Introduction
Trods af de bemærkelsesværdige regenereringsevne af hepatocytter 1, som er den største parenkymalt celletype af leveren, kronisk leversvigt svækker denne evne, hvilket fører til nedsat progenitorcelle (HPC) -afhængig regenerering 2.
Kronisk leverskader er hovedsageligt stammer fra alkoholmisbrug, kronisk hepatitis C virus (HCV) infektion 3 og ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD) 4. Det fører til en vedvarende leverfibrose, som er forbundet med akkumuleringen af ekstracellulær matrix (ECM) proteiner. Vedvarende ECM akkumulering fordrejer intakt hepatisk arkitektur ved at danne et fibrøst arvæv 5, efterfølgende resulterer i cirrhosis med høj morbiditet og mortalitet. Mange forsøg er blevet gjort for at mindske den fibrotiske reaktion hovedsageligt ved at fokusere på inhibering profibrogenic cytokiner og aktiverede myofibroblaster 6. Sidstnævnte er primært afledt af hepatiske stjerneformige celler (HSCs), de vigtigste hepatiske ikke-parenkymceller ansvarlige for leveren ardannelse 4. Ikke desto mindre, regenerative behandlinger, der stimulerer endogene cellulære kilder, herunder HPCs at regenerere hepatocytter i overværelse af vedvarende fibrogene fornærmelser afventer yderligere undersøgelser.
Mange forsøgsmodeller af hepatisk fibrose er blevet beskrevet i pattedyr. Gentagen injektion af carbontetrachlorid (CCI4) har været meget anvendt til at inducere leverfibrose i murine og rottemodeller 7. Når det kombineres med en fedtrig (HF) kost, alkohol ført til en betydelig opregulering af profibrogenic genekspression og hepatisk fibrose 8. Mens steatose (lipid ophobning) skyldes akut eksponering alkohol, det gør leveren modtagelige for mere alvorlig leverskade 9.
Den zebrafisk, Danio rerio, har vist sig som en uvurderlig hvirveldyr modelsystem til undersøgelse regenerering. Selvomandre lavere hvirveldyr som f.eks salamandre og axolotls har en bemærkelsesværdig evne til regeneration, at zebrafisk har fordele frem for andre modelsystemer i forhold til de genmanipulation og visualisering strategier er nødvendige for at manipulere potentielle regenerativ faktorer 10. Zebrafisken repræsenterer også en attraktiv hvirveldyr model til at studere alkoholisk leversygdom (ALD) ved blot at tilføje ethanol (EtOH) til deres vand. Akut EtOH udsættelse for larver og voksne zebrafisk forårsagede leversteatose 11-13. Når voksne zebrafisk fik forlænget EtOH eksponering blev collagenaflejringen observeret med opregulering af fibrose-relaterede gener 14. Imidlertid er der et behov for at udvikle modeller til at studere leverregenerering som reaktion på EtOH som fibrogene stimulus.
For nylig har vi udviklet en EtOH-induceret fibrotisk lever model i zebrafisk 15. Vi kombinerede en hepatocyt-specifik genetisk ablationssystem med EtOH behandling i larvernes og Adult zebrafisk. Vi genererede to transgene linjer, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 og Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, hvor E.coli nitroreduktase (NTR) er fusioneret til cyan og mCherry fluorescerende protein, henholdsvis under kontrol af hepatocyt-specifik fedtsyrebindende protein 10a, lever basic (fabp10a) promotor. I dette system NTR konverterer en ikke-toksisk prodrug metronidazol (MTZ) i en DNA inter-streng tværbindingsmiddel 16, inducere eksplicit død af hepatocytter. Under anvendelse af denne model påviste vi, at en population af leverceller, som reagerer på Notch signalering, omregnet til hepatocytter i nær fravær af hepatocytter og i overskud af ECM. Vi har udpeget disse celler som HPC'er. Desuden gennem kemiske skærme, vi identificeret lille molekyle aktivatorer af Wnt-signalering og hæmmere af Notch signalering, som styrker hepatocyt regenerering i fibrøse leveren. therefore, vores fibrotisk lever model i zebrafisk repræsenterer en fantastisk kemisk screening-system i forhold til celle kultur- eller pattedyr-baserede screening system. Det er et in vivo-system med betydelig omkostnings- og tidsbesparelser. Her beskriver vi de nærmere regler for oprettelse af en EtOH-induceret fibrotisk lever model og til at udføre kemiske skærme ved hjælp af denne model i zebrafisk. Desuden blev tidsforløb analyser udført for at undersøge, hvordan hepatocyt regenerering forekommer i den fibrotiske leveren. Denne protokol vil give et uvurderligt værktøj til at studere de mekanismer og strategier til at forbedre hepatocyt regenerering i fibrøse leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafisk blevet rejst og opdrættet ved hjælp af en standard protokol, der opfylder kriterierne i National Institutes of Health og godkendt af Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Fremstilling af opløsninger
- Forbered 20 L æg vand (flæng bruges med 'embryo medium «) for at opretholde embryonal / larve zebrafisk. Opløs 1,5 g CaSO 4 og 6 g øjeblikkelig ocean havsalt i 250 ml destilleret vand. Hæld i en ballon fyldt med 20 L destilleret vand og agitere.
