Abstract
Au cours du développement de nouveaux agents vasoactifs, la surveillance artérielle de la pression artérielle est cruciale pour évaluer l'efficacité des nouveaux médicaments proposés. En effet, la recherche axée sur la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles en utilisant des souris génétiquement modifiées nécessite une évaluation fiable, à long terme de la variation systémique de la pression artérielle. À l'heure actuelle, la norme d'or pour obtenir des mesures à long terme de la pression artérielle chez les souris ambulatoires utilise des radio-transmetteurs implantables, qui nécessitent cathétérisme de l'artère. Cette technique élimine la nécessité d'attacher, retenir ou anesthésier les animaux qui introduisent le stress et les artefacts lors de l'échantillonnage de données. Toutefois, la surveillance de la pression artérielle sanguine chez des souris par l'intermédiaire de cathétérisation peut être plutôt difficile en raison de la petite taille des artères. Nous présentons ici un guide étape par étape pour illustrer les passages clés cruciaux pour une implantation sous-cutanée réussie de radio-émetteurs et l'artère carotide cannellation chez la souris. Nous incluons également des exemples d'activité de la pression artérielle à long terme prélevées sur des souris se déplaçant librement après une période de récupération post-opératoire. Suite à cette procédure permettra des enregistrements de pression artérielle directe fiables provenant de plusieurs animaux en même temps.
Introduction
L' hypertension est l' un des principaux facteurs de risque de maladies cardio - vasculaires, sans doute , il est un problème majeur de santé publique dans les pays développés et en développement 1. Plusieurs modèles animaux d'hypertension expérimentales ont été développées pour mimer les réponses hypertensives , comme ceux observés chez les humains 2. Entre autres, la souris ambulatoire représente un excellent modèle pour étudier la genèse et la progression de l' hypertension permettant l'analyse in vivo des conséquences de l' exposition chronique à l' hypertension.
La pression artérielle (BP) suivi chez la souris a permis aux chercheurs de démêler plusieurs mécanismes impliqués dans la physiologie et la physiopathologie des maladies telles que l' hypertension et l' insuffisance cardiaque 3, 4. En effet, la manipulation du génome de la souris a permis la génération de modèles transgéniques ou des gènes ciblés adapté à l' étude de l' hypertension 5, 6. Cependant, même manipulation doucede souris consciente induit excitations qui peuvent potentiellement introduire des artefacts lors de l' acquisition de données, tandis que l' utilisation de la sédation ou de tranquillisants affectent profondément la pression artérielle 7. Ces aspects sont particulièrement importants et doivent être pris en considération lors d'une tentative à long terme BP surveillance.
Il y a plusieurs façons d'enregistrer BP chez la souris, et une comparaison entre les techniques les plus courantes actuellement disponibles a été discuté ailleurs 8, 9. Toutefois, les recommandations de l' AHA pour la mesure BP a conclu que la mesure intra-artérielle de BP sont généralement préférés en raison de leur capacité à mesurer directement BP sur une longue période de temps 10. Radio-télémétrie couplée à la mesure directe de la pression artérielle est la méthode state-of-the-art pour la surveillance des fonctions physiologiques chez éveillé et se déplacer librement les animaux de laboratoire , tout en minimisant le stress et les artefacts de l' environnement associés 9, 11.Radio-télémesure offre la possibilité de collecter automatiquement la pression sanguine, le rythme cardiaque, la température corporelle et l'activité des animaux provenant de plusieurs animaux conscients.
Bien que cette méthodologie est devenu très populaire dans de nombreux laboratoires, radio-télémétrie implantation chez la souris peut être techniquement difficile. Ici, nous montrons un protocole étape par étape, qui illustre l'implantation d'un capteur de pression chez la souris. La technique implique l'insertion sous-cutanée de la sonde dans le corps de la souris, le canal du cathéter vers le col et le transmet à proximité de la crosse de l'aorte via l'artère carotide gauche. les données capturées à distance sont présentés en direct sur l'écran d'ordinateur. Les données sont également stockées pour une analyse "off-line".
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Protocol
déclaration éthique: Toutes les procédures animales mentionnées dans cette vidéo-article ont été examinés et approuvés par le Comité des soins aux animaux et de l'utilisation (IACUC) à l'Université du Tennessee Health Science Center.
Remarque: Utilisez des instruments de microchirurgie stériles tout au long de la procédure chirurgicale. Les instruments chirurgicaux peuvent être stérilisés en utilisant un stérilisateur infrarouge à une température de stérilisation optimale de 1 500 ° F (815,6 ° C). Télémètres peuvent être réutilisés, cependant, avant de l'insérer dans l'animal assurez-vous de stériliser l'ensemble de l'émetteur selon les instructions du fabricant et que la pointe du cathéter a été rempli avec un gel spécial fourni par le fabricant.
1. animaux d'expérimentation
- Obtenir une approbation IACUC pour toutes les expériences qui seront effectuées. Consultation avec IACUC institutionnelle est fortement recommandé en ce qui concerne les exigences pour l'utilisation analgésique post-opératoire après cette procédure.
