Abstract
Under utvecklingen av nya vasoaktiva medel, är av avgörande betydelse för att utvärdera effekten av de nya föreslagna droger arteriella blodtrycksmätning. I själva verket kräver forskning fokuserar på upptäckten av nya potentiella terapeutiska mål med hjälp av genetiskt förändrade möss en pålitlig, långsiktig bedömning av den systemiska arteriella tryckvariationer. För närvarande, den gyllene standarden för att få långtidsmätningar av blodtryck i ambulatorisk möss använder implanterbara radio-sändare, som kräver artärkanyle. Denna teknik eliminerar behovet av uppbindning, besöksförbud, eller anesthetizing djur som inför stress och artefakter under datasampling. Däremot kan arteriella blodtrycks hos möss via kateterisering vara ganska utmanande på grund av den begränsade storleken på artärerna. Här presenterar vi en steg-för-steg guide för att illustrera de avgörande viktiga passager för en framgångsrik subkutan implantation av radio sändare och halspulsådern cannulation i möss. Vi inkluderar även exempel på långsiktiga blodtryck aktivitet tagna från fritt rörliga möss efter en period av post-kirurgi återhämtning. Efter detta förfarande kommer att möjliggöra tillförlitliga direkt blodtrycks inspelningar från flera djur samtidigt.
Introduction
Hypertoni är en av de viktigaste riskfaktorerna för hjärt- och kärlsjukdomar, utan tvekan det är ett stort folkhälsoproblem både i utvecklade länder och utvecklingsländer 1. Flera djurmodeller för experimentell hypertoni har utvecklats för att efterlikna hypertensiva reaktioner som dem som observerats hos människa 2. Bland annat ambulatorisk musen utgör en utmärkt modell för att studera uppkomst och utvecklingen av hypertoni tillåter in vivo analys av konsekvenserna av kronisk exponering för högt blodtryck.
Blodtryck (BP) övervakning i möss har hjälpt forskare att avslöja flera mekanismer som är involverade i fysiologi och patofysiologi sjukdomar såsom högt blodtryck och hjärtsvikt tre, fyra. Faktum är manipulation av musgenomet tillät generering av transgena eller gen inriktade modeller som lämpar sig för att studera hypertoni 5, 6. Men även varsam manipuleringmedvetna möss inducerar excitements som potentiellt kan införa artefakter under datainsamling, medan användning av sedering eller lugnande djupt påverka blodtrycket 7. Dessa aspekter är särskilt viktiga och måste tas i beaktande när man försöker långsiktigt BP övervakning.
Det finns flera sätt att spela in BP i möss, och en jämförelse mellan de vanligaste teknikerna för närvarande är tillgängliga har diskuterats på annat ställe 8, 9. Emellertid de AHA: s rekommendationer för blodtrycksmätning drogs slutsatsen att intraarteriell mätning av BP är i allmänhet föredragna på grund av deras förmåga att direkt mäta BP under en utsträckt tidsperiod 10. Radio-telemetri i kombination med direkt mätning av artärtrycket är state-of-the-art metod för övervakning fysiologiska funktioner i vaken och fritt rörliga försöksdjur samtidigt minimera stress och miljö tillhörande artefakter 9, 11.Radio-telemetri ger möjlighet att automatiskt samla blodtryck, hjärtfrekvens, kroppstemperatur och djur aktivitet från flera medvetna djur.
Även om denna metod har blivit mycket populär i många laboratorier, kan radio telemetri implantation i möss vara tekniskt utmanande. Här visar vi en steg-för-steg-protokoll som illustrerar hur att implantera en tryckomvandlare i möss. Tekniken innebär subkutan införing av sonden i musen kroppen, kanalisera katetern till halsen och framåt nära aortabågen via den vänstra karotisartären. Fjärr fångade data visas live på datorskärmen. Data lagras också för "off-line" analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla djurförsök nämns i denna video-artikeln har granskats och godkänts av Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Tennessee Health Science Center.
Obs: Använd sterila mikrokirurgi instrument under det kirurgiska ingreppet. Kirurgiska instrument kan steriliseras med användning av en infraröd steriliseringsapparat vid en optimal steriliseringstemperatur av 1500 ° F (815,6 ° C). Avståndsmätare kan återanvändas, men innan du sätter den i djuret se till att sterilisera hela sändare enligt tillverkarens anvisningar och att spetsen av katetern har fyllts med en speciell gel som tillhandahålls av tillverkaren.
1. Experimentella Djur
- Skaffa en IACUC godkännande för alla experiment som ska utföras. Samråd med institutionella IACUC rekommenderas om krav på postoperativ smärtstillande användning efter detta förfarande.
