Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

Published: May 13, 2016 doi: 10.3791/54002
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

Introduction

وعلى الرغم من قدرة تجديد رائعة من خلايا الكبد 1، والتي هي كبرى نوع من الخلايا متني من الكبد، فشل الكبد المزمن يضعف هذه القدرة، مما يؤدي إلى خلية سلفية الكبدية (HPC) تجديد معتمد على 2.

ويستمد تلف الكبد المزمن بشكل رئيسي من تعاطي الكحول، التهاب الكبد الوبائي المزمن فيروس (HCV) إصابة 3 و غير الكحولية مرض الكبد الدهني (NAFLD) 4. أنه يؤدي إلى تليف الكبد المستمر، الذي يرتبط مع تراكم البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM). استمرار تراكم ECM يشوه بنية الكبد سليمة من خلال تشكيل ندبة الأنسجة الليفية 5، مما أدى لاحقا في تليف الكبد مع معدلات الاعتلال والوفيات مرتفعة. وقد بذلت محاولات كثيرة لتخفيف استجابة التليف أساسا من خلال التركيز على تثبيط السيتوكينات profibrogenic وmyofibroblasts تنشيط 6. ويستمد هذا الأخير في المقام الأول من خلايا النجمية الكبدية (Hالمنبوذة)، وخلايا الكبد حيث المبدأ غير متني المسؤولة عن تشكيل ندبة الكبد 4. ومع ذلك، علاجات التجدد التي تحفز مصادر الخلوية الذاتية بما في ذلك HPCS على تجديد خلايا الكبد في وجود الشتائم التليف متواصلة في انتظار مزيد من التحقيقات.

وقد وصفت العديد من النماذج التجريبية من التليف الكبدي في الثدييات. وقد استخدم على نطاق واسع حقن المتكرر من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4) للحث على التليف في الكبد في الفئران والجرذان نماذج 7. عندما جنبا إلى جنب مع اتباع نظام غذائي عالي الدهون (HF)، قاد الكحول إلى upregulation كبير في التعبير الجيني profibrogenic والتليف الكبدي 8. في حين تنكس دهني (تراكم الدهون) ناتج عن التعرض الكحول الحاد، فهو يجعل الكبد عرضة للإصابة الكبد أشد 9.

الزرد، دانيو rerio، ظهرت كنظام نموذج الفقاريات لا تقدر بثمن لدراسة تجديد. رغم أنالفقاريات الأخرى أقل مثل سمندل الماء وقنافذ البحر لديها قدرة فائقة على التجدد، والزرد ومزايا أكثر من النظم نموذج الأخرى في ما يخص استراتيجيات التلاعب الجيني والتصور اللازم لمعالجة التجدد المحتمل عوامل 10. يمثل الزرد أيضا نموذجا الفقاريات جذابة لدراسة أمراض الكبد الكحولية (محددة المدة) ببساطة عن طريق إضافة الإيثانول (ETOH) إلى المياه. الحادة ETOH التعرض لالزرد اليرقات والكبار تسبب تشحم الكبد 11-13. عندما تلقى الزرد الكبار التعرض ETOH موسعة، وقد لوحظ ترسب الكولاجين مع upregulation من الجينات ذات الصلة التليف 14. ومع ذلك، توجد حاجة لتطوير نماذج لدراسة تجديد الكبد ردا على ETOH كحافز التليف.

مؤخرا، قمنا بتطوير نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH في الزرد 15. نحن الجمع بين نظام الاجتثاث الوراثية-الكبدية محددة مع العلاج ETOH في اليرقات وأدولر الزرد. ولدت لنا اثنين من خطوط المعدلة وراثيا، تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1 وتيراغرام (fabp10a: mCherry-NTR) GT2، التي تنصهر القولونية nitroreductase (NTR) إلى السماوي وmCherry بروتين فلوري، على التوالي، تحت سيطرة من الأحماض الدهنية الكبدية محددة ملزمة 10A البروتين، والكبد الأساسي (fabp10a) المروج. في هذا النظام، NTR يحول ميترونيدازول دواء مساعد غير سام (MTZ) في الحمض النووي بين حبلا ربط عبر وكيل 16، استحثاث موت صريح من خلايا الكبد. استخدام هذا النموذج، أثبتنا أن مجموعة من الخلايا الكبدية، والتي تستجيب لإشارات الشق، وتحويلها إلى خلايا الكبد في غياب القريب من خلايا الكبد وفي الزيادة من ECM. بعثنا هذه الخلايا كما HPCS. وعلاوة على ذلك، من خلال شاشات الكيميائية، حددنا تفعيل جزيء صغير من إشارات Wnt ومثبطات يشير الشق أن زيادة تجديد خلايا الكبد في الكبد متليفة. Therefoإعادة، لدينا نموذج الكبد متليفة في الزرد يمثل نظام الفحص الكيميائي رائع بالمقارنة مع اختلاف الثقافات الخلية أو نظام الفرز على أساس الثدييات. وهو في الجسم الحي مع نظام من حيث التكلفة كبيرة وفوائد لتوفير الوقت. نحن هنا وصف الإجراءات التفصيلية لإنشاء نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH ولأداء شاشات الكيميائية باستخدام هذا النموذج في الزرد. وعلاوة على ذلك، تم إجراء التحليلات الوقت طبعا للتحقيق في كيفية تجديد خلايا الكبد ويحدث في الكبد متليفة. وهذا البروتوكول توفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة آليات واستراتيجيات لتعزيز تجديد خلايا الكبد في الكبد متليفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأثيرت الزرد ولدت باستخدام بروتوكول قياسي يحقق المعايير من المعاهد الوطنية للصحة والتي وافق عليها معهد جورجيا للتكنولوجيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. إعداد حلول