- Forbered 1 L 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU) stamopløsning (20x). 0,6 g PTU Pulveret opløses i 1 L destilleret vand. Der tilsættes 1 ml stamopløsning pr 20 ml embryo medium til en slutkoncentration på 0,003% som en brugsopløsning.
ADVARSEL: PTU kan forårsage systemisk toksicitet efter inhalation eller dermal eksponering. Forbered og brug i overensstemmelse med passende retningslinjer håndtering. - Forbered en L ethyl 3-aminobenzoate methansulfonat (tricaine) stamopløsning (20x). 4 g tricaine pulver i destilleret vand opløses. Indstil pH til 7 ved tilsætning af 1 M Tris-puffer (pH 9), og bringe slutvolumenet til 1 l med destilleret vand. Portion i 50 ml og opbevares ved -20 ° C. Tø før brug.
ADVARSEL: tricaine kan inducere et tab af følelse. Forbered og brug i overensstemmelse med passende retningslinjer håndtering. - Forbered 100 ml larve metronidazol (MTZ) arbejder løsning. Lave frisk 15 mM MTZ opløsning ved at opløse 0,25 g MTZ pulver i 0,1% dimethylsulfoxid (DMSO) i 100 ml embryo medium. MTZ Pulveret opløses fuldstændigt ved kraftig omrystning. Foretag frisk MTZ løsning og bruge alufolie for at forhindre fotokatalytisk nedbrydning af MTZ.
ADVARSEL: MTZ kan forårsage irritation. Forbered og brug i overensstemmelse med passende retningslinjer håndtering. - Forbered 100 ml larver ethanol / metronidazol (EtOH / MTZ) arbejder løsning. Foretag frisk MTZ løsning og bruge alufolie for at forhindre fotokatalytisk degraduering af MTZ. Tilføj 1,5 ml 100% ethanol i 100 ml MTZ opløsning til en endelig koncentration på 1,5% umiddelbart inden brug.
- Forbered 500 ml voksen MTZ arbejdsopløsning. Foretag frisk 10 mM MTZ løsning ved at opløse 0,83 g MTZ pulver i 0,1% DMSO i 500 ml systemet vand. MTZ Pulveret opløses fuldstændigt ved kraftig omrystning. Foretag frisk MTZ løsning og bruge alufolie for at forhindre fotokatalytisk nedbrydning af MTZ.
- Forberede 1 L PEM puffer. Opløs 30,2 g PIPES, 0,74 g EGTA og 0,12 g MgSO4 i destilleret vand. Indstil pH til 7 med NaOH. Bring slutvolumenet op på 1 liter med destilleret vand.
2. Udarbejdelse af Larve Zebrafisk
- Opsætning parring af [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 voksne zebrafisk med Tg (hand2: EGFP) pd24 13 voksne zebrafisk i parring tanke. Brug dividers at foretage tidsindstillet parring.
- Fjern divider den følgende morgen og tillade fisk at parre uden forstyrrelser. Harvest embryoner 2 timer senere ved at belaste systemets vand og overførsel af embryoner i 100 mm petriskåle med embryo medium.
- Hold ikke mere end 100 embryoner pr petriskål. Under et stereomikroskop, fjerne ubefrugtede æg ved hjælp af et glas pipette. Grow embryoer ved 28 ° C og tilsæt phenylthiourea (PTU) til en slutkoncentration på 0,003% efter 10 timer post-befrugtning (HPF) til at inhibere pigment udvikling.
3. Ethanol, Metronidazole Behandling og Liver Regeneration i Larve Zebrafisk
- Forbered frisk EtOH opløsning ved tilsætning af ethanol til embryo medium til en slutkoncentration på 1,5%. Tilføj ikke PTU.
- Behandle fostre med 20 ml ethanolopløsning pr Petri skål fra 56 til 80 HPF. Dæk petriskåle med plastfolie for at forhindre ethanol fordampning.