- Hålla djuren i cV AT TENBURNA KLI- kontrollerade rum som har en omgivningstemperatur på 21 ° C, 60% relativ fuktighet, och en 12-tim ljus-mörkercykel med fri tillgång till mat och vatten.
Anm: Eftersom mus kroppen har för att rymma den telemetri sonden (cirka 1 cm i diameter x 2 cm långa), är det föredraget att använda möss som väger 20 g eller mer.
2. Anestesi och Operative Framställning
- Väg musen med hjälp av en precisionsskala och spela in sin vikt. Se till att hantera djuret mjukt och tyst.
- Placera djuret i induktionskammaren och stänga den. Inställd syreflödeshastighet vid 0,5 L / min och ställa isofluran koncentration vid 4 - 5%.
- När musen förlorar medvetandet, placera den på en kropp värmeplattan hölls vid 36 - 37 ° C. Bibehålla anestesi via noskonen med isofluran inställd på 2% (hålla flödeshastighet vid 0,5 l / min).
- Framställa de driftsregionerna genom att ta bort hår från baksidan av nacken och than ventrala aspekt av halsen genom att tillämpa hårborttagningskräm.
- Behandla snittet platsen med 3 tillämpningar av kirurgiska scrub (Betadine lösning) omväxlande med 70% isopropylalkohol.
3. kirurgi
- Placera musen i ryggläge. Kontrollera om reflexer genom att klämma foten och justera anestesi tills det inte finns något svar. Göra en ca 1-cm mittlinje snitt nedanför halsen på musen med en skalpell. I den vänstra sidan av snittet skapar en subkutana utrymmet genom att försiktigt separera huden från den underliggande bindväven.
- Vänd på musen, och använda en skalpell för att göra en hud snitt på ca 1,5 cm i rygg vänster sida bakom skulderbladet. Skapa en subkutan ficka längs djurets flank stor nog att rymma anordningen. Sätt sändaren i fickan.
- Sätt en liten hemostat klämma i ryggen snittet och manövrera den subkutant mot den främrehalsöppning. Använda införas-hemostat klämma försiktigt tag en giftfri polyetenrör (4 cm längd x 1 mm ID).
- Dra hemostat tillbaka genom tunneln ut lateralt snitt i ryggen tills slangen sticker ut från både buk och rygg snitt släpper röret från hemostat. Från baksidan, föra in katetern sensorn i röret till tunneln spetsen av tryckavkännande katetern genom halsen. Från halsen främre, dra och ta bort polyetenröret och stäng rygg snitt med hjälp av metallklämmor.
- Försiktigt separera mandibulära körtlar använder steril bomull spets applikatorer och dra den vänstra underkäken körteln med hjälp av en elastisk vistelse krok. Använda spetsig böjda pincett, lokalisera halspulsådern längs den vänstra sidan av luftstrupen. Håll operationsområdet sterila genom att placera och säkra en steril duk.
- Noggrant isolera kärlet från den omgivande vävnaden och försiktigt separeravagusnerven (vitaktig till färgen) som är längs halsartären bort från artären. Var noga med att inte skära eller skada nerv eller artären.
- Passera tre stycken icke absorber 7-0 sutur under den isolerade halspulsådern avsnitt. Knyt hjärn suturen att stänga blodflödet. Dra suturen som är närmast bröstbenet för att tillfälligt täppa till blodflödet från aortan.
- Göra en lös knut med mitten sutur. Detta kommer att användas för att säkra katetern i kärlet. Skär ett litet snitt i artären mellan hjärn och sternala suturer som använder mikro-sax.
- Ta katetern med speciella kärl kanyle pincett, försiktigt så att inte pressa katetern för att förhindra gel förlust från sonden. Försiktigt, ta artären med en fin spets böjda pincett pincett, hämta katetern, och sätta in den i kärlet genom den lilla snittet.
- Dra åt mitten suturen oden runt artären och försiktigt föra kattenheter. Släpp försiktigt suturen som är proximal till bröstbenet och fortsätter att avancera katetern mot den tvärgående aorta.
- Observera markeringen på katetern som ger en ungefärlig index på hur långt katetern måste införas. När punkten är nådd, försiktigt dra både lägre och övre sutur runt katetern. Katetern är fäst vid halspulsådern genom sutur knop.
- Stäng huden snitt med icke absorber 5-0 sutur. När stängd, täta snitt med vävnadslim.