  1. إعداد 20 لتر ماء بيضة (تستخدم بالتبادل مع "المتوسطة الجنين ') للحفاظ على الجنين الزرد / اليرقات. حل 1.5 غرام كبريتات 4 و 6 ز المحيط حظة ملح البحر في 250 مل من الماء المقطر. تصب في الدامجانة زجاجة مليئة 20 L الماء المقطر وتستنهض الهمم.
  2. إعداد 1 L (PTU) محلول المخزون-2-ثيوريا 1-فينيل (20x و). حل 0.6 غرام من مسحوق PTU في 1 لتر من الماء المقطر. إضافة 1 مل من المحلول لكل 20 مل الجنين المتوسطة إلى تركيز النهائي من 0.003٪ كحل العمل.
    تنبيه: PTU قد يسبب سمية جهازية بعد الاستنشاق أو التعرض عن طريق الجلد. إعداد واستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية معالجة مناسبة.
  3. إعداد 1 لتر إيثيل 3-aminobenzoate حل الأسهم methanesulfonate (تريكين) (20x و). حل 4 غرام من مسحوق تريكين في الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 7 بإضافة 1 M تريس العازلة (الرقم الهيدروجيني 9)، وجلب الحجم النهائي إلى 1 L مع الماء المقطر. قسامة إلى 50 مل ومخزن في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد قبل الاستخدام.
    تنبيه: تريكين يمكن أن تحفز على فقدان الإحساس. إعداد واستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية معالجة مناسبة.
  4. إعداد 100 مل ميترونيدازول اليرقات (MTZ) حل العاملة. جعل الطازجة 15 ملي MTZ حل عن طريق إذابة 0.25 غرام من مسحوق MTZ في 0.1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في 100 مل المتوسطة الجنين. حل مسحوق MTZ تماما من اهتزاز قوي. جعل حل MTZ الطازجة واستخدام رقائق الألومنيوم لمنع تدهور بهوتوكاتاليتيك من MTZ.
    تنبيه: MTZ قد يسبب تهيج. إعداد واستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية معالجة مناسبة.
  5. إعداد 100 مل من محلول العمل اليرقات الإيثانول / ميترونيدازول (ETOH / MTZ). جعل حل MTZ الطازجة واستخدام رقائق الألومنيوم لمنع دي ضوئيتدرج من MTZ. إضافة 1.5 مل الإيثانول بنسبة 100٪ إلى 100 مل من محلول MTZ إلى تركيز النهائي من 1.5٪ فقط قبل الاستخدام.
  6. إعداد 500 مل الكبار MTZ حل العاملة. جعل الطازجة 10 ملي حل MTZ بحل 0.83 غرام من مسحوق MTZ في 0.1٪ DMSO في 500 مل من الماء النظام. حل مسحوق MTZ تماما من اهتزاز قوي. جعل حل MTZ الطازجة واستخدام رقائق الألومنيوم لمنع تدهور بهوتوكاتاليتيك من MTZ.
  7. إعداد 1 عازلة L بيم. حل 30.2 أنابيب ز، ز 0.74 EGTA، و 0.12 غرام MgSO 4 في الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 7 مع هيدروكسيد الصوديوم. جلب الحجم النهائي إلى 1 L مع الماء المقطر.

2. إعداد يرقات اسماك الزرد

  1. إعداد التزاوج من [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] 15،17 الكبار الزرد مع TG (hand2: EGFP) PD24 13 الزرد الكبار في خزانات التزاوج. استخدام فواصل لإجراء التزاوج في الوقت المناسب.
  2. إزالة دivider في صباح اليوم التالي والسماح الأسماك للتزاوج دون انقطاع. الأجنة الحصاد في وقت لاحق 2 ساعة عبر توتير المياه النظام ونقل الأجنة إلى 100 ملم أطباق بتري مع المتوسط ​​الجنين.
  3. لا تحتفظ بأكثر من 100 الأجنة في طبق بيتري. تحت مجهر تشريحي، وإزالة بويضة غير مخصبة باستخدام ماصة الزجاج. تنمو الأجنة عند 28 درجة مئوية وإضافة الفنيل (PTU) إلى تركيز النهائي من 0.003٪ بعد 10 ساعة بعد الإخصاب (HPF) لمنع تطور الصباغ.

