Abstract
Durante lo sviluppo di nuovi agenti vasoattivi, monitoraggio della pressione arteriosa è cruciale per valutare l'efficacia di nuovi farmaci proposti. In effetti, la ricerca incentrata sulla scoperta di nuovi potenziali bersagli terapeutici utilizzando topi geneticamente modificati richiede un giudizio affidabile a lungo termine della variazione di pressione arteriosa sistemica. Attualmente, il gold standard per l'ottenimento di misure a lungo termine della pressione sanguigna nei topi ambulatoriali utilizza impiantabili di radio-trasmettitori, che richiedono incannulamento arteria. Questa tecnica elimina la necessità di legare, immobilizzare o anestetizzare gli animali che introducono stress e manufatti durante il campionamento dei dati. Tuttavia, il monitoraggio della pressione arteriosa nei topi tramite cateterizzazione può essere piuttosto difficile a causa delle ridotte dimensioni delle arterie. Qui vi presentiamo una guida passo-passo per illustrare i passaggi chiave cruciali per un impianto sottocutaneo di successo di radio-trasmettitori e carotide cannulation nei topi. Abbiamo anche esempi di attività di pressione sanguigna a lungo termine presi dai topi liberi di muoversi dopo un periodo di recupero post-operatorio. A seguito di questa procedura consentirà registrazioni della pressione sanguigna diretta affidabili da più animali contemporaneamente.
Introduction
L'ipertensione è uno dei principali fattori di rischio per le malattie cardiovascolari, senza dubbio si tratta di un grave problema di salute pubblica sia nei paesi sviluppati e in via di sviluppo 1. Diversi modelli animali di ipertensione sperimentale sono stati sviluppati per imitare risposte ipertensive come quelle osservate nell'uomo 2. Tra gli altri, il mouse ambulatoriale rappresenta un ottimo modello per studiare la genesi e la progressione dell'ipertensione permettendo nell'analisi vivo delle conseguenze dell'esposizione cronica a ipertensione.
La pressione sanguigna (BP) monitoraggio nei topi ha aiutato i ricercatori a svelare diversi meccanismi coinvolti nella fisiologia e fisiopatologia delle malattie come l'ipertensione e insufficienza cardiaca 3, 4. Infatti, la manipolazione del genoma del topo permesso generazione di transgenici o modelli gene targeting adatto per studiare l'ipertensione 5, 6. Tuttavia, anche la manipolazione delicatadi topi consapevole induce emozioni che possono potenzialmente introdurre artefatti durante l'acquisizione dei dati, mentre l'uso di sedazione o tranquillanti profondamente influenzare la pressione sanguigna 7. Questi aspetti sono particolarmente importanti e devono essere presi in considerazione quando si tenta di monitoraggio a lungo termine BP.
Ci sono diversi modi per registrare BP nei topi, e un confronto tra le tecniche più comuni attualmente disponibili sono stati discussi altrove 8, 9. Tuttavia, le raccomandazioni AHA per la misurazione BP concluso che la misurazione endoarteriosa di BP sono generalmente preferiti per la loro capacità di misurare direttamente BP per un periodo prolungato di tempo 10. Radio-telemetria accoppiato con la misura diretta della pressione arteriosa è il metodo di state-of-the-art per il monitoraggio delle funzioni fisiologiche in sveglio e liberi di muoversi animali da laboratorio, riducendo al minimo lo stress e manufatti per l'ambiente associati 9, 11.Radio-telemetria offre la possibilità di raccogliere automaticamente la pressione arteriosa, frequenza cardiaca, la temperatura corporea e l'attività degli animali provenienti da animali coscienti multipli.
Anche se questa metodologia sta diventando molto popolare in molti laboratori, radio-telemetria impianto in topi può essere tecnicamente impegnativo. Qui mostriamo un protocollo passo-passo che illustra come impiantare un trasduttore di pressione nei topi. La tecnica prevede l'inserimento sottocutaneo della sonda nel corpo del mouse, incanalare il catetere al collo e in avanti vicino all'arco aortico attraverso l'arteria carotide sinistra. dati in remoto catturati vengono trasmesse in diretta sul monitor del computer. I dati sono memorizzati anche per l'analisi "off-line".
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Protocol
Etica dichiarazione: Tutte le procedure origine animale di cui in questo video-articolo è stato esaminato e approvato dal Comitato di cura e l'uso di animali (IACUC) presso l'Università del Tennessee Health Science Center.
Nota: utilizzare gli strumenti di microchirurgia sterili durante tutta la procedura chirurgica. Gli strumenti chirurgici possono essere sterilizzati utilizzando uno sterilizzatore infrarossa ad una temperatura ottimale di sterilizzazione 1.500 ° F (815,6 ° C). Telemetri possono essere riutilizzati, tuttavia, prima di inserirla nell'animale assicurarsi di sterilizzare l'intero trasmettitore secondo le istruzioni del produttore e che la punta del catetere è stata riempita con un gel speciale fornito dal produttore.