4. Kirurgisk Recovery och BP Mätningar
- Övervaka djur noga för återlämnande av normala arbetsställningar och beteenden. Under 24 timmar efter operationen perioden administrera smärtlindring som leds av en personal veterinär.
- När djuren har återhämtat sig (5 - 7 dagar efter operation), hysa djuren individuellt i en vanlig mus bur placerades ovanpå telemetrimottagaren plattan.
- Vrid den implanterade transmitters "på" och "av" med hjälp av en magnetisk anordning korthet placeras nära djuret från utsidan av buren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data kan förvärvas på distans av en mottagare; spår visualiseras på en datorskärm för kvalitetskontroll (Figur 1a). Detaljer som djur ID, diastoliskt blodtryck och systoliskt blodtryck visas också (Figur 1b). Arteriell BP kan spelas in kontinuerligt (24/7), eller för korta programmerade intervall (dvs 60 sek förvärv varje timme). Data kan automatiskt lagras i en hårddisk för senare analys. Genomsnitt BP data från en 3-dagars kontinuerlig inspelning visas (Figur 2), är det möjligt att uppskatta den dygnsrytm variationen mellan ljus och mörker cykel. Genomsnitt av tryckvariation och hjärtfrekvens beräknades och plottades mot tiden.
Figur 1. Typiska blodtrycks tracings 4 Olika möss Inopererade med telemetriska enhet. (A) kurvor som visar ändringar i realtid arteriella blodtryck (mmHg) över en 5 minuters intervall. Data förvärvas samtidigt från fyra olika vuxna möss 5 dagar efter implantering. (B) Tracing vid högre tidsupplösning utvinns ur A, är det möjligt att uppskatta blodtryck diastoliska och systoliska värden, BP cykel varaktighet, och hjärtfrekvens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Långtids Arteriellt blodtryck Shows Circadian Rhythm Variation. Medelvärdestryckdata som visar värdena för (A) systoliskt tryck (SP), (B) diastoliskt tryck (DP), (C) det genomsnittliga arteriella trycket (MAP), och (D) hjärta rate uttryckt i slag / min. Data extraherades från kontinuerliga mätningar gjorda under dagen (ljus cykel, L) eller natten (mörk cykel, D). Inspelning började 7 dagar efter operationen. Alla data uttrycks som medelvärde ± SEM (n = 4 möss). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Implanterbara radio telemetri har förbättrats avsevärt under de senaste tio åren; mindre sond storlek gör implantatet mindre traumatisk för djuret, hjälper förlängd batteritid för att minska kostnaderna, och oberoende telemeter frekvenser eliminera överhörning mellan mottagare. Telemetri anses vara den state-of-the-art-metoden för uppsamling av en mängd olika fysiologiska parametrar från att fritt rörliga djur utan artefakter i samband med användning av återhållsamhet, mänsklig interaktion, eller bedövning som krävs av andra tekniker 8,9.
Emellertid vissa av nackdelarna med hans teknik är förknippade med de initiala kostnaderna för instrumentet och programvara. Sändarna är sköra och känsliga för skador, och batteriet så småningom gör slut på ström och behöver bytas ut. Även om företaget erbjuder sig att renovera de skadade sonder till en lägre kostnad, kan kostnaden bli ännu oöverkomliga för vissa laboratorier.Dessutom kan detta förfarande vara tekniskt utmanande och praxis krävs för att uppnå tillförlitlig blodtrycksmätning. Slutligen finns det några post-operation associerad dödlighet, vilket i våra händer är ca 5%. Detta kan dramatiskt öka om en specifik behandling måste testas eller om en genetisk manipulation äventyrar musen hälsa.
Följande kritiska faktorer är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av förfarandet: hålla vävnader hydrering med steril koksaltlösning under hela förfarandet. Hantera alltid sändaren med stor omsorg; undvika att hålla den av trycksensorn eftersom detta kan orsaka att gelén läcka ut eller skada sändaren. När du sätter katetern binda den centrala suturen med en dubbelknut, som underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i katetern lämnar fartyget. Den erforderliga längden av katetern som måste införas i hals kan ändras beroende på musstam och vikt som användes i det särlar studie. Därför är det starkt rekommenderat att köra några preliminära experiment för att bestämma hur djupt katetern måste sättas in för att undvika ocklusion av aorta. Slutligen, övervaka djuret dagligen och se till att huden ovanför sändaren inte sträcks eller nekrotisk. Om utökad nekros eller infektion uppstår, avliva djuren enligt institutionella politik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
- Danaei, G., et al. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. PLoS Med. 6 (4), e1000058 (2009).
- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H.
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al.
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