3. الإيثانول، ميترونيدازول العلاج والكبد التجديد في اليرقات الزرد

  1. يعد حل ETOH جديدة من خلال إضافة الإيثانول إلى المتوسطة الجنين إلى التركيز النهائي من 1.5٪. لا تقم بإضافة PTU.
  2. علاج الأجنة مع 20 مل من محلول الإيثانول في طبق بتري 56-80 HPF. تغطية أطباق بتري مع غلاف بلاستيكي لمنع الإيثانول التبخر.
  3. فرز [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11 سوب>. TG (hand2: EGFP) PD24] اليرقات مع حجم الكبد مماثل، على النحو الذي يحدده التعبير CFP، في 80 HPF. لا تستخدم تريكين عندما يكون الترتيب اليرقات المعالجة ETOH لأن هذا سوف يسبب ارتفاع معدل الوفيات مع العلاج ETOH / MTZ اللاحقة. حافظ على اليرقات التي تم فرزها في مناطق ذات كثافة من 30 الأجنة في طبق بيتري.
  4. إعداد الطازجة 15 ملي MTZ في المتوسط ​​الجنين في 0.1٪ DMSO. إضافة كمية مناسبة من ETOH إلى حل MTZ لجعل تركيز النهائي من 1.5٪. احتضان اليرقات في 20 مل من محلول ETOH / MTZ في طبق بتري لمدة 24 ساعة على 28 درجة مئوية. تغطية أطباق بتري مع الاغطية البلاستيكية للحفاظ على تركيز ETOH ومع رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء.
  5. في نهاية العلاج، وإزالة حل ETOH / MTZ عن طريق نقل اليرقات إلى أطباق بتري جديدة مع المتوسط ​​الجنين جديدة. غسل اليرقات 3 مرات مع المتوسط ​​الجنين والاحتفاظ بها في 20 مل الجنين المتوسطة دون PTU.
  6. لفرز اليرقات مع الاجتثاث شبه الكامل للخلايا الكبد، ومراقبة مضانتحت المجهر epifluorescence مع فلتر CFP في التكبير من 80X. النتائج الاجتثاث الناجحة في الحد الأدنى من مضان CFP في الكبد وانخفاض كبير في حجم الكبد.
  7. لتجنب موت اليرقات المعاملة MTZ-ETOH /، لا تستخدم تريكين للفرز. إصلاح اليرقات لالمناعية (راجع القسم 5) أو الاحتفاظ اليرقات التي تم فرزها في أطباق بتري عند 28 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.

4. شاشات الكيميائية في المعالجة MTZ-ETOH / يرقات اسماك الزرد

  1. تقديم لوحات 96-جيدا تحتوي على 10 ملي الأسهم الكيميائية في DMSO (يرجى الرجوع إلى قائمة المواد للحصول على تفاصيل بشأن المكتبات الكيميائية التجارية) من الفريزر -80 درجة مئوية. يغطى بورق الألمنيوم لمنع تدهور الضوئي للمواد الكيميائية. ذوبان الجليد الحلول الأسهم في RT مع هزاز لطيف.
  2. تحضير المحاليل الكيميائية عن طريق تمييع 10 الحلول الأسهم ملم مع المتوسط ​​الجنين إلى التركيز النهائي من 50 ميكرومتر (في 96 لوحات جيدة: الصورة الأوليةcreen. في 1.5 مل أنابيب: إعادة الاختبار). تم علاج اليرقات السيطرة مع تركيزات متساوية من DMSO في المتوسط ​​الجنين.
  3. نقل اليرقات مع الاجتثاث شبه الكامل الكبدية، التي كانت تعامل مع 1.5٪ ETOH / 15 ملي MTZ وفرزها كما سبق ذكره، إما 96-جيدا (الشاشة الأولي) أو 24-جيدا (إعادة الاختبار) لوحات المعبأة مسبقا مع المتوسط ​​الجنين في كثافة 5 يرقات لكل بئر. استخدام الآبار مكررة لكل مادة كيميائية.
  4. إزالة المتوسطة الجنين وإضافة أي 250 ميكرولتر (لوحات 96-جيدا) أو 500 ميكرولتر (24-جيدا لوحات) المحاليل الكيميائية إلى كل بئر. بطانات بورق الألمنيوم وعلاج اليرقات لمدة 50 ساعة على 28 درجة مئوية. تفقد اليرقات التي تمتص المواد الكيميائية يوميا وإزالة أي اليرقات الميتة من الآبار الفردية.
  5. في نهاية علاج الكيميائي، ومراقبة عدد و / أو شدة خلايا الكبد CFP، معربا تحت المجهر epifluorescence مع فلتر CFP في التكبير من 80X. صورة الحية تظهر يرقات تعزيز أو تقليلعدد د و / أو كثافة خلايا الكبد، معربا عن CFP مع كاميرا رقمية للسجلات.
  6. الحفاظ على اليرقات التي كتبها تثبيت الفورمالديهايد للتصوير مبائر كما هو موضح في المادة 5.
  7. لإعادة اختبار مستوى المواد الكيميائية التي تسهل تجديد خلايا الكبد في الشاشة الأولى، ودراسة فعاليتها في تركيزات أعلى وأدنى للعثور على تركيز معظم فعال مع الإجراءات الموضحة في 4،1-4،5 ( 'إعادة الاختبار).

5. يرقات اسماك الزرد التثبيت، المناعية، ومتحد البؤر التصوير

  1. تخدير اليرقات بإضافة تريكين إلى تركيز النهائي من 0.02٪. نقل 10-15 اليرقات إلى أنبوب 1.5 مل ويغسل مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من الطازجة 2٪ الفورمالديهايد في المخزن بيم لإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
    تنبيه: الفورمالديهايد يسبب تهيج وأنه من المعروف أن مادة مسرطنة الإنسان. التعامل في غطاء الدخان الكيميائية.
  2. تجاهل تحديد الحل بشكل صحيح ومن ثم واش 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في RT. اليرقات الثابتة يمكن أن تظل في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى عدة أيام. الانتقال إلى الخطوة التالية يعطي على الفور النتائج المناعية أفضل.
  3. إزالة بعناية صفار البيض والجلد الذي يغطي منطقة الكبد باستخدام رقم 55 ملقط تحت مجهر تشريحي.
  4. Permeabilize وكتلة اليرقات في المخزن بلوك (4٪ زلال المصل البقري و 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) O / N عند 4 درجات مئوية.
  5. احتضان مع أرنب المضادة للالكولاجين أنا الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 100 في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 5 مرات لمدة 15 دقيقة مع كل غسل عازلة (0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني).
  6. احتضان مع AlexaFluor 647 حمار مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 200 في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 5 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع العازلة غسل. ثم يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  7. نقل بلطف اليرقات على الشرائح الزجاجية باستخدام ماصة الزجاج، واليرقات ثابت توجيه مع الجانب الجانبي الأيسر مواجها لها. إزالة الزائد PBS باستخدام Kimwipes. إضافة قطرة من وسائل الاعلام المتزايدةوختم غطاء زجاجي مع طلاء الأظافر. إجراء التصوير متحد البؤر فورا ينصح إلى حد كبير.
  8. استخدام نظام متحد البؤر مجهزة عدسة 40X / 1.3 النفط لالتقاط الصور. استخدام قوة الليزر على 20-50٪. التقاط الصور كومة Z في 1 ميكرومتر فترات.

