Introduction
실험 데이터의 재산은 심장 외막은 심장 개발에 중요한 단계에 영향을 미치는 것을 설명했다. 개발하는 동안, 격벽 transversum는 proepicardium 1-4라고도 중피 세포 덩어리를 일으킨다. proepicardium의 세포는 마이그레이션 및 심장 외막을 형성 심근 봉투. 이 후, 심 외막 세포의 일부는 이후 심근을 침범 심장 외막 유래 세포 (EPDCs)의 철새 인구 EMT주는 상승을 받다. 실험 추적 유전자뿐만 아니라 레트로 바이러스 계보 EPDCs가 평활근 세포, 섬유 아세포, 내피 세포 및 심근 (있는 경우)를 포함한 다양한 계통으로 분화 것을 증명했다. 따라서 EPDCs는 관상 동맥 혈관과 심근 아키텍처 1,2,4-9의 발전에 크게 기여하고 있습니다. 또한, 상기 외막은 심실 컴팩트 10-12 층의 개발이 필수적이다. 전자의 경우xample Gittenberger - 드 그루 등. proepicardium의 생장을 억제하는 등의 얇은 심근, 심장과 비정상적인 심실 중격 형성의 부족 루프로 그 결과, 배아 치사 (13) 결함의 배열에 이르게 것을 보여 주었다. 배아 심장 외막에서 분비 분비 인자는 심근 세포의 증식과 분화를 조절한다. 이과 일치, 같은 레티노 산 (RA), 섬유 아세포 성장 인자 (FGFs)과의 Wnt / β-catenin이 같은 신호 전달 경로의 심장 외막 특정 삭제에 결함이 심근 성장과 배아 치사 14-16의 결과.
심장 외막이 성인의 마음에 대기 것으로 생각되었지만, 최근의 연구는 발달 프로그램은 심장 부상 17, 18 다음 심장 외막에 활성화되는 것으로 나타났습니다. 활성화되면, 세포 EPDC 형성 될 급속한 증식과 EMT를 겪는다. 이러한 세포는 capacit 전시Y는 섬유 아세포 및 평활근 세포가 아니라 심근 세포 또는 혈관 내피 세포 (18)로 분화한다. 또한 EPDCs는 손상된 영역의 혈관에서 지원하므로이 경색 크기를 감소시킴으로써 개선 된 심장 기능을 촉진한다는 proangiogenic 인자를 분비한다. 때문에 이러한 결과로, 심장 외막은 심장 혈관 개발, 질병 및 재생 연구에 대한 관심을 얻고있다.
형질 전환 기술은 21 세기 의학 연구에 혁명을했다. 형질 전환 기술의 도움으로 대사 및 pathophysiologically 인간 조건을 모방 질환 마우스 모델이 성공적으로 개발되었다. 그러나, 이러한 돌연변이 체의 심 외막 세포의 행동을 연구하는 것은 초기 배아 치사에 주로 도전하고있다. 심장 외막은 심장 개발 및 재생에서 활약하는 중요한 역할을 고려할 때, 우리는 마우스 epicardia에 대한 체외 배양 시스템을 확립리터 세포. 이 방법은 심 외막 세포의 장기 배양이 가능하고 외막의 두 가지 중요한 특성의 상세한 연구를 용이하게한다 : 이동 및 분화하는 능력. 마우스에서 적출 심실은 마이그레이션 분석을 수행하는 데 사용할 수있는 콜라겐 겔상에서 배양 될 수있다. 더 subepicardial 층의 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질을 복제하는 생체 세포 생리학을 되풀이되었습니다 차원 매트릭스에서 배양된다. 대안들은 다음 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 외막 단층을 설정하기 위해 챔버 슬라이드상에서 배양 될 수있다. 이 단분자막은 마이그레이션 중요 EMT를 받아야하는 심장 외막의 능력에 대한 통찰력을 제공한다 꽉 접합 단백질 염색하기 위해 사용될 수있다. 또한, 분화 실험은 이러한 세포상에서 수행 될 수있다. 또한, 유전자 발현 프로파일을 세포로부터 RNA를 추출하여 분석 할 수 있고,정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)을 수행. 마지막으로, 단일 층은 잠재적 인 치료제를 테스트하는 분자 분석 하였다 제로 처리 될 수있다. 함께 넣어,이 심 외막 문화 시스템은 시각화 및 심 외막 개발에 대한 우리의 이해를 발전한다 분자 데이터를 수집 할 수있는 기회를 우리에게 제공한다.