- Sorter ud [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) pd24] larver med lignende leverstørrelse, som bestemt af FFP udtryk ved 80 HPF. Brug ikke tricaine når sortering EtOH-behandlede larver, fordi dette vil medføre høj dødelighed med efterfølgende EtOH / MTZ behandling. Hold sorterede larver ved en densitet på 30 embryoner pr petriskål.
- Forbered frisk 15 mM MTZ i embryo medium i 0,1% DMSO. Tilføj korrekte mængde EtOH i MTZ løsning til at foretage en endelig koncentration på 1,5%. Inkuber larver i 20 ml EtOH / MTZ opløsning pr petriskål i 24 timer ved 28 ° C. Cover petriskåle med plastfolie for at opretholde EtOH koncentration og med aluminiumsfolie for at beskytte mod lys.
- Ved afslutningen af behandlingen fjernes EtOH / MTZ opløsning ved at overføre larver til nye petriskåle med frisk embryo medium. Vask larver 3 gange med embryo medium og holde dem i 20 ml embryo medium uden PTU.
- For at sortere larverne med næsten fuldstændig ablation af hepatocytter, observere fluorescensunder en epifluorescensmikroskop med den fælles fiskeripolitik filter ved en forstørrelse på 80X. Succesfulde ablation resultater i minimal fælles fiskeripolitik fluorescens i leveren og betydeligt reduceret levervolumen.
- For at undgå død EtOH / MTZ-behandlet larver, skal du ikke bruge tricaine til sortering. Fix larverne for immunfarvning (se afsnit 5) eller beholde sorterede larver i petriskåle ved 28 ° C i yderligere analyser.
4. Kemiske Skærme i EtOH / MTZ-behandlede Larve Zebrafisk
- Bring 96-brønds plader indeholdende 10 mM kemiske lagre i DMSO (se liste Materialer til oplysninger om de kommercielle kemiske biblioteker) fra -80 ° C fryser. Dæk med alufolie for at forhindre fotokatalytisk nedbrydning af kemikalier. Optø stamopløsninger ved RT med blide vuggende.
- Forbered kemiske opløsninger ved fortynding 10 mM stamopløsninger med embryo medium til en slutkoncentration på 50 uM (i plader med 96 brønde: indledende screen; i 1,5 ml rør: fornyet prøvning). Kontrol larver blev behandlet med lige store koncentrationer af DMSO i embryo-medium.
- Overførsel larver med næsten fuldstændig hepatocyt ablation, der blev behandlet med 1,5% EtOH / 15 mM MTZ og frasorteret som førnævnte, til enten 96 brønde (indledende skærm) eller 24 brønde (gentest) plader forfyldt med embryo medium ved en densitet på 5 larver per brønd. Brug dobbelte brønde for hvert kemikalie.
- Fjern embryo medium og tilføje enten 250 pi (96-brønds plader) eller 500 pi (24-brønds plader) kemiske opløsninger til hver brønd. Dækplader med aluminiumsfolie og behandle larver til 50 timer ved 28 ° C. Undersøg kemisk-iblødsætning larver dagligt og fjerne eventuelle døde larver fra enkelte brønde.
- Ved slutningen af den kemiske behandling, observere antallet og / eller intensiteten af FFP-udtrykkende hepatocytter under en epifluorescensmikroskop med FFP filter ved en forstørrelse på 80X. Fotografi levende larver viser forstærkede eller reducered nummer og / eller intensitet af den fælles fiskeripolitiks udtrykker hepatocytter med et digitalt kamera til optegnelser.
- Bevar larver af formaldehyd fiksering for konfokal billeddannelse, som beskrevet i afsnit 5.
- For at genteste de kemikalier, der letter hepatocyt regenerering i det første skærmbillede, undersøge deres potens ved højere og lavere koncentrationer for at finde den mest effektive koncentration med de procedurer, der er beskrevet i 4.1-4.5 ( "fornyet prøvning«).
5. Larver zebrafisk Fiksering, Immunfarvning, og konfokal Imaging
- Bedøver larver ved tilsætning tricaine til en slutkoncentration på 0,02%. Overfør 10-15 larver til et 1,5 ml rør og vask en gang med phosphatbufret saltvand (PBS). Fjern PBS og tilsættes 1 ml frisk fremstillet 2% formaldehyd i PEM-puffer til at fastsætte O / N ved 4 ° C.
ADVARSEL: Formaldehyd forårsager irritation og er kendt for at være kræftfremkaldende hos mennesker. Håndtag i et stinkskab. - Kassér fikseringsopløsning korrekt og derefter wash 3 gange med PBS ved stuetemperatur. Fast larver kan holdes i PBS ved 4 ° C i op til flere dage. Går videre til næste skridt omgående giver bedre Immunofarvning resultater.
