Introduction
Til tross for den bemerkelsesverdige regenerering kapasitet av hepatocytter 1, som er den viktigste parenchymal celletype av leveren, hemmer kronisk leversvikt denne evnen, noe som fører til hepatisk stamceller (HPC) -avhengig regenerering 2.
Kronisk leverskader er i hovedsak hentet fra alkoholmisbruk, kronisk hepatitt C-virus (HCV) infeksjon 3 og alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD) 4. Det fører til vedvarende leverfibrose, som er forbundet med akkumulering av ekstracellulær matriks (ECM) proteiner. Vedvarende ECM opphopning forvrenger intakt hepatisk arkitektur ved å danne et fibrøst arrvev 5, noe som resulterer i etterfølgende cirrhose med høy sykelighet og dødelighet. Mange forsøk er blitt gjort for å dempe den fibrotiske responsen først og fremst ved å fokusere på å hemme profibrogenic cytokiner og aktiverte myofibroblasts 6. Den sistnevnte er først og fremst avledet fra leverceller stellate (HSC'er), prinsippet lever ikke-parenkymceller ansvarlig for leveren arrdannelse 4. Likevel, regenerative behandlinger som stimulerer endogene cellulære kilder, inkludert HPCS å regenerere hepatocytter i nærvær av vedvarende fibrogenic fornærmelser avvente videre undersøkelser.
Mange eksperimentelle modeller av leverfibrose har blitt beskrevet hos pattedyr. Repeterende injeksjon av karbontetraklorid (CCI4) har blitt mye brukt for å fremkalle leverfibrose i murine og rottemodeller 7. Når kombinert med en høy-fett (HF) kosthold, alkohol førte til en betydelig oppregulering av profibrogenic genekspresjon og leverfibrose 8. Mens steatose (lipid akkumulering) skyldes akutt alkoholinntak, det gjør leveren utsatt for mer alvorlig leverskade 9.
Sebrafisk, Danio rerio, har dukket opp som en uvurderlig virveldyr modellsystem for å studere regenerering. Skjøntandre lavere virveldyr som salamander og axolotls har en bemerkelsesverdig evne til regenerasjon, sebrafisk har fordeler fremfor andre modellsystemer i forhold til genmanipulering og visualiserings strategier for å manipulere potensiell nyttefaktorer 10. Sebrafisk representerer også en attraktiv virveldyr modell for å studere alkoholisk leversykdom (ALD) ved å legge etanol (EtOH) til vann. Akutt EtOH eksponering for larve og voksen sebrafisk forårsaket leversteatose 11-13. Når voksen sebrafisk fått utvidet EtOH eksponering, ble kollagen deponering observert med oppregulering av fibrose relaterte gener 14. Det finnes imidlertid et behov for å utvikle modeller for å undersøke lever regenerering som reaksjon på EtOH som en fibrogenic stimulus.
Nylig har vi utviklet et EtOH-indusert fibrotisk leveren modell i sebrafisk 15. Vi har kombinert en hepatocytter-spesifikke genetiske ablasjon system med EtOH behandling i larve og adult sebrafisk. Vi ga to transgene linjer, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 og Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, som E.coli nitroreductase (NTR) er smeltet til cyan og mCherry fluorescerende protein, henholdsvis under kontroll av hepatocytter spesifikke fettsyrebindende protein 10a, lever enkel (fabp10a) promoter. I dette system omdanner NTR et ikke-toksisk promedikament metronidazol (MTZ) inn i en DNA-inter-tråd tverrbindingsmiddel 16, indusere eksplisitt død av hepatocytter. Ved å bruke denne modellen, demonstrerte vi at en populasjon av leverceller, som reagerer på Notch-signalering, omdannes til hepatocytter i nesten fravær av hepatocytter og i overkant av ECM. Vi utpekt disse cellene som HPCS. Videre gjennom kjemiske skjermer, identifiserte vi lite molekyl aktivatorer av Wnt signal og hemmere av Notch signale som utvider hepatocytter regenerering i fibrotisk leveren. therefore, vår fibrotisk lever modell i sebrafisk representerer en suveren kjemisk screening system i forhold til celle kultur- eller pattedyr basert screening system. Det er en in vivo system med betydelig kostnads- og tidsbesparende fordeler. Her beskriver vi de detaljerte prosedyrer for å etablere en EtOH-indusert fibrotisk lever modellen og for å utføre kjemiske skjermer ved hjelp av denne modellen i sebrafisk. Videre ble tid-retters analyser utført for å undersøke hvordan hepatocytter regenerering skjer i fibrotisk leveren. Denne protokollen vil gi et uvurderlig verktøy for å studere mekanismer og strategier for å styrke hepatocytter regenerering i fibrotisk leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafisk ble reist og avlet ved hjelp av en standard protokoll som oppfyller kriteriene for National Institutes of Health og godkjent av Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Utarbeidelse av Solutions
- Forbered 20 L egg vann (om hverandre brukes med 'embryo medium') for å opprettholde embryo / larvesebrafisk. Oppløs 1,5 g Caso 4 og 6 g øyeblikkelig hav sjø salt i 250 ml destillert vann. Hell i en carboy fylt med 20 L destillert vann og rist.
