Abstract
Durante o desenvolvimento de novos agentes vasoativos, monitorização da pressão sanguínea arterial é crucial para avaliar a eficácia dos novos medicamentos propostos. De fato, a pesquisa com foco na descoberta de novos alvos terapêuticos potenciais usando ratos geneticamente modificados exige uma avaliação fiável e de longo prazo da variação da pressão arterial sistêmica. Atualmente, o padrão ouro para a obtenção de medidas de longo prazo da pressão arterial em ratos ambulatoriais utiliza rádio-transmissores implantáveis, que exigem canulação da artéria. Esta técnica elimina a necessidade de tethering, restringindo ou anestesiar os animais que introduzem o stress e artefatos durante a amostragem de dados. No entanto, a monitorização da pressão arterial em ratos através de cateterismo pode ser bastante desafiador, devido ao pequeno tamanho das artérias. Aqui nós apresentamos um guia passo-a-passo para ilustrar as passagens-chave cruciais para a implantação subcutânea bem sucedida de rádio-transmissores e artéria carótida cannulation em ratinhos. Nós também incluímos exemplos de atividade pressão arterial a longo prazo retiradas de ratos movimentando-se livremente após um período de recuperação pós-cirurgia. Após este procedimento permitirá gravações de pressão arterial direta de confiança de vários animais ao mesmo tempo.
Introduction
A hipertensão arterial é um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares, sem dúvida, é um grande problema de saúde pública tanto nos países desenvolvidos e em desenvolvimento 1. Vários modelos animais de hipertensão experimentais têm sido desenvolvidos para imitar respostas hipertensivas, como as observadas em humanos 2. Entre outros, o mouse ambulatório representa um excelente modelo para o estudo da gênese e progressão da hipertensão permitindo a análise in vivo das consequências da exposição crônica à hipertensão.
Pressão arterial (PA) de monitoramento em camundongos tem ajudado os pesquisadores a desvendar vários mecanismos envolvidos na fisiologia e fisiopatologia de doenças como hipertensão e insuficiência cardíaca 3, 4. Com efeito, a manipulação do genoma de ratinho permitiu a geração de modelos transgénicos ou alvejado para o gene apropriado para o estudo da hipertensão 5, 6. No entanto, mesmo a manipulação suavede ratos conscientes induz excitações que podem potencialmente causadores de artefatos durante a aquisição de dados, enquanto o uso de sedação ou tranquilizantes afetar profundamente a pressão arterial 7. Estes aspectos são particularmente importantes e devem ser levados em consideração ao tentar monitoramento BP longo prazo.
Existem várias maneiras de gravar BP em ratos, e uma comparação entre as técnicas mais comuns atualmente disponíveis tem sido discutido em outra parte 8, 9. No entanto, as recomendações da AHA de medição BP concluiu que a medição intra-arterial da pressão arterial são geralmente preferidos devido à sua capacidade para medir directamente PA ao longo de um período prolongado de tempo 10. Radiotelemetria juntamente com medida direta da pressão arterial é o método state-of-the-art para monitorar as funções fisiológicas no acordado e movendo-se livremente animais de laboratório, minimizando o estresse e artefatos ambientalmente associados 9, 11.Radiotelemetria oferece a capacidade de recolher automaticamente a pressão arterial, freqüência cardíaca, temperatura corporal e atividade animal provenientes de vários animais conscientes.
Embora esta metodologia está se tornando muito popular em muitos laboratórios, implantação de rádio-telemetria em camundongos pode ser tecnicamente desafiadora. Aqui, mostramos um protocolo passo-a-passo que ilustra como a implantação de um transdutor de pressão em ratinhos. A técnica envolve a inserção subcutânea da sonda no corpo do rato, canalizar o cateter para o pescoço e para a frente perto do arco aórtico através da artéria carótida esquerda. dados remotamente capturados são mostrados ao vivo no monitor do computador. Os dados também são armazenados para análise "off-line".
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Protocol
declaração de ética: Todos os procedimentos com animais mencionados neste vídeo-artigo foram revistos e aprovados pela Comissão de animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade de Tennessee Health Science Center.
Nota: Utilize instrumentos de microcirurgia estéreis durante todo o procedimento cirúrgico. Os instrumentos cirúrgicos podem ser esterilizadas utilizando um esterilizador de infravermelhos a uma temperatura de esterilização óptima de 1500 ° F (815,6 ° C). Telémetros pode ser reutilizado, no entanto, antes de o introduzir no animal certificar-se para esterilizar todo o transmissor de acordo com as instruções do fabricante e que a ponta do cateter foi novamente cheio com um gel especial fornecida pelo fabricante.
1. Animais Experimentais
- Obter uma aprovação IACUC para todos os experimentos que serão executadas. Consulta com IACUC institucional é altamente recomendado em relação aos requisitos para uso de analgésicos no pós-operatório após este procedimento.