1. Gli animali sperimentali
- Ottenere l'approvazione IACUC per tutti gli esperimenti che verranno eseguite. La consultazione con IACUC istituzionale è altamente raccomandato per quanto riguarda i requisiti per l'uso di analgesici post-operatorio dopo questa procedura.
- Tenere gli animali in ccamere limate controllata aventi una temperatura ambiente di 21 ° C, 60% umidità relativa, e un ciclo luce-buio di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua.
Nota: Perché il corpo del mouse deve accogliere la sonda telemetria (approssimativamente 1 cm di diametro x 2 cm di lunghezza), è preferibile utilizzare i topi che pesano 20 grammi.
2. Anestesia e preparazione Operativo
- Pesare il mouse usando una bilancia di precisione e registrare il suo peso. Assicurati di gestire l'animale dolcemente e silenziosamente.
- Posto l'animale nella camera di induzione e chiuderlo. Impostare la velocità del flusso di ossigeno a 0,5 L / min e impostare la concentrazione isoflurano al 4-5%.
- Quando il mouse perde conoscenza, metterlo su un piatto corpo riscaldamento mantenuto a 36-37 ° C. Mantenere l'anestesia tramite nosecone con set isoflurano al 2% (tenere a portata di 0,5 l / min).
- Preparare le regioni di funzionamento rimuovendo i capelli dalla parte posteriore del collo e tegli faccia ventrale del collo mediante l'applicazione di crema depilatoria.
- Trattare il sito di incisione con 3 applicazioni di lavaggio chirurgico (soluzione betadine) in alternanza con il 70% di alcol isopropilico.
3. Chirurgia
- Posizionare il mouse in posizione supina. Verificare la presenza di riflessi pizzicare il piede, e regolare l'anestesia fino a quando non vi è alcuna risposta. Effettuare un approssimativamente 1 cm incisione mediana sotto il collo del mouse con un bisturi. Nel lato sinistro del taglio creare uno spazio sottocutaneo separando accuratamente la pelle dal tessuto connettivo sottostante.
- Capovolgere il mouse, e utilizzare un bisturi per fare una incisione cutanea di circa 1,5 cm di lato dorsale sinistro dietro la scapola. Creare una tasca sottocutanea lungo il fianco dell'animale sufficientemente grande per il dispositivo. Inserire il trasmettitore nella tasca.
- Inserire un piccolo pinza emostatica nell'incisione posteriore e manovrarlo sottocutanea verso la parte anterioreapertura del collo. Utilizzando la fascetta inserita-emostatico, prenda delicatamente un tubo in polietilene atossico (4 cm Lunghezza x 1 mm ID).
- Tirare il hemostat indietro attraverso il tunnel l'incisione laterale nella parte posteriore finché il tubo sporge da entrambi addominale e dorsale incisione, rilasciare il tubo dal emostatico. Dalla parte posteriore, inserire il sensore catetere nel tubo per tunnel la punta del catetere di rilevamento della pressione attraverso il collo. Dalla anteriore del collo, tirare e rimuovere il tubo in polietilene e chiudere l'incisione dorsale mediante clip metalliche.
- separare con cura le ghiandole mandibolari utilizzando applicatori di punta di cotone sterile e ritrarre la ghiandola mandibolare sinistra utilizzando un gancio elastico soggiorno. Utilizzando pinze curve punta fine, individuare la carotide lungo il lato sinistro della trachea. Mantenere il sito chirurgico sterile, mettendo e garantire un telino sterile.
- isolare con cura il recipiente dal tessuto circostante e delicatamente separare lanervo vago (colore biancastro) che si trova lungo l'arteria carotide lontano dalla arteria. Fare attenzione a non tagliare o danneggiare il nervo o l'arteria.
- Passare tre pezzi di non assorbibile 7-0 sutura sotto la sezione carotide isolato. Legare la sutura cranica per chiudere il flusso di sangue. Estrarre la sutura che è più vicino allo sterno per occludere temporaneamente il flusso di sangue dall'aorta.
- Fare un nodo sciolto utilizzando la sutura centrale. Questo verrà utilizzato per fissare il catetere nel vaso. Tagliare una piccola incisione nell'arteria tra il cranio e le suture sternale con micro-forbici.
- Afferra il catetere con una pinza speciale nave incannulamento, facendo attenzione a non comprimere il catetere per prevenire la perdita di gel dalla sonda. Delicatamente, afferrare l'arteria con una pinzetta punta fine curvo pinze, recuperare il catetere, e inserirla nel vaso attraverso la piccola incisione.
- Stringere il nodo di sutura intorno all'arteria centrale e far avanzare con delicatezza il gattoheter. rilasciare delicatamente la sutura che è prossimale allo sterno e continuare ad avanzare il catetere verso l'aorta trasversale.
- Osservare il contrassegno sul catetere che fornisce un indice approssimativa di quanto il catetere deve essere inserito. Una volta che il punto è raggiunto, delicatamente stringere sia inferiore e la sutura superiore intorno al catetere. Il catetere è fissato alla carotide dai nodi di sutura.
- Chiudere l'incisione cutanea con non assorbibile 5-0 di sutura. Una volta chiusa, sigillare l'incisione con tessuto adesivo.
4. chirurgico di recupero e BP Misure
- Monitorare animali da vicino per il ritorno di posture normali e comportamenti. Durante il periodo post-operatorio amministrare analgesia 24 ore come indicato da un veterinario del personale.
- Una volta che gli animali hanno recuperato (5 - 7 giorni dopo l'intervento), li alloggiare individualmente in una gabbia regolare del mouse posizionato sulla parte superiore della piastra ricevitore di telemetria.
- Ruotare il TR impiantatoansmitters "on" e "off" utilizzando un dispositivo magnetico posizionati brevemente vicino all'animale dall'esterno della gabbia.
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Representative Results
I dati possono essere acquisiti in remoto da un ricevitore; tracce vengono visualizzate su uno schermo di computer per il controllo di qualità (Figura 1a). Dettagli come ID animale, pressione diastolica e pressione arteriosa sistolica sono indicate anche (Figura 1b). Arteriosa BP può essere registrata in continuo (24/7), o per brevi intervalli programmati (ad esempio, 60 sec acquisizione ogni ora). I dati possono essere memorizzati automaticamente in un disco rigido per una successiva analisi. Mediati dati BP da una registrazione continua di 3 giorni sono mostrati (figura 2), è possibile apprezzare la variazione del ritmo circadiano tra il ciclo di luce e buio. Media della frequenza variazione di pressione e il cuore sono stati calcolati e rilevata in tempo.
Figura 1. Tracciati pressione sanguigna tipici di 4 topi diversi impiantati con telemetrica dispositivo. Tracciati (A) che mostrano in tempo reale i cambiamenti della pressione arteriosa (mmHg) nel corso di un intervallo di 5 min. I dati sono acquisiti contemporaneamente da quattro topi adulti 5 giorni dopo l'impianto. (B) Tracciare a più alta risoluzione temporale estratto da A, è possibile apprezzare diastolica pressione e valori sistolici, BP durata del ciclo, e la frequenza cardiaca. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Pressione Figura 2. A lungo termine arteriosa del sangue mostra ritmo circadiano Variation. Dati relativi alla pressione mediate che illustrano i valori di (A) pressione sistolica (SP), (B) pressione diastolica (DP), (C) della pressione arteriosa media (MAP), e (D) RA cuoreTE espresso in battiti / min. I dati sono stati estratti da registrazioni continue prese durante il giorno (ciclo luce, L) o di notte (buio ciclo, D). Registrazione iniziato 7 giorni dopo l'intervento chirurgico. Tutti i dati sono espressi come media ± SEM (n = 4 topi). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Impiantabile radio-telemetria è migliorata significativamente negli ultimi dieci anni; dimensioni più piccole della sonda rende l'impianto meno traumatica per l'animale, la durata della batteria prolungata aiuta a ridurre i costi, e le frequenze telemetro indipendenti eliminare le interferenze tra i ricevitori. Telemetria è considerato il metodo allo stato dell'arte per la raccolta di una vasta gamma di parametri fisiologici da animali liberi di muoversi senza artefatti dovuti all'uso di contenzione, interazione umana, o anestesia che sono richiesti da altre tecniche di 8,9.
Tuttavia, alcuni degli svantaggi della sua tecnica sono associati con costi iniziali di strumento e software. I trasmettitori sono fragili e suscettibili di danni, e la batteria non alla fine a corto di energia e devono essere sostituite. Anche se l'azienda offre per ristrutturare quelle sonde danneggiate ad un costo inferiore, il costo può essere ancora proibitivo per alcuni laboratori.Inoltre, questa procedura può essere tecnicamente impegnativo e la pratica è necessaria per ottenere una misura affidabile BP. Infine, vi è una certa postoperatorio mortalità associate, che nelle nostre mani è di circa 5%. Questo può aumentare notevolmente se un trattamento specifico deve essere testato o se una manipolazione genetica compromette la salute mouse.
I seguenti fattori critici sono essenziali per il buon esito della procedura: mantenere l'idratazione dei tessuti con soluzione salina sterile durante tutta la procedura. Maneggiare sempre il trasmettitore con grande cura; evitare tenendolo per il sensore di pressione in quanto ciò potrebbe causare il gel di fuoriuscire o danneggiare il trasmettitore. Quando si inserisce il catetere, legare la sutura centrale con un doppio nodo, come in caso contrario si comporterà il catetere esce dalla nave. La lunghezza del catetere richiesta che deve essere inserito nella carotide può variare a seconda del ceppo mouse e peso utilizzato in tale particostudio lar. Pertanto, si raccomanda vivamente di eseguire qualche esperimento preliminare per determinare quanto in profondità il catetere deve essere inserita per evitare l'occlusione dell'aorta. Infine, monitorare l'animale quotidiana e assicurarsi che la pelle sopra il trasmettitore non è allungata o necrotico. Se si verifica necrosi estese o infezione, eutanasia gli animali in base alla politica istituzionale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
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