- Fremstille en l 1-fenyl-2-tiourea (PTU) lagerløsning (20x). Oppløs 0,6 g PTU pulver i 1 liter destillert vann. Tilsett 1 ml av stamoppløsning per 20 ml embryo medium til en sluttkonsentrasjon på 0,003% som en arbeidsoppløsning.
FORSIKTIG: PTU kan forårsake systemisk toksisitet etter inhalasjon eller hudeksponering. Forbered og bruk i overensstemmelse med godkjente retningslinjer for håndtering. - Forbered en L etyl 3-aminobenzoate metansulfonat (Tricaine) stamløsning (20x). Oppløs 4 g Tricaine pulver i destillert vann. Juster pH til 7 ved tilsetning av 1 M Tris-buffer (pH 9), og bringe det endelige volum til 1 liter med destillert vann. Delmengde i 50 ml og oppbevares ved -20 ° C. Tine før bruk.
FORSIKTIG: Tricaine kan indusere et tap av følelse. Forbered og bruk i overensstemmelse med godkjente retningslinjer for håndtering. - Forbered 100 ml larve metronidazol (MTZ) arbeidsløsning. Gjøre fersk 15 mM MTZ oppløsning ved å oppløse 0,25 g MTZ pulver i 0,1% dimetylsulfoksid (DMSO) i 100 ml embryo medium. Løs opp MTZ pulver helt ved kraftig risting. Gjør frisk MTZ løsning og bruke aluminiumsfolie for å forhindre fotokatalytisk nedbrytning av MTZ.
FORSIKTIG: MTZ kan forårsake irritasjon. Forbered og bruk i overensstemmelse med godkjente retningslinjer for håndtering. - Forbered 100 ml larve etanol / metronidazol (EtOH / MTZ) arbeidsløsning. Gjør frisk MTZ løsning og bruke aluminiumsfolie for å forhindre fotokatalytisk degradering av MTZ. Tilsett 1,5 ml 100% etanol i 100 ml MTZ oppløsning til en endelig konsentrasjon på 1,5% umiddelbart før bruk.
- Forbered 500 ml voksen MTZ arbeidsløsning. Gjøre fersk 10 mM MTZ oppløsning ved å oppløse 0,83 g MTZ pulver i 0,1% DMSO i 500 ml vann system. Løs opp MTZ pulver helt ved kraftig risting. Gjør frisk MTZ løsning og bruke aluminiumsfolie for å forhindre fotokatalytisk nedbrytning av MTZ.
- Forbered en L PEM buffer. Løs opp 30,2 g rør, 0,74 g EGTA og 0,12 g MgSO4 i destillert vann. Juster pH til 7 med NaOH. Sluttvolumet bringes til 1 liter med destillert vann.
2. Utarbeidelse av Larve Sebrafisk
- Sett opp parring av [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 voksen sebrafisk med Tg (hand2: EGFP) pd24 13 voksen sebrafisk i parring tanker. Bruk skillevegger for å gjennomføre tidsbestemt parring.
- Ta av divider påfølgende morgen, og la fisken til å pare seg uten avbrudd. Slakte embryoer 2 timer senere etter å belaste systemet vann og overføre embryoene inn i 100 mm petriskåler med embryo medium.
- Hold ikke mer enn 100 embryoer per petriskål. Under en stereomikroskop, fjerne ubefruktede egg ved hjelp av et glass pipette. Dyrke embryoene ved 28 ° C og tilsett phenylthiourea (PTU) til en sluttkonsentrasjon på 0,003% etter 10 timers-post-befruktning (HPF) for å hemme utvikling pigment.
3. Etanol, metronidazol behandling og Liver Regeneration i Larve Sebrafisk
- Fremstille frisk EtOH-løsning ved tilsetning av etanol til embryo medium til en sluttkonsentrasjon på 1,5%. Ikke legg PTU.
- Unn embryoer med 20 ml etanol løsning per petriskål 56-80 HPF. Dekk petriskåler med plastfolie for å hindre etanol fordampning.