- Fjern forsigtigt æggeblomme og hud, der dækker leveren området ved hjælp af en # 55 pincet under et stereomikroskop.
- Permeabilisere og blokere larver i Block buffer (4% bovint serumalbumin og 0,3% Triton X-100 i PBS) O / N ved 4 ° C.
- Inkuber med kanin-anti-kollagen I antistof ved en fortynding på 1: 100 i Block buffer O / N ved 4 ° C. Vask 5 gange i 15 minutter hver med vaskebuffer (0,3% Triton X-100 i PBS).
- Inkuber med AlexaFluor 647 konjugeret æsel-anti-kanin-antistof i en fortynding på 1: 200 i Block buffer O / N ved 4 ° C. Vask 5 gange i 15 minutter hver med vaskebuffer. Vask derefter en gang med PBS.
- overføre forsigtigt larver til objektglas ved hjælp af et glas pipette, og orientere fast larver med venstre laterale side opad. Fjern overskydende PBS ved hjælp Kimwipes. Tilføj en dråbe montering medierOg sæl dækglas med neglelak. Gennemførelse konfokal imaging straks er stærkt anbefales.
- Brug en konfokal udstyret med en 40X / 1,3 olie linse til at tage billeder. Brug laser styrke ved 20-50%. Capture Z stack billeder ved 1 um intervaller.
6. Udarbejdelse af Adult Zebrafisk
- Opsætning parring af [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 voksne zebrafisk i parring tanke. Harvest embryoner næste morgen ved at belaste systemets vand og overførsel af embryoner i 100 mm petriskåle med embryo medium.
- Hold ikke mere end 100 embryoner pr petriskål. Under et stereomikroskop, fjerne ubefrugtede æg ved hjælp af et glas pipette. Grow embryoer ved 28 ° C og tilsæt PTU til en slutkoncentration på 0,003% efter 10 HPF at inhibere pigment udvikling.
- Ved 4 dpf, bruge tricaine at bedøve larver og sortere [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] larver. Skyl tricaine ved at skifte til friske embryo medium flere gange. Tillad larver at inddrive ved 28 ° C, indtil de opnår normal puls på 120-180 slag i minuttet 18.
- Hæv sorterede larver til 6-12 måneder gamle baseret på standard procedure 19.
7. Ethanol, Metronidazole behandling, og Liver Regeneration i Voksen Zebrafisk
- Overfør 6-12 måneder gammel [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] voksne zebrafisk til parring tanke ved hjælp af et net. Holde fisk ved en densitet på ikke mere end 10 fisk pr.
- Forbered frisk EtOH opløsning ved tilsætning EtOH i systemet vand til en slutkoncentration på 1%. Forkæl voksne fisk med 500 ml EtOH løsning i hver tank og vedligeholde dem i et 28 ° C inkubator.
- Overførsel voksne fisk til frisk EtOH løsning dagligt, discard døde fisk properly som en biologisk fare. Løbende behandler dyr i 72 timer før MTZ behandling.
- Forbered frisk 10 mM MTZ løsning i systemet vand i 0,1% DMSO. Pre-varme MTZ opløsning i en 28 ° C inkubator. Behandle fisk med 500 ml MTZ opløsning i 1 L passage beholder i 8 timer ved 28 ° C, beskyttet mod lys ved hjælp aluminiumsfolie.
- Overhold hver time under behandlingen og fjerne døde fisk med det samme. Kassér døde fisk ordentligt som en biologisk fare. I slutningen af MTZ behandling skylles MTZ ved at overføre dyr til frisk system, vand to gange.
- Tillad dyr at komme sig og fastholde dem i en inkubator ved 28 ° C. Foder og overføre fisk til frisk system, vand dagligt, indtil tidspunktet for analyser.
8. Voksen zebrafisk Liver Fiksering, Immunfarvning, og konfokal Imaging
- Bedøver voksne fisk med 0,02% tricaine og aflive i isvand i 15 min. Pat fisken tørre på et stykke køkkenrulle og læg den på en dissekere mat.
- Eksponere gastrointestinale organer ved at fjerne hud og muskler som tidligere beskrevet 20. Bruge en saks til at skære huden og underliggende muskel langs bugen fra gatfinne til operculum, og derefter bagtil langs siden af fisken tilbage til gatfinne.
- Sætte fisk i et 15 ml konisk rør og vaskes en gang med PBS. Fjern PBS og tilsættes 4 ml frisk fremstillet 2% formaldehyd i PEM-puffer til at fastsætte O / N ved 4 ° C.