- Manter os animais em cquartos controlados por limate com uma temperatura ambiente de 21 ° C, 60% de humidade relativa, e um ciclo de luz-escuro de 12 h com livre acesso a comida e água.
Observação: Uma vez que o corpo do ratinho tem para acomodar a sonda de telemetria (approximatively 1 cm de diâmetro x 2 cm de comprimento), é preferível utilizar ratinhos que pesam de 20 g ou mais.
2. Anestesia e Preparação operativo
- Pesar o rato usando uma balança de precisão e registar o peso. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente.
- Colocar o animal na câmara de indução e fechá-lo. Ajustar a taxa de fluxo de oxigênio em 0,5 L / min e definir concentração de isoflurano em 4-5%.
- Quando o mouse perde a consciência, coloque-o em uma placa de aquecimento corporal mantida a 36-37 ° C. Manter a anestesia via nosecone com o conjunto de isoflurano a 2% (manter a taxa de fluxo de 0,5 L / min).
- Preparar as regiões de operação, removendo o cabelo da parte de trás do pescoço e tele aspecto ventral do pescoço, aplicando creme de depilação.
- Tratar o local da incisão com 3 aplicações de paramentação (solução de betadine) alternando com álcool isopropílico 70%.
3. Cirurgia
- Posicione o mouse na posição supina. Verifique se há reflexos comprimindo o pé, e ajustar a anestesia até que não haja resposta. Realizar uma incisão na linha média, aproximadamente, 1 cm abaixo do pescoço do rato com um bisturi. No lado esquerdo do corte criar um espaço subcutâneo, separando cuidadosamente a pele a partir do tecido conjuntivo subjacente.
- Virar o mouse e usar um bisturi para fazer uma incisão na pele de aproximadamente 1,5 cm de lado dorsal deixou para trás a escápula. Criar uma bolsa subcutânea ao longo do flanco do animal grande o suficiente para acomodar o dispositivo. Insira o transmissor no bolso.
- Insira uma pequena pinça hemostática na incisão para trás e manobrá-lo por via subcutânea para a anteriorabertura do pescoço. Usando a pinça hemostática-inserido, suavemente compreender um tubo de polietileno não-tóxico (4 cm de comprimento x 1 mm de diâmetro).
- Puxar a hemostática de volta através do túnel para a incisão lateral na parte de trás até que o tubo se projecta a partir de ambos incisão abdominal e dorsal, libertar o tubo a partir da pinça hemostática. A partir da parte traseira, inserir o sensor de cateter para dentro do tubo de túnel a ponta do cateter de detecção de pressão através do pescoço. Do anterior do pescoço, puxar e retirar o tubo de polietileno e fechar a incisão dorsal utilizando grampos metálicos.
- Separe cuidadosamente as glândulas mandibulares, utilizando aplicadores com ponta de algodão estéril e retirar a glândula mandibular esquerda, utilizando uma estadia gancho elástico. Usando uma pinça curva de ponta fina, localize a artéria carótida ao longo do lado esquerdo da traquéia. Mantenha o local da cirurgia estéril, colocando e garantir uma cortina estéril.
- Cuidadosamente isolar o vaso do tecido circundante e suavemente separar onervo vago (de cor esbranquiçada) que está ao longo da artéria carótida de distância a partir da artéria. Tenha cuidado para não cortar ou danificar o nervo ou artéria.
- Passe três pedaços de não-absorvível 7-0 sutura abaixo da seção artéria carótida isolado. Amarre a sutura craniana para fechar o fluxo de sangue. Puxar o fio de sutura que está mais próxima do esterno para ocluir temporariamente o fluxo de sangue a partir da aorta.
- Faça um nó frouxo usando a sutura do meio. Isto irá ser utilizado para segurar o cateter no vaso. Corte uma pequena incisão na artéria entre o crânio e as suturas esternais usando micro-tesoura.
- Agarre o cateter com uma pinça especial de punção embarcação, tendo o cuidado de não apertar o cateter para evitar a perda de gel da sonda. Gentilmente, pegue a artéria com uma ponta fina curvas pinças pinças, recuperar o cateter, e inseri-lo no vaso através da pequena incisão.
- Apertar o nó de sutura meio ao redor da artéria e gentilmente avançar o gatoheter. Gentilmente liberar a sutura que é proximal ao esterno e continuar a avançar o cateter para a aorta transversal.
- Observar a marca no cateter que dá um índice aproximado de quão longe o cateter tem de ser inserido. Uma vez que o ponto é atingido, apertar ligeiramente inferior tanto a sutura e a parte superior em torno do cateter. O cateter é fixado ao da artéria carótida por nós de sutura.