- Sortere ut [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) pd24] larver med tilsvarende leverstørrelse, som bestemmes av CFP uttrykk, ved 80 HPF. Ikke bruk Tricaine når sortering EtOH-behandlet larver fordi dette vil føre til høy dødelighet med påfølgende EtOH / MTZ behandling. Hold sorterte larver i en tetthet på 30 embryoer pr petriskål.
- Forbered fersk 15 mM MTZ i embryo medium i 0,1% DMSO. Legg riktig mengde EtOH inn i MTZ oppløsning for å lage en sluttkonsentrasjon på 1,5%. Inkuber larver i 20 ml EtOH / MTZ løsning pr petriskål i 24 timer ved 28 ° C. Dekk petriskåler med plastfolie for å opprettholde EtOH konsentrasjon og med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
- Ved slutten av behandlingen, fjerne EtOH / MTZ oppløsning ved å overføre larvene til nye petriskåler med friskt medium embryo. Vask larver 3 ganger med embryo medium og holde dem i 20 ml embryo medium uten PTU.
- For å sortere ut larver med nær komplett ablasjon av hepatocytter, observere fluorescensunder en epifluorescence mikroskop med CFP filter på en forstørrelse på 80X. Vellykket ablasjon resulterer i minimal CFP fluorescens i leveren og betydelig redusert levervolum.
- For å unngå død av EtOH / MTZ-behandlet larver, ikke bruk Tricaine for sortering. Fest larver for farging (se avsnitt 5) eller holde sortert larver i petriskåler ved 28 ° C for videre analyser.
4. Kjemiske skjermer i EtOH / MTZ-behandlet Larve Sebrafisk
- Ta med 96-brønners plater som inneholder 10 mM kjemiske aksjer i DMSO (se Materialer List for detaljer om de kommersielle kjemiske biblioteker) fra -80 ° C fryser. Dekk til med aluminiumsfolie for å forhindre fotokatalytisk nedbrytning av kjemikalier. Tine lager løsninger til RT med milde rocking.
- Fremstille kjemiske løsninger ved fortynning av 10 mM lagerløsninger med embryo medium til en endelig konsentrasjon på 50 uM (i 96-brønners plater: s innledendecreen; i 1,5 ml rør: retesting). Kontroll-larver ble behandlet med like konsentrasjoner av DMSO i embryo medium.
- Overføring larver med nesten fullstendig hepatocytter ablasjon, som ble behandlet med 1,5% EtOH / 15 mM MTZ og sortert som tidligere nevnte, til enten 96-brønners (initial skjerm) eller 24-brønns (retesting) plater forhåndsfylt med embryo medium ved en tetthet på 5 larver per brønn. Bruk to brønner for hver kjemisk.
- Fjern embryo medium og tilsett enten 250 pl (96-brønners plater) eller 500 ul (24-brønners plater) kjemiske løsningene til hver brønn. Bånd med aluminiumsfolie og behandle larver i 50 timer ved 28 ° C. Inspiser kjemisk-soaking larver daglig og fjerne eventuelle døde larver fra individuelle brønner.
- Ved slutten av den kjemiske behandling, observere antallet og / eller intensiteten av CFP-uttrykk hepatocytter under en epifluorescens mikroskop med CFP filter ved en forstørrelse på 80X. Foto levende larver viser forbedret eller redusereD-nummer og / eller intensiteten av CFP-uttrykke hepatocytter med et digitalt kamera for poster.
- Bevar larver av formaldehyd fiksering for confocal bildebehandling som beskrevet i kapittel 5.
- For å teste de kjemikaliene som letter hepatocytter regenerering i det første skjermbildet undersøke sin styrke ved høyere og lavere konsentrasjoner for å finne den mest effektive konsentrasjon med prosedyrene beskrevet i 4.1 til 4.5 ( 'retesting).
5. Larve Sebrafisk Fiksering, Farging, og Confocal Imaging
- Bedøve larver ved tilsetning Tricaine til en sluttkonsentrasjon på 0,02%. Overfør 10-15 larver til et 1,5 ml rør og vask en gang med fosfat-bufret saltvann (PBS). Fjern PBS og tilsett 1 ml nylaget 2% formaldehyd i PEM-buffer for å fikse O / N ved 4 ° C.
FORSIKTIG: Formaldehyd forårsaker irritasjon og er kjent for å være et menneske kreftfremkallende. Håndtak i avtrekksskap. - Kast fikse løsningen riktig og deretter wash 3 ganger med PBS ved RT. Faste larver kan holdes i PBS ved 4 ° C i opptil flere dager. Går videre til neste trinn gir raskt bedre immunfarging resultater.