- Kassér fikseringsopløsning ordentligt, og vask 3 gange med PBS ved stuetemperatur. Faste prøver kan opbevares i PBS ved 4 ° C i adskillige dage. Går videre til næste skridt med det samme giver bedre Immunofarvning resultater.
- Dissekere hele tarmen med leveren fra legemshulen af fisken ved at skære spiserøret. Integrer de gastrointestinale organer med 4% lavtsmeltende agarose i en sektionering støbeform.
- Brug en vibratome at skære prøverne i tværsnit ved 50 um intervaller i iskold PBS, begyndende fra den forreste ende. Overfør sektioner til 6-brønds plade med PBS under anvendelse af en # 1 pensel.
- Permeabilize og blokere sektioner i Block buffer O / N ved 4 ° C.
- Inkuber med kanin-anti-kollagen I antistof ved en fortynding på 1: 100 i Block buffer O / N ved 4 ° C. Vask 5 gange, 15 minutter hver med vaskebuffer.
- Inkuber med AlexaFluor 647 konjugeret æsel-anti-kanin-antistof i en fortynding på 1: 200 i Block buffer O / N ved 4 ° C. Vask 5 gange, 15 minutter hver med vaskebuffer og en gang med PBS.
- overføre forsigtigt sektioner til objektglas ved anvendelse af en # 1 malerpensel. Fjern overskydende PBS ved hjælp Kimwipes, tilføje en dråbe montering medier, og sæl dækglas med neglelak. Gennemførelse konfokal imaging straks meget foreslået.
- Brug en konfokal udstyret med en 40X / 1,3 olie linse til at tage billeder. Brug laser styrke ved 20-50%. Capture Z stack billeder ved 1 um intervaller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser udviklingen af en EtOH-induceret fibrotisk lever model i larvernes zebrafisk. For at optimere en protokol for at udsætte zebrafisk larver til EtOH, vi først vurderet EtOH toksicitet. 2,5 dage post-befrugtning (dpf) larver blev udsat for EtOH koncentration 1%, 1,5% eller 2% i 24 timer efterfulgt af en samtidig 24 hr EtOH / MTZ behandling. Udsættelse for 2% EtOH forårsagede høj dødelighed, mens næsten alle larver udsat for 1% EtOH eller mindre viste minimale fibrogene ændringer med sjældne aflejring af ekstracellulære matrix proteiner som collagen. Baseret på disse resultater, blev larverne forbehandlet med 1,5% EtOH i 24 timer (2,5-3,5 dpf) og derefter samtidigt behandlet med MTZ i 24 timer (3,5-4,5 DPF) (figur 1A). Den EtOH / MTZ-behandlede larver viste morfologiske abnormiteter, herunder opad krumning af stammen og hale, perikardiel ødem, og manglende puste svømmeblære. (Figur 1B). Vianvendt tre transgene linjer at analysere fibrogene ændringer i EtOH / MTZ-behandlede larval lever: 1) Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 linje udtrykker NTR genet fusioneret med cyan fluorescensprotein under hepatocyt-specifik fabp10a promotor 15; 2) Tg (Tp1: mCherry) jh11 linje markerer celler med aktiv Notch signalering (Notch-responsive celler, nationale referencecentre) eller biliære epithelceller (BECs) med nuklear mCherry 17, hvilken ekspression er under kontrol af den TP1 modul og omfattende multiple RBP- jk-bindingssteder; og 3) Tg (hand2: EGFP) pd24 linje, hvilke etiketter hepatiske stjerneformige celler (HSC'er) 13. DMSO-behandlede kontrol [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11, Tg (hand2: EGFP) pd24] lever viste ingen fibrillær type I collagen deposition 4,6,9 (figur 1C, C '), hvorimod EtOH / MTZ-behandlede lever viste forhøjede type I collagen akkumulation ved 25 og 50 timer post-ablation (HPA) (Figur 1D, D ', E, E'). Derudover sammenlignet med DMSO-behandlede kontrolgrupper lever (figur 1C ''), HSC'er steg i antal med ændret morfologi fra en stjernelignende konfiguration til en myofibroblastlignende form med tabt cytoplasmiske processer i EtOH / MTZ-behandlede regenererende lever ( Figur 1D '', E ''). Vi observerede to diskrete populationer af mCherry-udtrykkende nationale referencecentre på 25 hpa i EtOH / MTZ-behandlet regenererende lever: dim røde nationale referencecentre (Figur 1D '' ', indsatte, hvide pile) og lyse røde nationale referencecentre (Figur 1D' '', inset , gul pilehoveder). Ved 50 hpa, begyndte hepatocyt-specifik fælles fiskeripolitik til at co-express i nationale referencecentre med dim mCherry udtryk i hele regenererende lever (figur 1E '' ', nedfældning, hvide pile). Disse fælles fiskeripolitik og dim mCherry-coexpressing nationale referencecentre er åbenbart skelnes fra lyse røde nationale referencecentre, der er negative for den fælles fiskeripolitik (Figur 1E '' ', indeniliggende, gule pilespidser). Tidligere undersøgelser har vist, at når hepatocytproliferation blev undertrykt efter delvis hepatektomi (PHX), HPCs udvidet med samtidig spredning af HSC'er 21. Derudover HPCs og BECs delte histokemiske markører 22. Derfor vores resultater tyder på, at den fælles fiskeripolitik og dim mCherry co-udtrykkende nationale referencecentre skildre en zebrafisk-modstykke til HPCs der differentierer til hepatocytter ved at støde Notch nedregulering. NRCS opretholde højere Notch signalering kan forblive som cholangiocytes, som er differentierede BECs 23.