6. إعداد اسماك الزرد الكبار

  1. إعداد التزاوج من [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] 15،17 الزرد الكبار في خزانات التزاوج. حصاد الأجنة في صباح اليوم التالي عبر توتير المياه النظام ونقل الأجنة في أطباق بتري 100 ملم مع المتوسطة الجنين.
  2. لا تحتفظ بأكثر من 100 الأجنة في طبق بيتري. تحت مجهر تشريحي، وإزالة بويضة غير مخصبة باستخدام ماصة الزجاج. تنمو الأجنة عند 28 درجة مئوية وإضافة PTU إلى تركيز النهائي من 0.003٪ بعد 10 HPF لمنع تطور الصباغ.
  3. في 4 DPF، استخدم تريكين لتخدير اليرقات وفرز [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR)GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] اليرقات. تغسل تريكين عن طريق تغيير الجنين المتوسطة عدة مرات الطازجة. السماح اليرقات لاسترداد عند 28 درجة مئوية حتى تحقيق معدل ضربات القلب الطبيعي لل120-180 نبضة في الدقيقة 18.
  4. رفع اليرقات المفروزة إلى 6-12 شهرا على أساس الإجراء العادي 19.

7. الإيثانول، ميترونيدازول العلاج، والكبد التجديد في اسماك الزرد الكبار

  1. نقل 6-12 شهرا [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] الكبار الزرد إلى خزانات التزاوج باستخدام الشبكة. حفاظ على الأسماك في مناطق ذات كثافة لا تزيد عن 10 السمك في خزان.
  2. يعد حل ETOH جديدة عن طريق إضافة ETOH في المياه النظام إلى تركيز النهائي من 1٪. علاج الأسماك الكبار مع 500 مل حل ETOH في كل خزان والمحافظة عليها في 28 حاضنة درجة مئوية.
  3. الأسماك نقل الكبار إلى حل ETOH الطازجة يوميا، ونبذ ميت دعامة الأسماكerly باعتبارها واقية. علاج مستمر الحيوانات لمدة 72 ساعة قبل العلاج MTZ.
  4. إعداد الطازجة حل 10 ملم MTZ في الماء النظام في 0.1٪ DMSO. قبل تدفئة حل MTZ في 28 درجة مئوية الحاضنة. علاج السمك مع 500 مل حل MTZ في 1 لتر خزان معبر لمدة 8 ساعة على 28 درجة مئوية، وحماية من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
  5. مراقبة كل ساعة أثناء فترة العلاج وإزالة الأسماك النافقة على الفور. تجاهل الأسماك النافقة بشكل صحيح كما هو واقية. في نهاية العلاج MTZ، تغسل MTZ عن طريق نقل الحيوانات إلى نظام المياه العذبة مرتين.
  6. سماح للحيوانات لاستعادة والحفاظ عليها في حاضنة عند 28 درجة مئوية. تغذية ونقل الأسماك إلى المياه منظومة جديدة يوميا حتى نقطة زمنية للتحاليل.