- fjerne eggeplomme og hud som dekker leveren området ved hjelp av en # 55 tang under et stereomikroskop nøye.
- Permeabilize og blokk larver i blokk-buffer (4% bovint serumalbumin og 0,3% Triton X-100 i PBS) O / N ved 4 ° C.
- Inkuber med kanin anti-Collagen I-antistoff i en fortynning på 1: 100 i blokk buffer O / N ved 4 ° C. Vask 5 ganger i 15 minutter hver med vaskebuffer (0,3% Triton X-100 i PBS).
- Inkuber med 647 AlexaFluor konjugert esel-anti-kanin-antistoff i en fortynning på 1: 200 i blokk buffer O / N ved 4 ° C. Vask 5 ganger i 15 minutter hver med vaskebuffer. Vask deretter en gang med PBS.
- overføre larvene forsiktig til glassplater ved hjelp av et glass pipette, og orientere fast larver med venstre sidesiden opp. Fjern overflødig PBS bruker Kimwipes. Tilsett en dråpe monterings mediaOg sel dekkglass med neglelakk. Gjennomføring confocal bildebehandling umiddelbart er sterkt anbefalt.
- Bruk en confocal system utstyrt med en 40X / 1.3 olje linse for å ta bilder. Bruk laserstyrke på 20-50%. Capture Z stack bilder på 1 mikrometer intervaller.
6. Utarbeidelse av Adult Sebrafisk
- Sett opp parring av [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 voksen sebrafisk i parring tanker. Harvest-embryoer neste morgen ved å belaste systemet vann og overføre embryoene til 100 mm petriskåler med embryo medium.
- Hold ikke mer enn 100 embryoer per petriskål. Under en stereomikroskop, fjerne ubefruktede egg ved hjelp av et glass pipette. Dyrke embryoene ved 28 ° C og tilsett PTU til en sluttkonsentrasjon på 0,003% etter 10 HPF for å hemme utvikling pigment.
- På fire dpf, bruker Tricaine å bedøve larver og sortere ut [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larver. Skyll Tricaine ved å endre til ferske embryo medium flere ganger. Tillat larver å gjenopprette ved 28 ° C før de oppnår normal puls på 120-180 slag per minutt 18.
- Hev sortert larver til 6-12 måneder gamle basert på standard prosedyre 19.
7. Etanol, metronidazol behandling, og lever Regeneration i voksen Sebrafisk
- Overfør 6-12 måneder gamle [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] voksen sebrafisk til parring stridsvogner ved hjelp av et nett. Holder fisken ved en densitet på ikke mer enn 10 fisk per tank.
- Fremstille frisk EtOH-løsning ved tilsetning av EtOH i systemet vann til en sluttkonsentrasjon på 1%. Behandle voksen fisk med 500 ml EtOH oppløsning i hver tank og opprettholde dem i en 28 ° C inkubator.
- Overføring voksen fisk til frisk EtOH løsning daglig, kast død fisk proplig som en biohazard. Kontinuerlig behandle dyr for 72 timer før MTZ behandling.
- Forbered fersk 10 mM MTZ løsning i system vann i 0,1% DMSO. Forvarme den MTZ oppløsning i en 28 ° C inkubator. Behandler fisk med 500 ml MTZ oppløsning i en l krysset tank i 8 timer ved 28 ° C, beskyttes mot lys ved hjelp av aluminiumsfolie.
- Observer time under behandlingen og fjerne død fisk umiddelbart. Kast død fisk riktig som en biohazard. Ved slutten av behandlingen MTZ, vaske ut MTZ ved å overføre dyr i frisk system vann to ganger.
- Tillat dyr for å gjenopprette og opprettholde dem i en inkubator ved 28 ° C. Fôr og overføre fisk til frisk system vann hver dag frem til tidspunktet for analyser.
8. Adult Sebrafisk Liver Fiksering, Farging, og Confocal Imaging
- Bedøve voksen fisk med 0,02% Tricaine og avlive i isvann i 15 min. Pat fisken tørke på et kjøkkenpapir og legg den på en dissekere matte.
- Expose gastrointestinale organer ved å fjerne hud og muskler som tidligere beskrevet 20. Bruke saks for å klippe i huden og underliggende muskel langs buken fra analfinnen til den operculum, og deretter posteriort langs siden av fisken tilbake til gattfinnen.
- Sette fisken i et 15 ml konisk rør og vaskes en gang med PBS. Fjern PBS og tilsett 4 ml nylaget 2% formaldehyd i PEM-buffer for å fikse O / N ved 4 ° C.