Figur 2 viser udviklingen af en EtOH-induceret fibrotisk lever model i voksne zebrafisk. Først udsatte vi voksne zebrafisk til 1%, 1,5% eller 2% EtOH for at vurdere levedygtigheden. De fleste voksne zebrafisk gjorde not overlever mere end 72 timer for eksponering for EtOH koncentrationer større end 1% (upublicerede data). Derfor, for voksne zebrafisk, vi forbehandlet fisken med 1% EtOH i 72 timer og fulgte med MTZ behandling (figur 2A). Ved at udføre tidsforløb analyser viste vi signifikant forhøjet type I collagen deposition i EtOH / MTZ-behandlede regenererende lever ved 2, 3, og 4 dage post-ablation (dpa) (figur 2C ', D', E ') sammenlignet med DMSO-behandlede lever (figur 2B). Ligner der er observeret i larverne, blev den fælles fiskeripolitik og dim mCherry co-udtrykkende celler påvist i EtOH / MTZ-behandlede regenererende lever fra 12 måneder gamle [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] voksne fisk på 3 og 4 dpa (figur 2D, E, inlays, hvide pile). Disse data viser, at HPC'er, der reagerer på Notch signalering, opretholde deres evne til at regenerere som hepatocytter intilstedeværelsen af fibrogene insult i voksen zebrafisk.
Figur 3 viser de repræsentative kemiske screening resultater ved hjælp af vores ethanol-induceret fibrotisk lever model i larvernes zebrafisk. For at lokalisere bioaktive forbindelser, der fremskynder hepatocyt regenerering i fibrotisk leveren, vi udførte kemiske genetiske skærme. Vi screenede et bibliotek på 75 små molekyler med velkarakteriserede biologiske og farmaceutiske aktiviteter (Stem Cell Signaling Forbindelse Bibliotek, Selleckchem) og et bibliotek på 1.000 ugunstigt karakteriseret små molekyler (ActiProbe-1K Bibliotek, TimTec) ved hjælp af [Tg (fabp10a: CFP -NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] larver. Vi ablateret hepatocytterne i nærvær af 1,5% EtOH / 15 mM MTZ og derefter udsat larverne til 50 pM af forbindelserne for 50 timer (figur 3A). En række Wnt agonister, såsom SB 415.286 og CHIR-99021, inhibitorer af glycogensyntasekinase-3, fremmes hepatocyt regenerering (figur 3C, D) sammenlignet med DMSO (figur 3B). Endvidere [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-yl) -1,2,5-oxadiazol-3-ylamin], forkortet HTOA, et hidtil ukendt Wnt pathway aktivator, forstærket hepatocyt regenerering i den fibrotiske leveren som angivet ved større regenereret lever (figur 3E). Disse data antyder, at vores vedvarende fibrotisk model giver et uvurderligt værktøj til at opdage små molekyler, der forbedrer hepatocyt regenerering.