8. اسماك الزرد الكبار الكبد التثبيت، المناعية، ومتحد البؤر التصوير

  1. تخدير الأسماك البالغة مع 0.02٪ تريكين والموت ببطء في الماء المثلج لمدة 15 دقيقة. بات الجافة السمك على منشفة ورقية ووضعه على حصيرة تشريح.
  2. كشف أجهزة الجهاز الهضمي عن طريق إزالة الجلد والعضلات كما سبق وصفها 20. استخدام المقص لقطع الجلد والعضلات الكامنة على طول البطن من الزعنفة الشرجية على الغطاء الخيشومي، ثم الخلف على طول الجانب من الأسماك إلى الزعنفة الشرجية.
  3. وضع الأسماك في أنبوب مخروطي 15 مل ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 4 مل من الطازجة 2٪ الفورمالديهايد في المخزن بيم لإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية.
  4. تجاهل تحديد الحل بشكل صحيح، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني في RT. عينات الثابتة يمكن أن تظل في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أيام. الانتقال إلى الخطوة التالية يعطي على الفور النتائج المناعية أفضل.
  5. تشريح الأمعاء كله مع الكبد من تجويف جسم السمكة عن طريق قطع المريء. تضمين أجهزة الجهاز الهضمي مع 4٪ المنخفضة للذوبان الاغاروز في قالب باجتزاء.
  6. استخدام vibratome لقطع العينات في المقاطع العرضية في 50 ميكرومتر فترات في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني، بدءا من نهاية الأمامي. نقل ثانيةستعقد لوحة 6 جيدا مع برنامج تلفزيوني باستخدام فرشاة الطلاء # 1.
  7. Permeabilize وأقسام كتلة في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية.
  8. احتضان مع أرنب المضادة للالكولاجين أنا الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 100 في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 5 مرات، كل مع العازلة غسل لمدة 15 دقيقة.
  9. احتضان مع AlexaFluor 647 حمار مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة في التخفيف من 1: 200 في كتلة عازلة O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 5 مرات، 15 دقيقة لكل منهما مع العازلة غسل ومرة ​​واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  10. نقل بلطف أقسام على الشرائح الزجاجية باستخدام فرشاة الطلاء # 1. إزالة الزائد PBS باستخدام Kimwipes، إضافة قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة، وغطاء ختم الزجاج بطلاء الأظافر. إجراء التصوير متحد البؤر فورا واقترح للغاية.
  11. استخدام نظام متحد البؤر مجهزة عدسة 40X / 1.3 النفط لالتقاط الصور. استخدام قوة الليزر على 20-50٪. التقاط الصور كومة Z في 1 ميكرومتر فترات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل (1) وتطوير نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH في الزرد اليرقات. لتحسين بروتوكول لتعريض اليرقات الزرد إلى ETOH، علينا أولا تقييم ETOH سمية. في مرحلة ما بعد الإخصاب أيام تعرضت 2.5 (DPF) يرقات إلى تركيز ETOH 1٪، 1.5٪، أو 2٪ لمدة 24 ساعة تليها 24 ساعة ETOH العلاج / MTZ المتزامنة. التعرض إلى 2٪ ETOH نفوق عالية، في حين أن كل ما يقرب من اليرقات يتعرض إلى 1٪ أو أقل ETOH أظهر التغييرات التليف الحد الأدنى مع ترسب نادر من البروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين. وبناء على هذه النتائج، وسابقة التجهيز اليرقات مع 1.5٪ ETOH لمدة 24 ساعة (2.5-3.5 DPF) وبعد ذلك تعامل في وقت واحد مع MTZ لمدة 24 ساعة (3.5-4.5 DPF) (الشكل 1A). أظهرت يرقات ETOH / MTZ المعاملة تشوهات شكلية بما في ذلك انحناء التصاعدي من الجذع والذيل، وذمة التامور، وعدم تضخيم المثانة السباحة. (الشكل 1B). نحنيستخدم ثلاثة خطوط المعدلة وراثيا لتحليل التغيرات التليف في الكبد معاملة اليرقات MTZ-ETOH /: 1) تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) خط GT1 يعبر عن الجين NTR تنصهر مع بروتين سماوي مضان تحت لواء الكبدية محددة fabp10a المروج 15؛ 2) تيراغرام (TP1: mCherry) خط jh11 يصادف الخلايا مع إشارات نشطة الشق (الخلايا الشق تستجيب، إن آر سي إس) أو الخلايا الظهارية الصفراوية (BECS) مع mCherry النووي 17، التي التعبير هو تحت سيطرة وحدة TP1 تحتوي على RBP- متعددة مواقع كيه ملزم. و3) تيراغرام (hand2: EGFP) خط PD24، التي تصف الخلايا النجمية الكبدية (HSCs) 13. مراقبة المعالجة DMSO [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11، TG (hand2: EGFP) PD24] كبد لم تظهر أي نوع ييفي أنا الكولاجين ترسب 4،6،9 (الشكل 1C، C)، في حين ETOH / طن متريكبد المعالجة Z عرض نوع مرتفع أنا الكولاجين تراكم في 25 و 50 ساعة بعد انتهاء الاجتثاث (HPA) (الشكل 1D، D، E، E '). بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع كبد مراقبة المعالجة DMSO (الشكل 1C '')، وزيادة HSCs في عدد مع التشكل تغير من تكوين النجوم مثل لشكل يشبه الأرومة الليفية العضلية مع عمليات حشوية خسر في كبد ETOH / MTZ معاملة تجديد ( 1D الشكل ''، ه ''). لاحظنا اثنين من السكان منفصلة من آر سي إس mCherry، معربا في 25 HPA في كبد ETOH / MTZ معاملة تجديد: قاتمة آر سي إس الحمراء (1D الشكل '' '، أقحم، السهام البيضاء) وآر سي إس الحمراء الزاهية (1D الشكل' ''، أقحم ، النصال الصفراء). في 50 HPA، بدأت CFP الكبدية محددة للمشاركة صريحة في إن آر سي إس مع التعبير mCherry قاتمة في جميع أنحاء كبد تجديد (الشكل 1E '' '، أقحم، السهام البيضاء). هذه CFP وقاتمة mCherry-coexpreإن آر سي إس ssing يمكن تمييزها بوضوح من آر سي إس الحمراء الزاهية التي هي سلبية للCFP (الشكل 1E '' '، أقحم، النصال الصفراء). وأظهرت دراسات سابقة أنه عندما قمعت انتشار خلايا الكبد بعد استئصال الكبد الجزئي (PHX)، وسعت HPCS مع انتشار ما يصاحب ذلك من HSCs 21. بالإضافة إلى ذلك، HPCS وBECS تقاسم علامات النسيجية 22. وبالتالي، نتائجنا تشير إلى أن CFP وخافت mCherry، معربا شارك آر سي إس تصور الزرد-نظيره من HPCS أن تفرق في خلايا الكبد التي تواجه الشق downregulation. قد تبقى آر سي إس الحفاظ على مستويات أعلى من إشارات الشق كما cholangiocytes، والتي هي متباينة BECS 23.