- Kast fikseringsoppløsning på riktig måte, og vask 3 ganger med PBS ved romtemperatur. Faste prøver kan holdes i PBS ved 4 ° C i flere dager. Går videre til neste trinn umiddelbart gir bedre immunfarging resultater.
- Dissekere hele tarmen med leveren fra kroppshulrommet av fisken ved å kutte spiserøret. Embed gastrointestinale organer med 4% lavt smeltepunkt agarose i en seksjonering mold.
- Bruk en vibratome å skjære prøver inn i tverrgående partier 50 mikrometer intervaller i iskald PBS, med start fra den fremre ende. Overfør seksjoner til seks-brønns plate med PBS ved hjelp av en # 1 pensel.
- Permeabilize og blokkseksjoner i Block buffer O / N ved 4 ° C.
- Inkuber med kanin anti-Collagen I-antistoff i en fortynning på 1: 100 i blokk buffer O / N ved 4 ° C. Vask 5 ganger, 15 minutter hver med vaskebuffer.
- Inkuber med 647 AlexaFluor konjugert esel-anti-kanin-antistoff i en fortynning på 1: 200 i blokk buffer O / N ved 4 ° C. Vask 5 ganger, 15 minutter hver med vaskebuffer og en gang med PBS.
- Forsiktig overføre deler til glassplater ved hjelp av en # 1 pensel. Fjern overflødig PBS bruker Kimwipes, tilsett en dråpe monterings media, og sel dekkglass med neglelakk. Gjennomføring confocal bildebehandling umiddelbart er svært foreslått.
- Bruk en confocal system utstyrt med en 40X / 1.3 olje linse for å ta bilder. Bruk laserstyrke på 20-50%. Capture Z stack bilder på 1 mikrometer intervaller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser utviklingen av en EtOH-indusert fibrotisk leveren modell i larvesebrafisk. For å optimalisere en protokoll for å utsette sebrafisk larver til EtOH, må vi først vurderes EtOH toksisitet. 2,5 dager-post-fertilisering (DPF) larver ble utsatt for EtOH konsentrasjon 1%, 1,5%, eller 2% for 24 timer, etterfulgt av en samtidig 24-timers EtOH / MTZ behandling. Eksponering for 2% EtOH forårsaket høy dødelighet, mens nesten alle larver utsettes til 1% EtOH eller mindre vist mini fibrogenic endringer med sjeldne deponering av ekstracellulære matrix proteiner som kollagen. Basert på disse resultatene ble larvene forbehandlet med 1,5% EtOH i 24 timer (2,5-3,5 dpf) og deretter behandlet samtidig med MTZ i 24 timer (3,5-4,5 DPF) (figur 1A). Den EtOH / MTZ-behandlet larver viste morfologiske abnormaliteter inkludert oppadgående kurve av stammen og hale, perikard ødem, og unnlatelse av å blåse svømmeblæren. (Figur 1B). Vibrukt tre transgene linjer for å analysere fibrogenic endringer i EtOH / MTZ-behandlede larve lever: 1) Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 linjen uttrykker NTR genet smeltet sammen med cyan fluorescens protein under hepatocytter spesifikke fabp10a promoter 15; 2) Tg (TP1: mCherry) jh11 linje markerer celler med aktiv Notch signale (Notch-responsive celler, NRC) eller galle epitelceller (Wien) med atom mCherry 17, som ekspresjon er under kontroll av den TP1 modul inneholdende multiple RBP- jk-bindende områder; og 3) Tg (hand2: EGFP) pd24 linje, som etiketter leverstel celler (HSCs) 13. DMSO-behandlet kontroll [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11, Tg (hand2: EGFP) pd24] lever viste ingen fibrillar type I kollagen deponering 4,6,9 (figur 1C, C '), mens EtOH / MTZ-behandlet lever vises forhøyet type I kollagen akkumulering på 25 og 50-timers-post-ablasjon (HPA) (figur 1D, D ', E, E'). I tillegg, sammenlignet med DMSO-behandlede kontroll lever (figur 1C ''), økt HSCs i nummer med den endrede morfologi fra en stjernelignende konfigurasjon til en myofibroblast-lignende form med tapte cytoplasmiske prosesser i EtOH / MTZ-behandlede regenererende lever ( Figur 1D '', E ''). Vi observerte to atskilte populasjoner av mCherry-uttrykker NRCS ved 25 hPa i EtOH / MTZ-behandlet regenererende lever: dim røde NRC (figur 1D '' ', innfelt, hvite piler) og lyse røde NRC (figur 1D' '', innfelt , gul pilspisser). På 50 hpa, hepatocytter spesifikke CFP begynte å co-express i NRC med dim mCherry uttrykk gjennom de regenererende leveren (figur 1E '' ', innfelt, hvite piler). Disse CFP og dim mCherry-coexpressing NRC er tydeligvis skiller seg fra lyse røde NRC som er negative for CFP (figur 1E '' ', innfelt, gul pilspisser). Tidligere studier har vist at når hepatocytter spredning ble undertrykt etter delvis hepatectomy (PHX), utvidet HPCS med samtidig spredning av HSCs 21. I tillegg er HPCS og Wien delte histochemical markører 22. Derfor våre resultater viser at CFP og dim mCherry co-uttrykke NRCS skildre en sebrafisk-motstykket til HPCS som skiller i hepatocytter etter møte Notch downregulation. De NRCS opprettholde høyere nivåer av Notch signale kan forbli som cholangiocytes, som er differensiert Becs 23.