Figur 1. Udvikling af en ethanol-induceret fibrotisk lever model i larver zebrafisk. (A) Ordning illustrerer de perioder af EtOH og EtOH / MTZ behandling for at etablere en fibrotisk lever model i larver. (B) ved 50 timer post-ablation (HPA), EtOH / MTZ-behandlede lArval zebrafisk udviklede morfologiske abnormiteter, herunder opad krumning af stammen og hale, perikardiel ødem, og manglende oppuste svømmeblære. (CC '' ') I de lever fra [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11, Tg (hand2: EGFP) pd24] larver behandlet med DMSO, ECM protein kollagen 1a var næsten ikke målbart (C, C ') og rolige HSC'er viste en stjerne-lignende konfiguration (C' '), hvorimod nationale referencecentre fordelt blandt hepatocytter (C, C '' ', indsat). (DE '' ') I de lever fra EtOH / MTZ-behandlede larver blev forhøjet kollagen 1a deposition observeret (D, D', E, E '). HSC'er steget i antal og tabte komplekse cytoplasmatiske processer (D '', E ''). Ved 25 hPa er mCherry-udtrykkende referencecentre sammensat af to forskellige populationer. Gule pilespidser indikerer lyse røde nationale referencecentre (D '' ', indsat), mens hvide pile angiver dim rødt nationale referencecentre (D' '', indsat). Ved 50 hpa, Tg (fabp10a: CFP-NTR) og Tg (Tp1: mCherry) co-udtrykkende celler begyndte at opstå gennem de regenererende lever (E '' ', indsatte, hvide pile), mens de lyse røde nationale referencecentre ikke havde nogen fælles fiskeripolitik udtryk (E '' ', indpresningsdybde, gule pilespidser). Alle konfokale billeder er enkelt plane billeder undtagen C '', D '', E '', som er projektion billeder. Scale barer: B, 100 um; CE '' ', 20 pm. EtOH, ethanol; MTZ, metronidazol; hpa, time-post-ablation; dpf, dag-post-befrugtning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Udvikling af en ethanol-induceret fibrotisk lever model hos voksne zebrafisk. (A) Ordning illustrerer de perioder af EtOH og MTZ behandling for etablering af en fibrotisk lever model voksen. (BE) Tg (fabp10a: CFP-NTR), Tg (Tp1: mCherry), og kollagen 1a udtryk i Vibratome sektioner af DMSO (B og B ') og EtOH / MTZ-behandlet (CE) voksne zebrafisk lever. (BB) I de DMSO-behandlede kontroller, collagen 1a var næsten ikke målbart (B ') uden Tg (fabp10a: CFP-NTR) og Tg (Tp1: mCherry) co-udtrykkende celler (B). (CE) I EtOH / MTZ-behandlet regenererende lever, blev collagen 1a aflejring markant forhøjet ved 2, 3, og 4 dpa (C ', D', E ') med enpopulation af Tg (fabp10a: CFP-NTR) og Tg (Tp1: mCherry) co-udtrykkende celler ved 3 og 4 dpa (D, E, mellemværker, hvide pile). De lyse røde nationale referencecentre ikke havde nogen fælles fiskeripolitik udtryk (D, E, mellemværker, gule pilespidser). BE, konfokal enkelt plane billeder. B'-E ', konfokal projektion billeder. Scale bar, 20 pm. EtOH, ethanol; MTZ, metronidazol; dpa, dage post-ablation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Repræsentative kemisk screening resultater ved hjælp af ethanol-inducerede fibrotisk lever model i larver zebrafisk. (A) Ordning for hepatocyt regenerering skærmen i fibrøse leveren. (BE) Kendte og nye Wntaktivatorer forøge hepatocyt regenerering i den fibrotiske leveren. Konfokale fremskrivninger af EtOH / MTZ-behandlede lever i [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1, Tg (Tp1: mCherry) jh11] larver, der blev administreret med DMSO (B), SB415286 (C), CHIR-99.021 ( D), eller en hidtil ukendt Wnt aktivator [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-yl) -1,2,5-oxadiazol-3-ylamin] (forkortet som HTOA) (E). SB415286 og CHIR-99.021 er glycogensyntasekinase-3-inhibitorer. Alle billeder er konfokale projektion billeder. Scale bar, 20 pm. EtOH, ethanol; MTZ, metronidazol; hpa, time-post-ablation; dpf, dag-post-befrugtning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi observerede HPC-medieret hepatocyt regenerering i EtOH / MTZ-behandlede genvinder lever, hvilket tyder på, at selv under tilstedeværelse af væsentlig mængde ECM-proteiner, herunder fibrillære type I collagen, de HPC'er bevarer deres kompetence til at regenerere som hepatocytter. Det MTZ kun behandling steg ikke aflejring af ECM-proteiner betydeligt, mens EtOH eneste behandling ikke inducerede HPC aktivering 15. Ved at udnytte den kombinerede EtOH / MTZ behandling, var vi i stand til at undersøge HPC-drevet regenerering i fibrøse leveren. Som næsten fuldstændig afskaffelse af hepatocyt fremkalder HPC-drevet hepatocyt regenerering, er det afgørende at sortere ud MTZ-behandlet larver baseret på kriterierne i fravær af hepatocyt-specifik fluorescens og væsentligt reduceret levervolumen med klynger nationale referencecentre. I fisk, blodkarrene i gill og huden absorbere alkoholen 24, således at der ikke er behov for at tillade, at dyr at drikke ad libitum eller kræve intragastric infusion som i mammale modeller. Vi husede EtOH- og efterfølgende MTZ-behandlede voksne fisk i separate tanke uden at cirkulere vandet. Det er vigtigt at overføre fisk til frisk EtOH opløsning dagligt og holde låget på at minimere fordampning af EtOH. Selvom 48-72 timers EtOH / MTZ behandling effektivt inducerer ECM proteinsyntese i vore protokoller, har hverken fremskreden fibrose eller cirrose er udviklet i disse fisk. Derfor kombination af MTZ med langvarig udsættelse af ethanol som 12 ugers behandling 14, specifikt i voksne fisk kan fremkalde mere alvorlige leverskader til korrekt simulere og afhøre HPC-drevet regenerering i kronisk leversvigt.