ويبين الشكل 2 تطوير نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH في الزرد الكبار. أولا، نحن يتعرض الزرد الكبار إلى 1٪، 1.5٪، أو 2٪ ETOH لتقييم جدوى. لم معظم الزرد الكبار نبعد التمديد البقاء على قيد الحياة أكثر من 72 ساعة من التعرض لتركيزات ETOH أكبر من 1٪ (بيانات غير منشورة). لذلك، لالزرد الكبار، ونحن سابقة التجهيز السمك مع 1٪ ETOH لمدة 72 ساعة ويليه العلاج MTZ (الشكل 2A). عن طريق إجراء تحاليل الوقت طبعا، أظهرنا نوع مرتفعة بشكل كبير وأنا الكولاجين ترسب في كبد تجديد تعامل MTZ-ETOH / في 2 و 3 و 4 أيام بعد انتهاء الاجتثاث (د ب أ) (الشكل 2C، D، E ') مقارنة كبد المعالجة DMSO (الشكل 2B). مماثلة لتلك التي لوحظت في اليرقات، تم الكشف عن الخلايا، معربا عن التعاون CFP وmCherry قاتمة في كبد تجديد تعامل MTZ-ETOH / القديمة لمدة 12 شهرا، [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] الأسماك البالغة في 3 و 4 (د.ب.أ) (الشكل 2D، E، إدراجات، السهام البيضاء). وتشير هذه البيانات إلى أن HPCS، استجابة إلى درجة والإشارات، والحفاظ على قدرتها على تجديد خلايا الكبد كما فيوجود إهانة التليف في الزرد الكبار.

ويبين الشكل 3 نتائج ممثل الفحص الكيميائي باستخدام لدينا نموذج الكبد متليفة الإيثانول الناجم في الزرد اليرقات. لتحديد المركبات النشطة بيولوجيا من شأنها تسريع تجديد خلايا الكبد في الكبد متليفة، أجرينا شاشات الوراثية الكيميائية. نحن فحص مكتبة 75 جزيئات صغيرة مع الأنشطة البيولوجية والدوائية تتميز جيدا (الخلايا الجذعية اشارة مكتبة مجمع، Selleckchem) ومكتبة من 1000 جزيئات صغيرة تتميز أقل (مكتبة ActiProbe-1K، TimTec) باستخدام [تيراغرام (fabp10a: CFP -NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11] اليرقات. نحن ذاب الخلايا الكبدية في وجود 1.5٪ ETOH / 15 ملي MTZ ثم تتعرض اليرقات إلى 50 ميكرومتر من المركبات لمدة 50 ساعة (الشكل 3A). وهناك عدد من منبهات WNT مثل SB 415286 وCHIR-99021، مثبطات الجليكوجين سينسيز كيناز-3، روجت تجديد خلايا الكبد (الشكل 3C، D) مقارنة DMSO (الشكل 3B). وعلاوة على ذلك، [4- (1H-1،2،3،4-tetraazol-5-YL) -1،2،5-oxadiazole-3-ylamine]، كما يختصر HTOA، رواية WNT مسار المنشط، وتعزيز الكبدية تجديد في الكبد متليفة كما هو مبين من خلال زيادة الكبد مجدد (الشكل 3E). وتشير هذه البيانات إلى أن نموذجنا متليفة مستدام يوفر أداة لا تقدر بثمن لاكتشاف الجزيئات الصغيرة التي تعزز تجديد خلايا الكبد.

الشكل 1
الشكل 1. تطوير نموذج الكبد متليفة الإيثانول الناجم في الزرد اليرقات. (A) مخطط يوضح فترات العلاج ETOH وETOH / MTZ لإنشاء نموذج الكبد متليفة في اليرقات. (ب) في 50 ساعة بعد انتهاء الاجتثاث (HPA)، وتعامل MTZ-ETOH / لتروضعت الزرد arval تشوهات شكلية بما في ذلك انحناء التصاعدي من الجذع والذيل، وذمة التامور، وعدم تضخيم المثانة السباحة. (CC '' ') في كبد [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1. TG (TP1: mCherry) jh11، TG (hand2: EGFP) PD24] اليرقات تعامل مع DMSO، كان البروتين ECM الكولاجين 1A لا يمكن الكشف عنها تقريبا (C، C ') وأظهر HSCs هادئة تكوين النجوم مثل (C' ')، في حين إن آر سي إس موزعة بين خلايا الكبد (C، C '' '، أقحم). (DE '' ') في أكباد اليرقات المعاملة MTZ-ETOH /، لوحظ ارتفاع الكولاجين 1A ترسب (D، D، E، E'). زيادة HSCs في عدد وخسر عمليات حشوية المعقدة (D ''، ه ''). في 25 HPA، وتتكون آر سي إس mCherry معربا عن اثنين من السكان متميزة . وتشير النصال الصفراء آر سي إس الحمراء الزاهية (D '' '، أقحم)، في حين السهام البيضاء تشير إلى إن آر سي إس الحمراء الخافتة (D' ''، أقحم). في 50 HPA، تيراغرام بدأت خلايا، معربا عن التعاون الناشئة في جميع أنحاء كبد تجديد (E '' '، أقحم، السهام البيضاء)، في حين كانت آر سي إس حمراء ساطعة لا التعبير CFP (fabp10a: CFP-NTR) وتيراغرام (mCherry TP1) (E '' '، أقحم، النصال الصفراء). جميع الصور مبائر عبارة عن صور طائرة واحدة باستثناء ج ''، D ''، ه ''، وهي صور الإسقاط. أشرطة النطاق: B، 100 ميكرون، CE '' '، 20 ميكرون. ETOH، والإيثانول. MTZ، ميترونيدازول. HPA، ساعة بعد الاجتثاث. DPF، أيام بعد الإخصاب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