- Gardez les animaux dans cchambres limat contrôlée ayant une température ambiante de 21 ° C, 60% d'humidité relative, et un cycle de lumière-obscurité de 12 heures avec un accès libre à la nourriture et de l'eau.
Remarque: Le corps de la souris doit recevoir la sonde de télémétrie (1 cm de diamètre documentaire Environ x 2 cm de long), il est préférable d'utiliser des souris pesant 20 g ou plus.
2. Anesthésie et préparation opérationnelle
- Peser la souris à l'aide d'une balance de précision et d'enregistrer son poids. Assurez-vous de traiter doucement et tranquillement l'animal.
- Placez l'animal dans la chambre d'induction et la fermer. Régler le débit d'oxygène à 0,5 L / min et régler la concentration d'isoflurane à 4-5%.
- Lorsque la souris perd conscience, placez-le sur une plaque de réchauffement du corps maintenu à 36-37 ° C. Maintenir l'anesthésie via nosecone avec l'ensemble de l'isoflurane à 2% (maintenir le débit à 0,5 L / min).
- Préparer les zones d'exploitation en enlevant les cheveux de l'arrière du cou et til face ventrale du cou en appliquant la crème d'épilation.
- Traiter le site d'incision avec 3 applications de lavage chirurgical (solution de bétadine) en alternance avec 70% d'alcool isopropylique.
3. Surgery
- Placez la souris dans une position couchée. Vérifiez réflexes en pinçant le pied, et ajuster l'anesthésie jusqu'à ce qu'il n'y a pas de réponse. Faire un environ 1 cm incision médiane en dessous du col de la souris avec un scalpel. Dans le côté gauche de la coupe de créer un espace sous-cutané en séparant soigneusement la peau du tissu conjonctif sous-jacent.
- Retournez la souris et utiliser un scalpel pour faire une incision cutanée d'environ 1,5 cm dans la dorsale gauche derrière l'omoplate. Créer une poche sous-cutanée le long du flanc de l'animal assez grand pour accueillir l'appareil. Insérez l'émetteur dans la poche.
- Insérez une petite pince hémostatique dans l'incision arrière et manoeuvrer sous-cutanée à la partie antérieureouverture du cou. Utilisation de la pince insérée-hémostatique, saisissez doucement un tube en polyéthylène non-toxique (4 cm de longueur x 1 mm ID).
- Tirez le hémostatique à travers le tunnel sur l'incision latérale dans le dos jusqu'à ce que le tube dépasse à la fois l'incision abdominale et dorsale, libérer le tube du hémostatique. De l'arrière, insérez le capteur de cathéter dans le tube pour le tunnel de la pointe du cathéter de détection de pression à travers le col. De la partie antérieure du cou, tirer et retirer le tube de polyéthylène et fermer l'incision dorsale en utilisant des pinces métalliques.
- Séparez soigneusement les glandes mandibulaires utilisant coton stérile pointe applicateurs et se rétracter la glande mandibulaire gauche à l'aide d'un séjour élastique crochet. En utilisant des pinces courbes à pointe fine, localiser l'artère carotide le long du côté gauche de la trachée. Gardez le site chirurgical stérile par placer et fixer un champ stérile.
- isoler soigneusement la cuve du tissu environnant et doucement séparer lenerf vague (couleur blanchâtre) qui est le long de l'artère carotide loin de l'artère. Veillez à ne pas couper ou endommager le nerf ou l'artère.
- Passez trois morceaux de non-absorbable 7-0 suture sous la section de l'artère carotide isolé. Attachez la suture crânienne pour fermer le flux sanguin. Tirer le fil de suture qui est le plus proche du sternum pour occlure temporairement la circulation sanguine de l'aorte.
- Faire un nœud lâche en utilisant la suture milieu. Ceci sera utilisé pour fixer le cathéter dans le vaisseau. Couper une petite incision dans l'artère entre le crâne et les sutures sternales utilisant des micro-ciseaux.
- Prenez le cathéter avec une pince spéciale navire de canulation, en prenant soin de ne pas presser le cathéter pour éviter la perte de gel de la sonde. Doucement, prenez l'artère avec une pince à épiler pointe fine incurvées forceps, récupérer le cathéter, et l'insérer dans le récipient à travers la petite incision.
- Serrer le nœud de suture milieu autour de l'artère et de faire avancer doucement le chatheter. Relâchez doucement la suture qui est proximal au sternum et continuer à faire avancer le cathéter vers l'aorte transverse.
- Observer la marque sur le cathéter qui donne un indice approximatif de savoir jusqu'où le cathéter doit être inséré. Une fois que le point est atteint, serrez légèrement à la fois le plus bas et la suture supérieure autour du cathéter. Le cathéter est fixé sur l'artère carotide par des nœuds de suture.
- Fermer l'incision de la peau avec des non-absorbable 5-0 suture. Une fois fermé, sceller l'incision avec de la colle tissulaire.