Figur 2 viser utviklingen av en EtOH-indusert fibrotisk leveren modell i voksen sebrafisk. For det første utsettes vi voksne sebrafisk til 1%, 1,5% eller 2% EtOH for å vurdere levedyktigheten. De fleste voksne sebrafisk gjorde not overlever mer enn 72 timer med eksponering til EtOH konsentrasjoner større enn 1% (upubliserte data). Derfor, for voksen sebrafisk, vi forbehandlet fisken med 1% EtOH for 72 timer og fulgte med MTZ behandling (figur 2A). Ved å utføre tidsforløpet analyser viste vi signifikant forhøyet type I kollagen deponering i EtOH / MTZ-behandlede regenererende lever ved 2, 3, og 4 dager-postablasjon (DPA) (figur 2C ', D', E ') sammenlignet med DMSO-behandlede lever (figur 2B). I likhet med det som ble observert i larvene ble CFP og dim mCherry co-uttrykke celler påvises i EtOH / MTZ-behandlede regenererende lever av 12 måneder gamle [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] voksen fisk på 3 og 4 dpa (figur 2D, E, innfellinger, hvite piler). Disse data indikerer at den HPCS, responsiv til Notch-signalering, opprettholder sin kapasitet for regenerering som hepatocytter itilstedeværelsen av fibrogenic fornærmelse i voksen sebrafisk.
Figur 3 viser representative kjemiske screening resultater ved hjelp av vår etanol-indusert fibrotisk leveren modell i larvesebrafisk. For å presisere bioaktive forbindelser som fremskynder hepatocytter regenerering i fibrotiske leveren, utførte vi kjemiske genetiske skjermer. Vi screenet et bibliotek med 75 små molekyler med veldefinerte biologiske og farmasøytiske aktiviteter (Stem Cell Signa forbindelse Bibliotek, Selleckchem) og et bibliotek med 1000 mindre preget små molekyler (ActiProbe-1K Library, TimTec) ved hjelp av [Tg (fabp10a: CFP -NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larver. Vi ablateres hepatocytter i nærvær av 1,5% EtOH / 15 mM MTZ og deretter eksponert larvene for 50 uM av forbindelsen i 50 timer (figur 3A). En rekke wnt agonister som SB-415286 og Chir-99021, inhibitorer av glykogen syntase kinase-3, fremmet hepatocytter regenerering (figur 3C, D) sammenlignet med DMSO (figur 3B). Videre [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-yl) -1,2,5-oksadiazol-3-ylamin], forkortet som HTOA, en ny Wnt sti-aktivator, forbedres hepatocytt regenerering den fibrotiske leveren som antydet med større regenererte lever (figur 3E). Disse dataene tyder på at vår vedvarende fibrotisk Modellen gir et uvurderlig verktøy for å oppdage små molekyler som forbedrer hepatocytter gjenfødelse.
