), e1000058 (2009).
- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H.
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al.
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