- Feche a incisão na pele com os não-absorvível 5-0 sutura. Uma vez fechado, selar a incisão com adesivo de tecido.
4. Medidas de recuperação e BP cirúrgicos
- Monitorar animais de perto para o retorno de posturas e comportamentos normais. Durante a 24 horas pós-cirurgia analgesia período de administrar como dirigido por um veterinário equipe.
- Uma vez que os animais se recuperaram (5 - 7 dias após a cirurgia), abrigá-los individualmente em uma gaiola regular de rato colocado em cima do prato receptor de telemetria.
- Vire o tr implantadoansmitters "ON" e "OFF" usando um dispositivo magnético brevemente posicionado perto do animal a partir do lado de fora da gaiola.
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Representative Results
Os dados podem ser adquiridos à distância através de um receptor; traços são visualizados na tela do computador para controle de qualidade (Figura 1a). Detalhes como ID animal, pressão diastólica e pressão arterial sistólica também são mostrados (Figura 1b). Arterial BP podem ser gravadas continuamente (24/7), ou por curtos intervalos programados (ou seja, 60 seg aquisição a cada hora). Os dados podem ser automaticamente armazenada num disco rígido para análise posterior. Média de dados de PA a partir de uma gravação contínua de 3 dias são mostrados (Figura 2), é possível apreciar a variação do ritmo circadiano entre o ciclo escuro e à luz. Média da taxa de variação da pressão e do coração foram calculados e plotados contra o tempo.
Figura 1. Os traçados de pressão arterial típicos de 4 ratos diferentes implantados com Telemetric dispositivos. Traçados (A) que mostram alterações da pressão sanguínea arterial em tempo real (mm Hg) durante um intervalo de 5 min. Os dados são adquiridos em simultâneo a partir de quatro diferentes ratinhos adultos 5 dias após a implantação. (B) Rastreamento em maior resolução temporal extraído de A, é possível apreciar arterial diastólica pressão e valores sistólica, duração do ciclo BP, e da frequência cardíaca. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Pressão Figura 2. longo prazo Arterial Mostra Ritmo Circadiano variação. Dados de pressão média que ilustram os valores para (A) Pressão sistólica (SP), (B) da pressão diastólica (DP), (C) pressão arterial média (MAP), e (D) ra coraçãote expressa em batimentos / min. Os dados foram extraídos de gravações contínuas tomadas durante o dia (ciclo de luz, L) ou da noite (ciclo escuro, D). A gravação começou a 7 dias pós-cirurgia. Todos os dados são expressos como média ± SEM (n = 4 ratos). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Implantável radio-telemetria tem melhorado significativamente ao longo da última década; o tamanho da sonda menor faz o implante menos traumática para o animal, a vida da bateria prolongada ajuda a reduzir os custos e frequências Telemeter independentes eliminar crosstalk entre receptores. Telemetria é considerado o método state-of-the-art para a recolha de uma grande variedade de parâmetros fisiológicos de se mover livremente animais sem os artefatos associados com o uso da contenção, a interação humana, ou anestesia que são exigidas por outras técnicas de 8,9.
No entanto, algumas das desvantagens da sua técnica estão associados com os custos iniciais do instrumento e de software. Os transmissores são frágeis e suscetíveis a danos e a bateria, eventualmente, é executado fora do poder e precisam ser substituídos. Embora a empresa oferece para reformar as sondas danificadas a um custo menor, o custo pode ser ainda proibitivo para alguns laboratórios.Além disso, este procedimento pode ser tecnicamente desafiadora e prática é necessária para conseguir uma medição BP confiável. Finalmente, há alguns pós-cirurgia mortalidade associada, que nas nossas mãos é de cerca de 5%. Isto pode aumentar dramaticamente se um tratamento específico tem de ser testado, ou se uma manipulação genética compromete a saúde do rato.
Os seguintes fatores críticos são essenciais para a execução bem-sucedida do procedimento: manter a hidratação do tecido com solução salina estéril durante todo o procedimento. Sempre manuseie o transmissor com muito cuidado; evitar segurando-o pelo sensor de pressão, pois isso pode fazer com que o gel a vazar ou danificar o transmissor. Ao inserir o cateter, amarrar a sutura central com um nó duplo, como a incapacidade de fazer isso resultará no cateter sair do navio. O comprimento requerido do cateter que tem de ser inserido na artéria carótida pode mudar de acordo com a estirpe de ratinho e de peso usado em que partiestudo lar. Portanto, é altamente recomendável para executar um experimento preliminar para determinar o quão profundo o cateter deve ser inserido para evitar a oclusão da aorta. Finalmente, monitorar o animal diariamente e certificar-se de que a pele acima do transmissor não está esticado ou necrótico. Se ocorrer a necrose ou infecção estendida, a eutanásia dos animais de acordo com a política institucional.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
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