Figur 1. Utvikling av en etanol-indusert lever fibrotisk modell i larvesebrafisk. (A) Reaksjonsskjema som illustrerer perioder med EtOH og EtOH / MTZ behandling for å etablere en fibrotisk leveren modell i larver. (B) På 50 timer-post-ablasjon (HPA), EtOH / MTZ-behandlet lArval sebrafisk utviklet morfologiske abnormaliteter inkludert oppadgående kurve av stammen og hale, perikard ødem, og unnlatelse av å blåse opp svømmeblæren. (CC '' ') i leveren hos [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) pd24] larver behandlet med DMSO, ECM-protein kollagen 1a var nesten umulig å oppdage (C, C ') og hvilende HSCs viste en stjernelignende konfigurasjon (C' '), mens NRC fordelt på hepatocytter (C, C '' ', innfelt). (DE '' ') i leveren hos EtOH / MTZ-behandlede larver ble forhøyet kollagenavsetning 1a observert (D, D', E, E '). HSCs økt i antall og tapte komplekse cytoplasmatiske prosesser (D '', E ''). Ved 25 hPa blir mCherry-uttrykk NRCS sammensatt av to distinkte populasjoner. Gule pilspisser indikerer lyse røde NRC (D '' ', innfelt), mens hvite piler indikerer dim røde NRC (D' '', innfelt). På 50 hpa, Tg (fabp10a: CFP-NTR) og Tg (TP1: mCherry) co-uttrykke celler startet voksende i hele regenererende leveren (E '' ', innfelt, hvite piler), mens de lyse røde NRC hadde ingen CFP uttrykk (E '' ', innfelt, gul pilspisser). Alle confocal bilder er enkelt plan bilder unntatt C '', D '', E '', som er projeksjonsbildene. Skala barer: B, 100 um; CE '' ', 20 um. EtOH etanol; MTZ, metronidazol; hpa, timer-post-ablasjon; dpf, dager-post-fertilisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Utvikling av en etanol-indusert fibrotisk leveren modell i voksen sebrafisk. (A) Scheme illustrerer perioder med EtOH og MTZ behandling for å etablere en fibrotisk leveren modell i voksen. (BE ') Tg (fabp10a: CFP-NTR), Tg (TP1: mCherry), og kollagen 1a uttrykk i vibratome deler av DMSO (B og B') og EtOH / MTZ-behandlet (CE ') voksen sebrafisk lever. (BB ') I DMSO-behandlede kontroller, kollagen 1a var nesten umulig å oppdage (B') uten Tg (fabp10a: CFP-NTR) og Tg (TP1: mCherry) co-uttrykke celler (B). (CE ') I de EtOH / MTZ-behandlede regenererende lever, kollagen 1a avsetning ble sterkt forhøyet ved 2, 3, og 4 dpa (C', D ', E') med enBefolkningen i Tg (fabp10a: CFP-NTR) og Tg (TP1: mCherry) co-uttrykke celler på 3 og 4 dpa (D, E, innfellinger, hvite piler). De lyse røde NRC hadde ingen CFP uttrykk (D, E, innfellinger, gul pilspisser). BE, confocal enkelt plan bilder. B'-E ', confocal projeksjonsbildene. Scale bar, 20 mikrometer. EtOH etanol; MTZ, metronidazol; dpa, dager-post-ablasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative kjemisk screeningresultater ved hjelp av etanol-indusert fibrotisk leveren modell i larvesebrafisk. (A) Scheme for hepatocytter regenerering skjermen i fibrotisk leveren. (BE) kjent og romanen Wntaktivatorer øke hepatocytter regenerering i fibrotisk leveren. Confocal projeksjoner av EtOH / MTZ-behandlede lever i [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1, Tg (TP1: mCherry) jh11] larver som ble administrert med DMSO (B), SB415286 (C), tsjir-99021 ( D), eller en ny Wnt aktivator [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-yl) -1,2,5-oksadiazol-3-ylamin] (forkortet som HTOA) (E). SB415286 og tsjir-99021 er glykogensyntasekinase-3-hemmere. Alle bilder er confocal projeksjonsbildene. Scale bar, 20 mikrometer. EtOH etanol; MTZ, metronidazol; hpa, timer-post-ablasjon; dpf, dager-post-fertilisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har observert HPC-mediert hepatocytt regenerering i EtOH / MTZ-behandlede utvinne lever, noe som tyder på at selv i nærvær av vesentlig mengde av ECM-proteiner, inkludert fibrillære type I kollagen, det HPCS beholder sin kompetanse å regenerere som hepatocytter. Den MTZ bare-behandling økte ikke deponering av ECM proteiner betydelig, mens EtOH eneste behandlingsinduserte ikke HPC aktivering 15. Ved å benytte den kombinerte EtOH / MTZ behandling, var vi i stand til å etterforske HPC-drevet regenerering i fibrotisk leveren. Som nær komplett eliminering av hepatocytter utløser HPC-drevet hepatocytter gjenfødelse, er det viktig å sortere ut MTZ-behandlet larver basert på kriteriene for fravær av hepatocytter spesifikke fluorescens og betydelig redusert levervolum av klynge NRC. I fisk, blodkarene i gjelle og huden absorbere alkoholen 24, slik at det ikke er noe behov for å tillate dyrene drikke ad libitum eller krever intragastric infusjon som i pattedyrmodeller. Vi holder til EtOH- og påfølgende MTZ-behandlede voksne fisk i egne tanker uten å sirkulere vannet. Det er viktig å overføre fisk til frisk EtOH løsning daglig og holde lokket på å minimalisere fordamping av EtOH. Selv om 48-72 timers EtOH / MTZ behandling effektivt induserer ECM proteinsyntese i våre protokoller, har verken avansert fibrose eller cirrhose er utviklet i disse fiskene. Derfor kombinasjon av MTZ med langvarig eksponering av etanol for eksempel 12 ukers behandling 14, spesielt i voksen fisk, kan indusere mer alvorlig leverskade skikkelig simulere og avhøre HPC-drevet regenerering i kronisk leversvikt.