이 방법의 또 다른 바람직한 특징은 간단하고 더 복잡한 설정이 필요하지 않다는 것이다. 간단히, 배아는 심장이 절제되어 E11.5 또는 E12.5 다음에 수확된다. 심실은 콜라겐 젤 또는 챔버 슬라이드 중 하나에 배양. 이어서, 이들 세포는 하류 실험을 수행 할 수있다.
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Protocol
모든 실험은 듀크 - NUS 대학원 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 배아 심실 가져
- 탄산 가스 공급 장치 또는 다른 승인 안락사 법으로 안락사 챔버를 사용하여 원하는 배아 단계 (E11.5 또는 E12.5)에서 타이밍 임신 마우스를 희생한다.
- 해부 테이블에 그 뒷면에 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올로 여성의 복부를 소독. 배꼽을 통해 피부를 들어 올려 블레이드와 작은 절개 (1-2cm)를 확인 후, 두 손으로 피부를 유지하고 복부 벽을 노출 멀리 당기십시오.
- 이제 자궁 경적을 노출하는 복벽을 잘라. 자궁 뿔을 들어 올려 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 자궁에 부착 된 지방 조직과 혈관을 절단. 자궁 경부에서 절단하여 자궁을 검색 할 수 있습니다.
- 멸균 차가운 1X 인산 버프를 포함하는 배양 접시에 자궁 경적을 배치 겹으로 식염수 (PBS) 부드럽게 씻어. 얼음에 페트리 접시를 놓습니다.
- 난황 내부에 여전히 및 태반을 통해 자궁 벽에 부착 된 배아를 노출 (반대 태반이있는 사이트) 자궁 뿔의 중간 선을 잘라 가위를 사용합니다.
- 멸균 집게를 사용하여 배아를 무료로 배아 난황을 자르면.
- 멸균 차가운 1X PBS를 포함하는 새로운 배양 접시에서 배아를 놓습니다. 배아 목을 벨과 뒷면에 배치합니다. 심장을 노출 가슴 벽을 자르면.
- 마음을 들어 올려 가슴 벽에서 마음을 무료로 주변의 혈관을 절단하기 위해 멸균 집게를 사용합니다. 수술 도구를 사용하여 심장의 심장 외막이 손상되지 않도록 특별한주의를 기울이십시오.
- 유출 관 모두 심방을 낸다. 차가운 1X PBS와 다른 요리에 심실을 전송합니다. 얼음 접시를 놓습니다.
- 반복 모든 심실이 검색됩니다 때까지 1.6-1.9 단계를 반복합니다.
참고 : 문화 유리 챔버 슬라이드 또는 다운 스트림 애플리케이션을위한 콜라겐 겔에 하나이 심 외막 외식.
- 유리 챔버 슬라이드
- 상기 배양 배지를 준비하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 NG / ml의 재조합 섬유 아세포 성장 인자 2 (FGF2)를 추가한다. 층류 후드의 모든 단계를 수행한다.
- 8 잘 챔버의 각 웰에 500 ㎕의 배양 배지를 추가합니다.
- 잘의 중심에 각 절제 심실를 놓습니다. 웰의 바닥면 아래로 절개면을 유지하는 심실의 방향.
- 조심스럽게 37 ° C, 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣어.
- 외식을 준수 할 수 있도록 최소한의 방해와 문화를 유지한다. 심 외막 단분자막의 형성은 48 ~ 72 시간 후에 관찰 할 수있다.
- epicard의 차별화평활근 세포 배양을위한 다른 6일 분화 배지에서 단층 세포 외막에 IAL 세포. 상기 분화 배지 DMEM을 준비하고, 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 50 ng의 / ml의 재조합 변형 성장 인자 베타 1 (TGF-β1)를 추가한다.
- 다른 일에 배양 배지를 변경합니다.
- 콜라겐 젤
- 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 3D 콜라겐 배양 키트를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 콜라겐 겔을 준비한다.
- 콜라겐 겔의 원하는 부피를 제조 DMEM의 5 배와 피펫 상하로 콜라겐 용액의 적당량을 혼합한다. 이 솔루션은 노란색 설정해야합니다.
- 중화 액의 대응 볼륨을 추가로 pipetting 아래로 잘 즉시 섞는다. 이 솔루션은 분홍색으로 바뀝니다.
- 피펫 96- 웰 플레이트의 각 웰에이 혼합물을 100 ㎕. 알을 30-60 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 플레이트를 놓고낮은 겔 중합합니다.
- 각 웰에 전술 배양 배지 200 μl를 추가합니다.
- 잘의 중심에 각 절제 심실를 놓습니다. 동양은 심실은 (실험자에 직면해야 심실의 정점) 콜라겐 젤의 절개면을 아래로 유지합니다. 조심스럽게 다시 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣어.
- 삼일 후, 심실를 제거합니다. 또 다른 2 일간 세포 배양 인큐베이터에 다시 접시를 넣어.
- 다른 일에 배양 배지를 변경합니다.
3. 고정 및 시각화
주 : 외막 세포를 유리 슬라이드 챔버 또는 콜라겐 겔 하나에 가시화 될 수있다.
- 문화 미디어 대기음하고 세포를 씻어 살균 1X PBS의 동일한 볼륨을 추가합니다.
- 세포를 충당하기 위해 충분한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 세포를 고정합니다.
- PFA를 제거하고 1X PBST (와 1X PBS와 함께 외식을 씻어0.1 % 트리톤 X-100) 세포 Permeabilize 하시려면한다.
- 원하는 항체 (예를 들어, 알렉사 플 루어 488 - 팔로이 딘, ZO-1, α-튜 불린과 α - 평활근 액틴)를 발현 사이 7.
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Representative Results
이 배양 프로토콜을 사용하여, 주 외막 세포 하류 애플리케이션 고순도로 분리 할 수있다. 배양 된 세포는 EMT를 받아야 마이그레이션 및 심 외막 세포가 생체 내에서와 마찬가지로 구별 할 수 있습니다.
우리의 기본 심 외막 세포 배양의 순도를 결정하기 위해, 우리는 Sema3d GFPCre / +에서 발생하는 심 외막 외식을 분석, R26 톰 / + 배아. Sema3d 따라서, 조기 심장 개발하는 동안 심 외막 세포에 RFP 표시됩니다 이러한 배아에서 파생 된 심 외막 세포를 표현한다. 심 외막 외식에 대한 R26 톰 / + 배아, 우리는 Sema3d GFPCre / +에서 심실입니다. 48-72 시간 후에는 외막 세포 단층을 볼 수 있었다. RFP에의 면역 및 시야 이미지를 중첩하는 것은 대부분의 것을 보여 주었다심실에서 마이그레이션 세포의 심 외막 원점 (- C 그림 1A)의이다. 우리는 더 차 심 외막 세포에서 RNA를 분리하고 심근 마커 유전자 (Nkx2.5) (그림 1C)에 반대 심 외막 특정 유전자 (Tbx18 및 WT1)의 강한 표현을 보여 주었다 qPCR에를 수행하여 우리의 결과를 확인.
다음으로 외막 세포의 세포 극성 및 세포 - 세포 접촉을 분석하여 EMT를 받아야하는 세포의 능력을 조사 하였다. EMT는 상피 세포가 철새 중간 엽 세포로 변환하기 위해 그 세포 극성 및 세포 - 세포 접촉을 잃게 할 수있는 생물학적 과정이다. EMT의 첫 번째 단계는 세포 - 세포 접촉의 분리이다. 우리는 세포가 나타내는 원형질막에 ZO-1의 위치 파악을 보였다 (도 Tjp1라고도 밀착 연접 단백질 1) ZO-1 외막 세포를 면역 염색아직 EMT (그림 2A)를 받아야합니다. 다음에 우리는 심 외막 세포의 방향 이동을 용이하게하는 편광 정렬을 보여 주었다 심 외막 외식의 미세 소관의 조직을 관찰하기 위해 α-tubulin의 (그림 2B)에 대한 면역 염색을 수행. 또한, 외막 세포의 분화 잠재 성을 결정하기 위해, 우리는 재조합 TGF-β1을 함유하는 분화 배지 6 일간을 배양 하였다. SMA에 대한 면역 염색은 평활근 세포 (그림 2C)에 심 외막 세포의 성공적인 차별화를 보여 주었다.
마지막으로, 심장 외막 유래 세포 이동 및 심 외막 EMT를 분석하기 위해, 우리는 또한 콜라겐 겔 침윤 분석을 수행 하였다. 심장 외막 유래 세포를 면역 염색을 Phalloidin의 시각화 하였다. 심장 외막 유래 세포의 성공적인 마이그레이션은 이식편 (그림 3A) 주위를 볼 수 있습니다. 는 D를 확인하려면콜라겐 매트릭스에 세포 침투 epth는, 3 차원 재구성 공 초점 이미지에서 생성되었습니다. 심장 외막에서 유래 세포의 침투는 Z-스택 (도 3B)에서 볼 수있다.
. 그림 1 : 배아 마우스 마음에서 심 외막 세포의 차 문화 대표 브라이트 (A) 및 RFP 면역 (B) E12.5 Sema3d GFPCre / +에서 생성 된 기본 심 외막 세포의 이미지, R26 톰 / + 마음입니다. 합병 시야 및 면역 형광 이미지 (C). 심 외막 마커 (Tbx18 및 WT1) 및 주 외막 세포 (D)에서 심근 마커 (Nkx2.5)의 상대적인 mRNA 발현 수준. 결과는 GAPDH의 발현을 정규화하고 있었다 상대적 발현 수준이 Nkx2.5의 발현에 비해 배 차이로 주어진다 (N = 3). 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. 스케일 바 = 200 μm의. * P <0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 기본 심 외막 세포 (녹색, B) ZO-1 (A, 녹색) 또는 α-tubulin에 대한 심 외막 외식에 EMT와 차별화 면역 염색을받을 수있는 능력을 유지. DAPI는 핵 (파란색)를 시각화하는 데 사용되었다. 심 외막 세포를 6 일 동안 평활근 세포로 분화 및 α-평활근 액틴 (SMA) (적색 C)으로 염색 하였다. 스케일 바 = 100 μm의.3993fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 콜라겐 젤 표면에 심 외막 세포 마이그레이션 E12.5 배아에서 심실는 세 차원 콜라겐 겔 매트릭스에 배양 및 심장 외막 유래 세포의 이동과 침투 (A)를 시각화하는 알렉사 플 루어 488 - 팔로이 딘 염색. 공 촛점 이미지는 Z 축 (B)을 따라 세포 침투를 결정하는 입체 화상을 구성하는 데 사용 하였다. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
심장 개발과 재생의 심장 외막의 증가 중요성에 부응하기 위해 심장 외막의 연구를 촉진 기술을 개발하는 것이 중요한 것입니다. 심 외막 문화 시스템은 심 외막 연구에 상당한 이점을 포즈.