4. Les mesures de récupération et BP chirurgicaux
- Surveiller de près l'animal pour le retour des postures et des comportements normaux. Au cours de la période post-opératoire administrer l'analgésie 24 h tel que prescrit par un vétérinaire du personnel.
- Une fois que les animaux ont récupéré (5 - 7 jours après la chirurgie), les loger individuellement dans une cage de la souris régulière placée sur le dessus de la plaque de récepteur de télémétrie.
- Tourner le tr implantéansmitters "sur" et "off" en utilisant un dispositif magnétique brièvement positionnés près de l'animal à partir de l'extérieur de la cage.
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Representative Results
Les données peuvent être acquises à distance par un récepteur; les traces sont visualisées sur un écran d'ordinateur pour le contrôle de la qualité (figure 1a). Des détails tels que l' identification des animaux, la pression artérielle diastolique et la pression artérielle systolique sont également représentés (figure 1b). Pression sanguine artérielle peut être enregistrée en continu (24/7) ou pour de courts intervalles programmés ( par exemple, 60 l' acquisition de secondes toutes les heures). Les données peuvent être mémorisées automatiquement dans un disque dur pour une analyse ultérieure. BP données moyennées à partir d' un enregistrement continu de 3 jours sont représentés (figure 2), il est possible d'apprécier la variation du rythme circadien entre cycle d' obscurité et de lumière. Moyenne de la variation de la pression et la fréquence cardiaque ont été calculés et en fonction du temps.
Figure 1. Tracés de pression artérielle typiques de 4 Différentes souris implantées avec télémétrique périphériques. (A) Les tracés montrant les variations de pression artérielle en temps réel (mm Hg) pendant un intervalle de 5 min. Les données sont acquises simultanément à partir de quatre souris différentes adultes 5 jours après l'implantation. (B) Tracing à une résolution temporelle plus élevée extrait de A, il est possible d'apprécier le sang diastolique de pression et les valeurs systolique, la durée du cycle BP, et le rythme cardiaque. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure Arterial 2. long terme Pression artérielle Affiche rythme circadien Variation. Données de pression moyennées illustrant les valeurs de (A) la pression systolique (SP), (B) de la pression diastolique (DP), (C) moyenne pression artérielle (MAP), et (D) ra cardiaquete exprimé en battements / min. Les données ont été extraites des enregistrements continus prises au cours de la journée (cycle de lumière, L) ou de nuit (cycle d'obscurité, D). Enregistrement a commencé 7 jours après la chirurgie. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SEM (n = 4 souris). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Implantable radiotélémesure a amélioré de manière significative au cours de la dernière décennie; petite taille de la sonde rend l'implant moins traumatisante pour l'animal, la vie de la batterie prolongée aide à réduire les coûts, et les fréquences de télémètre indépendantes éliminer la diaphonie entre les récepteurs. Telemetry est considérée comme la méthode state-of-the-art pour collecter une grande variété de paramètres physiologiques de se déplacer librement des animaux sans les artefacts associés à l'utilisation de la contention, l' interaction humaine, ou l' anesthésie qui sont requis par d' autres techniques 8,9.
Cependant, certains des inconvénients de sa technique sont associés aux coûts initiaux de l'instrument et du logiciel. Les émetteurs sont fragiles et susceptibles d'être endommagés et la batterie finit par ne manquer de puissance et doivent être remplacés. Bien que la société propose de remettre à neuf ces sondes endommagées à un coût moindre, le coût peut être encore prohibitif pour certains laboratoires.En outre, cette procédure peut être techniquement difficile et la pratique est nécessaire pour obtenir une mesure fiable BP. Enfin, il y a un post-chirurgie associée la mortalité, qui dans nos mains est d'environ 5%. Cela peut considérablement augmenter si un traitement spécifique doit être testé ou si une manipulation génétique compromet la santé de la souris.
Les facteurs critiques suivants sont essentiels à la bonne exécution de la procédure: maintenir le tissu hydratation avec une solution saline stérile pendant toute la procédure. Toujours manipuler l'émetteur avec grand soin; éviter le tenant par le capteur de pression car cela peut provoquer le gel une fuite ou d'endommager l'émetteur. Lors de l'insertion du cathéter, attacher la suture centrale avec un double nœud, que le défaut de le faire se traduira par le cathéter sortant du récipient. La longueur requise du cathéter qui doit être inséré dans la carotide peut varier en fonction de la souche de souris et le poids utilisé dans ce particuétude lar. Par conséquent, il est fortement recommandé d'exécuter une certaine expérience préliminaire afin de déterminer à quelle profondeur le cathéter doit être inséré pour éviter l'occlusion de l'aorte. Enfin, surveiller l'animal par jour et assurez-vous que la peau au-dessus de l'émetteur ne soit pas étiré ou nécrotiques. Si une nécrose ou une infection prolongée se produit, euthanasier les animaux conformément à la politique institutionnelle.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
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