her.within الصفحات = "1"> الشكل 2
الشكل 2. تطوير نموذج الكبد متليفة الإيثانول الناجم في الزرد الكبار. (A) مخطط يوضح فترات العلاج ETOH وMTZ لإنشاء نموذج الكبد متليفة في الكبار. (BE ') تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR)، تيراغرام (TP1: mCherry)، والتعبير الكولاجين 1A في vibratome أقسام DMSO- (B و B') وETOH / MTZ المعالجة (CE ') الكبار كبد الزرد. (BB ') في ضوابط المعالجة DMSO، كان الكولاجين 1A لا يمكن الكشف عنها تقريبا (B') مع عدم وجود تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) وتيراغرام (TP1: mCherry) خلايا، معربا عن التعاون (B). (CE ') في كبد ETOH / MTZ معاملة تجديد، ورقي ترسب الكولاجين 1A بشكل ملحوظ في 2 و 3 و 4 (د.ب.أ) (C، D، E') معسكان تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) وتيراغرام (TP1: mCherry)، معربا عن تعاون الخلايا في 3 و 4 (د.ب.أ) (D، E، إدراجات، السهام البيضاء). كانت آر سي إس حمراء ساطعة لا التعبير CFP (D، E، إدراجات، النصال الصفراء). BE، مبائر صور طائرة واحدة. B '-E "، مبائر صور الإسقاط. شريط النطاق، 20 ميكرون. ETOH، والإيثانول. MTZ، ميترونيدازول. (د.ب.أ)، أيام ما بعد الاستئصال. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. ممثل النتائج الفحص الكيميائي باستخدام نموذج الكبد متليفة الإيثانول الناجم في الزرد اليرقات. (A) خطة للشاشة الكبدية تجديد في الكبد متليفة. (BE) المعروفة وWNT روايةتفعيل زيادة تجديد خلايا الكبد في الكبد متليفة. توقعات متحد البؤر كبد تعامل MTZ-ETOH / في [تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1، تيراغرام (TP1: mCherry) jh11] اليرقات التي كانت تدار مع DMSO (B)، SB415286 (C)، CHIR-99021 ( D)، أو رواية WNT المنشط [4- (1H-1،2،3،4-tetraazol-5-YL) -1،2،5-oxadiazole-3-ylamine] (مختصر النحو HTOA) (E). SB415286 وCHIR-99021 والجليكوجين سينسيز كيناز-3 مثبطات. جميع الصور هي صور متحد البؤر الإسقاط. شريط النطاق، 20 ميكرون. ETOH، والإيثانول. MTZ، ميترونيدازول. HPA، ساعة بعد الاجتثاث. DPF، أيام بعد الإخصاب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لاحظنا بوساطة HPC الكبدية تجديد في كبد ETOH / MTZ المعاملة يتعافى، مما يشير إلى أنه حتى في وجود كمية كبيرة من البروتينات ECM بما في ذلك نوع ييفي أنا الكولاجين، وHPCS تحتفظ كفاءتهم لتجديد خلايا الكبد كما. وقال إن MTZ فقط المعالجة لا تزيد ترسب البروتينات ECM بشكل ملحوظ، في حين أن ETOH الوحيدة المعالجة لم تتسبب في تنشيط HPC 15. من خلال الاستفادة من العلاج ETOH / MTZ جنبا إلى جنب، وكنا قادرين على تحقيق تجديد يحركها HPC في الكبد متليفة. كما القضاء شبه التام على خلايا الكبد يتسبب يحركها HPC الكبدية تجديد، فمن الأهمية بمكان لفرز اليرقات المعاملة MTZ استنادا إلى معايير غياب مضان الكبدية محددة وانخفاض كبير في حجم الكبد عن طريق آر سي إس متفاوت. في الأسماك، والأوعية الدموية للخياشيم والجلد على امتصاص الكحول 24، بحيث ليست هناك حاجة للسماح للحيوانات للشرب الإرضاع بحسب الرغبة أو تتطلب intragaضخ إضرب كما في نماذج الثدييات. نحن يضم EtOH- والأسماك البالغة تعامل MTZ اللاحقة في خزانات منفصلة دون تعميم الماء. فمن الضروري لنقل الأسماك إلى حل ETOH الطازجة يوميا والحفاظ على الغطاء عن لتقليل تبخر ETOH. على الرغم من 48-72 ساعة ETOH العلاج / MTZ تحرض بكفاءة ECM تخليق البروتين في بروتوكولات لدينا، وقد وضعت لا التليف المتقدمة ولا تليف الكبد في هذه الأسماك. لذلك، مزيج من MTZ مع التعرض لفترات طويلة من الإيثانول مثل 12 أسبوعا علاج 14، وتحديدا في الأسماك البالغة، وربما تتسبب في تلف الكبد أكثر شدة لمحاكاة واستجواب تجديد يحركها HPC في فشل الكبد المزمن بشكل صحيح.

يخدم الزرد كنموذج للحيوانات المتميز في الجسم الحي اختبار مركب نظرا لصغر حجمه، ذرية كبيرة، والشفافية، والنفاذية إلى جزيئات صغيرة 25. باستخدام نموذج الكبد متليفة في الزرد، حددنا عددا من المعروفين ورواية WNT تشغيل إشاراتvators ومثبطات الشق أن تسارع الكبدية تجديد 15. يتكون لدينا الحالي القائم على مضان بروتوكول الفحص الكيميائي لعدة خطوات عن القيام بها يدويا بما في ذلك إعداد المواد الكيميائية، ونقل تعامل ETOH /-ذاب الكبدية اليرقات إلى 24 لوحات جيدا، ومعالجة المواد الكيميائية، وتحليل آثار المواد الكيميائية على تجديد خلايا الكبد. ويعمل على وجه التحديد epifluorescence و / أو المجهر متحد البؤر لالتقاط الصور للحيوان الفردية، التي هي شاقة وتستغرق وقتا طويلا. وسيتم تعزيز برامج الإنتاجية العالية التي تتعامل مع تلقائيا واكتساب الخلوية القرار التصوير من الزرد في تركيبة مع جمع البيانات الكمية سيسهل على نطاق واسع فحص 26،27 الميزات .هذه إذا اقترن الآلي المخدرات نظام الجرعات التي تحدد مجموعة من تركيزات الكيميائية 28، التي يمكن أن تعطي الحد الأدنى سمية مع أقصى قدر من الفعالية لتعزيز تجديد خلايا الكبد. على الرغم من هذه limitaهي الحفاظ ستعقد، العديد من اللاعبين النقدي وأنواع الخلايا الرئيسية في الكبد بين الزرد والثدييات 29، ويعمل في الجسم الحي المستندة إلى جزيء صغير الفحص باستخدام نموذج الكبد متليفة الزرد وحفز اكتشاف صحيح استراتيجيات علاجية جديدة لمرض الكبد المزمن.