심 외막 세포를 분리하는 다른 방법은 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하는 것이다. 이 방법은, 다른 계통에서 외막 세포를 분리하는 외막 마커 (또는 형광 단백질의 심장 외막 세포 특이 적 유전자 발현)의 사용에 의존한다. 그러나, 증거의 증가 금액은 심 외막 마커가 독점적으로 심장 외막에 표시되지 않는 것으로 나타났습니다. WT1은 내피 19-21로 표시되어 예를 들어, Tbx18가 심실 중격 (IVS)의 심근 표현된다. 따라서, 절연 심 외막 세포 집단의 순도는 의문이다. 대조적으로, 본원에 기술 된 배양 방법을 취하는심 외막 세포의 철새 자연의 dvantage. 우리 유전자 표지 실험으로 나타낸 바와 같이이 외막 세포 고순도 인구의 분리를 가능하게한다. 심 외막 세포를 수득하는 또 다른 방법은 주로 BMP, WNT 레티노 산 및 신호 전달 경로를 조절함으로써 심 외막 세포로 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 분화 될 것이다. 이 분화 된 세포는 밀접 배아 심 외막 세포의 물리적 및 분자 특성을 닮은. 이들은 단지 EMT를 겪을 수뿐만 아니라 섬유 아세포 및 평활근 세포 (22, 23)로 분화 할 수있다. 이 방법은 매우 유망한이지만, 그것은 훨씬 더 복잡하고 시간이 논문에 기술 된 심 외막 문화보다 소요됩니다.
또한,이 배양 기술은 추가적인 특수 장비를 필요로하지 않고 기존의 조직 배양 설치 충분하다. 이 프로토콜에 따라 반면, (S)를 지불 할 중요마음을 검색 할 때 pecial 관심 수술 도구를 사용하여 심장 외막에 손상을주지합니다. 또한, 해부 측 외막 세포 이동을 용이하게하기 위하여 콜라겐 겔 또는 챔버 슬라이드의 표면 중 하나를 향하도록 절제 심실 배향하는 것이 중요하다. 이식편은 배양 접시에 부착 할 수 있도록하기 위해 마지막으로, 문화는 최소한의 방해로 유지되어야한다.
얻어진 세포 집단은 심 외막 세포 생물학의 이해를 촉진한다 하류 다양한 실험을 수행 할 수있다. 챔버 슬라이드에 외식을 배양하는 것은 심장 계통에 심 외막 세포 증식, 생존, 마이그레이션, EMT 및 차별화 등 다양한 실험 심 외막 단일 층을 제공합니다. 또한, 약물 치료와 연관된 심장 외막 세포의 특성에 대한 약물의 효과를 시험하는 기회뿐만 아니라, 유전자 발현의 변화를 제공한다. 또한, CU콜라겐 겔에서 외막을 lturing 것은 3D 행렬 대신 생체 내 생리에 대한보다 정확한 그림을 제공하는 기존의 2 차원 매트릭스에서 세포의 분석을 가능하게한다.
그러나,이 기술의 단점은,이 방법은 E11.5-E12.5 사이 배아 마음에서 배양 세포 외막에 사용될 수 있다는 것이다. 나중에 임신 중 또는 신생아 기간에 심장 외막은 증식 및 마이그레이션 할 수있는 기능을 잃는다. 따라서, 이후 단계 배아 또는 성체 생쥐에서 심 외막 세포를 분리하기 위해 배양 방법을 사용하는 것이 곤란하다.
이러한 제한에도 불구하고,이 기술은 심장 외막과 심장 개발 및 재생에서의 역할에 대한 연구에 매우 도움이 될 것입니다 심 외막 세포 생체의 성장을 촉진하기 위해 기본 배양 기술 및 설정을 사용합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 DUKE-NUS 대학원 의과 대학 싱가포르, Manvendra K. 싱에 총리 재단, 싱가포르 NRF의 교제 (NRF-NRFF2016-01)에서 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life tech invitrogen | 11995065 | |
| Penicillin/streptomycin solution | Life tech invitrogen | 15140122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life tech invitrogen | 10500064 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-5KG | |
| Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 450-33 | |
| Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) | PeproTech | 100-21 | |
| ZO-1 antibody | Life tech invitrogen | 40-2200 | |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T 6074 | |
| α-smooth muscle actin (SMA) antibody | Sigma | A 2547 | |
| Phalloidin antibody | Life tech invitrogen | A12379 | |
| 3D Collagen Culture kit | Millipore | ECM 675 | |
| 8-well chamber slide | Fisher Scientific | NNU 154534-PK | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596-018 | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Life Technologies | 4453536 | |
| Superscript First Strand Synthesis kit | Life Technologies | 11904-018 |
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