Sebrafisk fungerer som en fremragende dyremodell for in vivo sammensatte testing på grunn av sin lille størrelse, store avkom, åpenhet, og permeabilitet til små molekyler 25. Bruk av fibrotisk leveren modellen i sebrafisk, identifiserte vi en rekke kjente og romanen Wnt aktitorer og Notch-hemmere som akselererte hepatocytter regenerering 15. Vår nåværende fluorescens-basert kjemisk screening protokollen består av flere trinn alt utføres manuelt herunder utarbeidelse av kjemikalier, overføre EtOH behandlet / hepatocytter-ablated larver til 24-brønners plater, behandle kjemikalier, og analyse av effekter av kjemikalier på hepatocytter gjenfødelse. Den benytter spesielt epifluorescens og / eller konfokalt mikroskop for å ta bilder for individuelle dyr, noe som er arbeidskrevende og tidkrevende. Høy throughput plattformer som automatisk håndterer og skaffe cellular-oppløsning avbildning av sebrafisk i kombinasjon med kvantitativ datainnsamling vil lette storskala screening 26,27 .Disse funksjoner vil bli styrket hvis det kombineres med automatisk doseringssystem som bestemmer omfanget av kjemiske konsentrasjoner 28, noe som kan gi minimum toksisitet med maksimal effekt for å øke hepatocytter regenerering. Til tross for disse limitasjoner, da mange kritiske spillere og hovedcelletyper i leveren er konservert mellom sebrafisk og pattedyr 29, som anvender in vivo -baserte lite molekyl screening ved hjelp av sebrafisk fibrotiske leveren modellen vil katalysere gjelder oppdagelse av nye terapeutiske strategier for kronisk leversykdom.
Ytterligere to grupper uavhengig har vist at etter nær totalt tap av hepatocytter uten fibrogenic fornærmelser, Wien transdifferentiated i hepatocytter gjennom et skritt av dedifferentiation 30,31 med antagelsen om at cholangiocytes, fullt differensierte Wien, primært omfatte NRC / Becs i sebrafisk. Selv om transdifferensiering kan være en av mekanismene for kjøring hepatocytter regenerering våre resultater indikerer at HPCS, som er kjent å utgjøre mesteparten av Wien i sebrafisk leveren 32, nedregulere Notch aktivitet til å differensiere til hepatocytter. Samtidig er det sannsynlig å spekulere i at the fullt differensierte Wien, cholangiocytes, opprettholde høyere nivåer av Notch aktivitet uten å konvertere til hepatocytter under regenerering. Intriguingly, i nærvær av EtOH, som tidligere rapportert 13, har vi funnet at HSCs økt i antall med den endrede morfologi fra en stjernelignende konfigurasjon til en myofibroblast-lignende form med tapte cytoplasmiske prosesser. De aktiverte HSCs karakterisert ved syntese av ECM-proteiner er prinsippet skyldige ansvarlig for unormal sårheling under den integrerte prosess av lever reparasjon 4. Selv om kroniske skader ofte overstyrer leveren bemerkelsesverdig evne til regenerasjon, transplantert HPCS hell skar den fibrotiske / cirrhose rottelever 33. Derfor vil vår sebrafisk fibrotisk leveren modellen være et viktig verktøy for å belyse de molekylære og cellulære mekanismer som medierer effekten av vedvarende fibrose på HPC-mediert hepatocytter regenerering. Videre definerer den multi-cellulære crosstalk som balanserer fornyelse og fibrose ved å utnytte vår sebrafisk fibrotisk leveren modellen vil videre legge til rette for å utforme levedyktige terapeutiske strategier for kronisk leversvikt in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra GTEC (2731336 og 1411318), NIH (K01DK081351), og NSF (1.354.837) til CHS Vi takker Alem Giorgis for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K.
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L.
- Bataller, R., Brenner, D. A.
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P.
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