Zebrafisk tjener som en fremragende dyremodel til in vivo Ved afprøvning på grund af sin lille størrelse, stor afkom, gennemsigtighed, og permeabilitet til små molekyler 25. Brug af fibrotisk leveren model i zebrafisk, identificerede vi en række kendte og roman Wnt Acti, iværksættere og Notch inhibitorer, der accelererede hepatocyt regenerering 15. Vores nuværende fluorescens-baserede kemiske screening protokol består af flere trin alle udføres manuelt herunder udarbejdelse af kemikalier, overføre EtOH-behandlet / hepatocyt-ablateret larver til plader med 24 brønde, behandling kemikalier, og analyse af virkningerne af kemikalier på hepatocyt regenerering. Den beskæftiger specifikt epifluorescens og / eller konfokalt mikroskop til at tage billeder for individuelt dyr, som er besværlig og tidskrævende. High-throughput platforme, der automatisk håndterer og erhverve cellulære opløsning billeddannelse af zebrafisk i kombination med kvantitative dataindsamling vil lette storstilet screening 26,27 .Disse funktioner vil blive styrket, hvis de kombineres med automatiseret stof doseringssystem, der bestemmer række kemiske koncentrationer 28, som kan give minimal toksicitet med maksimal effektivitet til forøgelse hepatocyt regenerering. Trods disse egrænsningertioner, som mange kritiske spillere og væsentligste celletyper i leveren er konserveret mellem zebrafisk og pattedyr 29, under anvendelse af den in vivo -baserede lille molekyle screening ved hjælp af zebrafisk fibrotiske leveren model vil katalysere gyldig opdagelse af hidtil ukendte terapeutiske strategier for kronisk leversygdom.
To yderligere grupper uafhængigt har vist, at efter næsten totale tab af hepatocytter uden fibrogene fornærmelser, BECs transdifferentiated i hepatocyt gennem et trin af dedifferentiering 30,31 med den antagelse, at cholangiocytes, fuldt differentierede Wien, omfatter primært NRC / BECs i zebrafisk. Selvom transdifferentiering kan være en af de mekanismer for kørsel hepatocyt regenerering, vore resultater indikerer, at HPC'er, som vides at udgøre hovedparten af BECs i zebrafisk leveren 32, nedregulerer Notch aktivitet til at differentiere til hepatocytter. I mellemtiden er det plausibelt at spekulere, at the fuldt differentierede BECs, cholangiocytes, vedligeholde højere Notch aktivitet uden at konvertere til hepatocytter under regenerering. Interessant nok i nærvær af EtOH, som tidligere rapporteret 13, fandt vi, at HSC'er steg i antal med ændret morfologi fra en stjernelignende konfiguration til en myofibroblastlignende form med tabt cytoplasmiske processer. De aktiverede HSC'er karakteriseret ved syntese af ECM-proteiner er princippet synderen ansvarlig for unormal sårheling under den integrerede proces med leveren reparation 4. Selvom kronisk skade ofte tilsidesætter leverens bemærkelsesværdig evne til regenerering, transplanteret HPCs held genopbyggede den fibrotiske / cirrhotisk rottelever 33. Derfor vil vores zebrafisk fibrøs lever model være et vigtigt redskab til at belyse de molekylære og cellulære mekanismer, der medierer effekten af vedvarende fibrose på HPC-medieret hepatocyt regenerering. Endvidere definerer flercellede crosstalk der balancerer regenerering og fibrose ved at udnytte vores zebrafisk fibrøs lever model vil yderligere lette at designe bæredygtige terapeutiske strategier for kronisk leversvigt in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra GTEC (2731336 og 1411318), NIH (K01DK081351), og NSF (1.354.837) til CHS Vi takker Alem Giorgis for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K.
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L.
- Bataller, R., Brenner, D. A.
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P.
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