وقد أثبتت مجموعتين إضافية بصورة مستقلة بعد الخسارة الكلية بالقرب من خلايا الكبد من دون شتائم التليف، BECS transdifferentiated إلى الكبدية من خلال خطوة من فقد التمايز 30،31 مع افتراض أن cholangiocytes، تماما BECS متباينة، تشمل في المقام الأول آر سي إس / BECS في الزرد. على الرغم من أن transdifferentiation يمكن أن تكون واحدة من آليات القيادة تجديد خلايا الكبد، نتائجنا تشير إلى أن HPCS، التي هي معروفة لتشكل غالبية BECS في الكبد الزرد 32، downregulate النشاط الشق على التمايز إلى خلايا الكبد. وفي الوقت نفسه، فمن المعقول أن نفترض أن اله تماما BECS متباينة، cholangiocytes، والحفاظ على مستويات أعلى من النشاط الشق دون التحول إلى خلايا الكبد أثناء تجديد. ومن المثير للاهتمام، في ظل وجود ETOH، كما ذكرت سابقا 13، وجدنا أن HSCs زيادة في عدد والتشكل تغير من تكوين النجوم مثل لشكل يشبه الأرومة الليفية العضلية مع عمليات حشوية المفقودة. وHSCs تنشيط تتميز تركيب البروتينات ECM هي الجاني الرئيسي المسئول عن التئام الجروح غير طبيعية أثناء عملية متكاملة للإصلاح الكبد 4. وعلى الرغم من إصابة مزمنة في كثير من الأحيان يتجاوز قدرة الكبد ملحوظة للتجديد، زرع HPCS إسكانها بنجاح متليف / تليف كبد الفئران 33. وبالتالي، سيكون لدينا الزرد نموذج الكبد متليفة يكون أداة أساسية لتوضيح الآليات الجزيئية والخلوية التي تتوسط آثار تليف المستمر على بوساطة HPC الكبدية تجديد. وعلاوة على ذلك، وتحديد ج متعددة الخلاياسوف rosstalk أن يوازن بين التجدد والتليف عن طريق استخدام لدينا الزرد نموذج الكبد متليفة من تسهيل لوضع استراتيجيات علاجية قابلة للفشل الكبد المزمن في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من GTEC (2731336 و 1411318)، والمعاهد الوطنية للصحة (K01DK081351)، وجبهة الخلاص الوطني (1354837) لكلية العلوم الصحية نشكر عالم جيورجيس للقراءة نقدية للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) Acros AC385355000
Magnesium sulfate (MgSO4) EMD MX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) Sigma-Aldrich P6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-
N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)		 Sigma-Aldrich E3889
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Metronidazole (MTZ) Sigma-Aldrich M3761
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Phosphate-buffered saline (PBS) tablet Amresco E404 Dissolve one tablet with 100 ml distilled water
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP1600
Triton X-100 Fisher Scientific BP151
Low-melting agarose  Amresco BP165
Stem Cell Signaling Compound Library Selleck Chemicals L2100 10 mM stock in DMSO
ActiProbe-1K Library Timtec ActiProbe-1K 10 mM stock in DMSO
SB 415286 Selleck Chemicals S2729 Dissolve with DMSO to 10 mM
CHIR-99021 Selleck Chemicals S2924 Dissolve with DMSO to 10 mM
Anti-Collagen I antibody Abcam ab23730 Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Molecular Probes A31573 Use at 1:200 for immunostaining
Mounting media (Vectorshield) Vector Laboratories H-1400
100 mm Petri dish VWR 25384-088
24-well plate VWR 10062-896
Forceps Fine Science Tools 11255-20 Dumont #55
Glass slide VWR 48312-003 75x25 mm
Cover glass VWR 48366-045 18 mm
Plastic wrap Fisher Scientific 22305654
Aluminum foil Fisher Scientific 1213100
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Vibrotome Leica VT1000 S
Stereo microscope Leica M80
Epifluoresence microscope Leica M205 FA
Confocol microscope Zeiss LSM700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
  5. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  6. Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
  7. Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
  8. Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
  9. Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
  10. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  11. Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
  12. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
  14. Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
  15. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
  16. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  17. Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
  18. Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
  19. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
  20. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  21. Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
  22. Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
  23. Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
  24. Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
  25. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  26. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  27. Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
  28. Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
  29. Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
  30. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
  31. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
  32. Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
  33. Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 111، تليف الكبد، الزرد، وتجديد الكبد، خلية سلفية الكبدية، nitroreductase، ميترونيدازول، خلية النجمية الكبدية، وفحص المواد الكيميائية
تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Xu, J., Shin, C. H.… More

Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J. Vis. Exp. (111), e54002, doi:10.3791/54002 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter