Introduction
Nonostante la notevole capacità di rigenerazione degli epatociti 1, che sono il principale tipo di cellule parenchimali del fegato, insufficienza epatica cronica altera questa capacità, portando a cellule progenitrici epatiche (HPC) -dipendente rigenerazione 2.
Danni al fegato cronica è derivato principalmente da abuso di alcool, cronica da virus dell'epatite C (HCV) 3 e steatosi epatica non alcolica (NAFLD) 4. Si porta a fibrosi epatica sostenuta, che è associato con l'accumulo di matrice extracellulare (ECM) proteine. Accumulo ECM Persistendo distorce architettura epatica intatta formando un tessuto cicatriziale fibroso 5, successivamente, con conseguente cirrosi con alta morbilità e mortalità. Molti tentativi sono stati fatti per mitigare la risposta fibrotica soprattutto concentrandosi su inibendo citochine profibrogenic e miofibroblasti attivati 6. Quest'ultimo deriva principalmente dalle cellule stellate epatiche (HSC), le cellule non parenchimali epatiche principali responsabili della formazione della cicatrice fegato 4. Tuttavia, terapie rigenerative che stimolano fonti endogene cellulari tra cui HPC per rigenerare epatociti in presenza di insulti fibrogeniche sostenuti attendono ulteriori indagini.
Molti modelli sperimentali di fibrosi epatica sono stati descritti nei mammiferi. Iniezione ripetitiva di tetracloruro di carbonio (CCL 4) è stato ampiamente utilizzato per indurre la fibrosi epatica in murine e ratto modelli 7. In combinazione con una dieta ad alto contenuto di grassi (HF), l'alcol ha portato ad una sostanziale upregulation dell'espressione genica profibrogenic e fibrosi epatica 8. Mentre steatosi (accumulo di lipidi) risulta dall'esposizione alcol acuta, rende il fegato suscettibile di più grave danno epatico 9.
Il zebrafish, Danio rerio, è emerso come un prezioso sistema modello per lo studio dei vertebrati la rigenerazione. Anche sealtri vertebrati inferiori, come tritoni e Axolotl hanno una notevole capacità di rigenerazione, il pesce zebra ha vantaggi rispetto ad altri sistemi modello per quanto riguarda la manipolazione genetica e la visualizzazione strategie necessarie per manipolare i fattori di potenziale rigenerativo 10. Il pesce zebra rappresenta anche un modello vertebrato interessante per lo studio della malattia epatica alcolica (ALD) con la semplice aggiunta di etanolo (EtOH) per la loro acqua. L'esposizione acuta EtOH di zebrafish larvale e adulto causato steatosi epatica 11-13. Quando zebrafish adulto ha ricevuto l'esposizione prolungata EtOH, deposizione di collagene è stata osservata con up-regulation dei geni fibrosi correlati 14. Tuttavia, esiste la necessità di sviluppare modelli per studiare rigenerazione epatica in risposta ad EtOH come stimolo fibrogenico.
Recentemente, abbiamo sviluppato un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish 15. Abbiamo combinato un sistema di ablazione genetica specifica-epatociti con il trattamento EtOH in larvale e Adult zebrafish. Abbiamo generato due linee transgeniche, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 e Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, in cui E.coli nitroreduttasi (NTR) si fondono al ciano e proteina fluorescente mCherry, rispettivamente sotto il controllo dell'acido grasso specifico epatociti legame 10a proteine, fegato base (fabp10a) promotore. In questo sistema, NTR converte un metronidazolo profarmaco non tossico (MTZ) in un DNA inter-strand reticolante 16, inducendo la morte esplicita di epatociti. Utilizzando questo modello, abbiamo dimostrato che una popolazione di cellule epatiche, che sono sensibili alle segnalazione Notch, convertito in epatociti nella quasi totale assenza di epatociti e l'eccesso di ECM. Designiamo queste cellule come HPC. Inoltre, attraverso schermi chimici, abbiamo identificato piccoli attivatori molecola di segnalazione Wnt e inibitori di Notch che aumentano la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico. therefori, il nostro modello di fegato fibrotico in zebrafish rappresenta un eccellente sistema di screening chimico rispetto alla cultura- cellulare o sistema di screening dei mammiferi-based. Si tratta di un sistema in vivo con in termini di costi e benefici significativi di risparmio di tempo. Qui si descrivono le procedure dettagliate per la creazione di un modello di fegato fibrotico EtOH-indotta e per l'esecuzione di schermi chimici che utilizzano questo modello in zebrafish. Inoltre, le analisi tempo-corso sono stati effettuati per studiare come epatociti rigenerazione avviene nel fegato fibrotico. Questo protocollo fornirà uno strumento prezioso per studiare i meccanismi e le strategie per potenziare la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico.
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Protocol
Zebrafish sono state sollevate e cresciuto utilizzando un protocollo standard che soddisfa i criteri del National Institutes of Health e approvati dal Georgia Institute of Technology Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.
1. preparazione di soluzioni
- Preparare acqua uovo 20 L (intercambiabile usato con 'media embrione') per mantenere embrionale zebrafish / larvale. Sciogliere 1,5 g CaSO 4 e 6 g oceano istante sale marino in 250 ml di acqua distillata. Versare in una damigiana piena di 20 L di acqua distillata e agitare.
- Preparare 1 L soluzione di 1-fenil-2-tiourea (PTU) stock (20x). Sciogliere 0,6 g di polvere in 1 PTU acqua distillata L. Aggiungere 1 ml di soluzione madre per 20 ml di mezzo embrione ad una concentrazione finale di 0,003% in una soluzione di lavoro.
ATTENZIONE: PTU può causare tossicità sistemica a seguito di inalazione o l'esposizione cutanea. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate. - Preparare 1 L etil 3-aminobenzoate soluzione madre metanosolfonato (Tricaine) (20x). Sciogliere 4 g di polvere Tricaine in acqua distillata. Aggiustare il pH a 7 con l'aggiunta di 1 M Tris (pH 9), e portare il volume finale a 1 L con acqua distillata. Aliquota in 50 ml e conservare a -20 ° C. Scongelare prima dell'uso.
ATTENZIONE: Tricaine può indurre una perdita di sensibilità. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate. - Preparare 100 larvale metronidazolo (MTZ) soluzione di lavoro ml. Fare fresco 15 mM soluzione MTZ sciogliendo 0,25 g di polvere MTZ nello 0,1% dimetilsolfossido (DMSO) in 100 ml di mezzo embrione. Sciogliere MTZ polvere completamente di agitazione vigorosa. Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica di MTZ.
ATTENZIONE: MTZ può causare irritazione. Preparare e utilizzare in conformità con le linee guida di gestione appropriate. - Preparare 100 ml di soluzione di lavoro larvale etanolo / metronidazolo (EtOH / MTZ). Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare fotocatalitico degradazione di MTZ. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 100% in 100 ml di soluzione MTZ ad una concentrazione finale di 1,5% al momento dell'uso.
- Preparare 500 ml di soluzione di lavoro degli adulti MTZ. Fare fresco 10 mM soluzione MTZ sciogliendo 0,83 g di polvere MTZ nello 0,1% DMSO in 500 ml di acqua del sistema. Sciogliere MTZ polvere completamente di agitazione vigorosa. Fai la soluzione fresca MTZ e utilizzare un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica di MTZ.
- Preparare 1 L PEM tampone. Sciogliere 30.2 g TUBI, 0,74 g EGTA, e 0,12 g MgSO 4 in acqua distillata. Regolare il pH a 7 con NaOH. Portare il volume finale a 1 L con acqua distillata.
2. Preparazione di larve Zebrafish
- Impostare l'accoppiamento di [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulto con Tg (hand2: EGFP) PD24 13 zebrafish adulto in serbatoi di accoppiamento. Utilizzare divisori per condurre l'accoppiamento a tempo.
- Rimuovere il divider la mattina seguente e permettono di pesce per accoppiarsi senza interruzioni. embrioni Harvest 2 ore più tardi da sforzare l'acqua del sistema e trasferire gli embrioni in 100 mm piastre di Petri con terreno di embrione.
- Mantenere non più di 100 embrioni per piastra di Petri. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere uova non fecondate utilizzando una pipetta di vetro. Crescere embrioni a 28 ° C e aggiungere feniltiourea (PTU) ad una concentrazione finale di 0,003% dopo 10 ore di post-fecondazione (HPF) per inibire lo sviluppo del pigmento.
3. L'etanolo, Trattamento metronidazolo e fegato Rigenerazione in larvali Zebrafish
- Preparare la soluzione EtOH fresca aggiungendo etanolo in un mezzo embrione ad una concentrazione finale di 1,5%. Non aggiungere PTU.
- Trattare embrioni con 20 ml di soluzione di etanolo per ogni capsula di Petri 56-80 HPF. Coprire piastre di Petri con pellicola trasparente per evitare l'evaporazione di etanolo.
- Classificare [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) PD24] larve con dimensioni del fegato simile, come determinato da espressione CFP, a 80 HPF. Non utilizzare Tricaine durante l'ordinamento le larve EtOH-trattati, perché questo farà sì alto tasso di mortalità, con successivo trattamento EtOH / MTZ. Mantenere le larve ordinato con una densità di 30 embrioni per piastra di Petri.
- Preparare fresco 15 mm MTZ nel medio embrione nello 0,1% DMSO. Aggiungere corretta quantità di EtOH in soluzione MTZ fare una concentrazione finale di 1,5%. Incubare le larve in 20 ml di soluzione EtOH / MTZ per capsula di Petri per 24 ore a 28 ° C. Coprire piastre di Petri con involucro di plastica per mantenere la concentrazione EtOH e con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
- Alla fine del trattamento, rimuovere la soluzione EtOH / MTZ trasferendo larve di nuove piastre Petri con terreno fresco embrione. Lavare le larve 3 volte con media embrione e tenerli in 20 ml di mezzo embrione senza PTU.
- Per risolvere le larve con quasi completa ablazione della epatociti, osservare la fluorescenzasotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro PCP con un ingrandimento di 80X. risultati ablazione di successo in minima fluorescenza PCP nel fegato e volume del fegato significativamente ridotto.
- Per evitare la morte delle larve EtOH / MTZ-trattati, non utilizzare Tricaine per l'ordinamento. Fissare le larve per immunocolorazione (vedere la sezione 5) o tenere larve ordinati in piastre di Petri a 28 ° C per ulteriori analisi.
4. Schermi chimici in EtOH / MTZ-trattati larvale Zebrafish
- Portare le piastre a 96 pozzetti contenenti 10 mM scorte chimiche in DMSO (consultare l'elenco dei materiali per i dettagli delle librerie chimiche commerciali) dal -80 ° C freezer. Coprire con un foglio di alluminio per evitare la degradazione fotocatalitica dei prodotti chimici. Scongelare soluzioni madre a temperatura ambiente con dolce dondolio.
- Preparare soluzioni chimiche diluendo 10 soluzioni madri mm con medio embrione ad una concentrazione finale di 50 micron (in 96 pozzetti: s inizialicreen; in provette da 1,5 ml: nuovo test). larve di controllo sono stati trattati con uguali concentrazioni di DMSO in media embrione.
- Trasferimento larve con quasi completa ablazione epatociti, che sono stati trattati con 1,5% EtOH / 15 mm MTZ e allineati secondo quanto sopra indicato, a uno a 96 pozzetti (schermata iniziale) o 24 pozzetti (ripetere il test) piastre preriempite con media embrione ad una densità di 5 larve per bene. Utilizzare pozzetti in duplicato per ogni sostanza chimica.
- Rimuovere media embrione e aggiungere o 250 ml (piastre a 96 pozzetti) o 500 ml (24 pozzetti) soluzioni chimiche in ciascun pozzetto. piastre di copertura con un foglio di alluminio e trattare le larve per 50 ore a 28 ° C. Ispezionare larve chimico-immersione quotidiana e rimuovere eventuali larve morte da singoli pozzi.
- Alla fine del trattamento chimico, osservare il numero e / o intensità di epatociti CFP-esprimono sotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro PCP con un ingrandimento di 80X. Fotografia dal vivo che mostra larve migliorata o ridurreil numero d e / o intensità di epatociti PCP che esprimono con una macchina fotografica digitale per i record.
- Conserva le larve da formaldeide fissazione per l'imaging confocale come descritto nella sezione 5.
- Per testare nuovamente i prodotti chimici che facilitano la rigenerazione degli epatociti nella schermata iniziale, esaminare la loro efficacia a concentrazioni superiori e inferiori per trovare la concentrazione più efficace con le procedure descritte nel 4,1-4,5 ( 'nuovo test').
5. larvale Zebrafish Fixation, Immunocolorazione, e confocale Imaging
- Anestetizzare larve aggiungendo Tricaine ad una concentrazione finale di 0,02%. Trasferire 10-15 larve in una provetta da 1,5 ml e lavare una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di preparati al momento 2% di formaldeide in tampone PEM di risolvere O / N a 4 ° C.
ATTENZIONE: La formaldeide provoca irritazione ed è noto per essere cancerogeno per l'uomo. Maneggiare in una cappa. - Scartare il fissaggio soluzione correttamente e poi wash 3 volte con PBS a temperatura ambiente. larve fisso può essere conservato in PBS a 4 ° C fino a diversi giorni. Di procedere alla fase successiva dà subito risultati migliori immunocolorazione.
- Rimuovere con attenzione il tuorlo e la pelle che copre la zona del fegato utilizzando una pinza # 55 allo stereomicroscopio.
- Permeabilize e blocco larve nel Blocco tampone (4% di siero albumina bovina e 0,3% Triton X-100 in PBS) O / N a 4 ° C.
- Incubare con coniglio anti-collagene I anticorpi alla diluizione di 1: 100 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte per 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio (0,3% Triton X-100 in PBS).
- Incubare con AlexaFluor 647 coniugato asino anticorpi anti-coniglio alla diluizione di 1: 200 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte per 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio. Quindi lavare una volta con PBS.
- Delicatamente trasferire le larve di vetrini utilizzando una pipetta di vetro, e orientare le larve fissato con il lato laterale sinistro rivolto verso l'alto. Rimuovere l'eccesso di PBS usando Kimwipes. Aggiungere una goccia di mezzi di montaggioE vetro di copertura di tenuta con smalto. Condurre confocale immediatamente è fortemente raccomandato.
- Utilizzare un sistema confocale dotata di un obiettivo 40X / 1.3 olio per catturare le immagini. Usare la forza del laser al 20-50%. Catturare immagini dello stack Z a intervalli di 1 micron.
6. Preparazione di Zebrafish adulti
- Impostare l'accoppiamento di [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 zebrafish adulto in serbatoi di accoppiamento. Harvest embrioni la mattina seguente da sforzare l'acqua del sistema e trasferire gli embrioni in 100 mm piastre di Petri con terreno di embrione.
- Mantenere non più di 100 embrioni per piastra di Petri. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere uova non fecondate utilizzando una pipetta di vetro. Crescere embrioni a 28 ° C e aggiungere PTU ad una concentrazione finale di 0,003% dopo 10 HPF per inibire lo sviluppo del pigmento.
- A 4 dpf, usare Tricaine per anestetizzare le larve e risolvere [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larve. Lavare Tricaine passando a nuove embrione medio più volte. Lasciare che le larve di recuperare a 28 ° C fino a raggiungere la frequenza cardiaca normale di 120-180 battiti al minuto 18.
- Sollevare larve ordinato per 6-12 mesi in base alla procedura standard 19.
7. L'etanolo, Trattamento Metronidazolo, e fegato Rigenerazione in Zebrafish adulti
- Trasferire 6-12 mesi di età [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] adulto zebrafish ai serbatoi di accoppiamento con una rete. Mantenere pesci ad una densità non superiore a 10 pesci per vasca.
- Preparare la soluzione EtOH fresca aggiungendo EtOH in acqua sistema a una concentrazione finale di 1%. Trattare pesci adulti con 500 ml di soluzione di EtOH in ogni serbatoio e mantenerli in un incubatore a 28 °.
- pesce Trasferimento adulto per soluzione EtOH fresco tutti i giorni, degli scarti prop pesci mortirettamente come un rischio biologico. Continuamente trattare gli animali per 72 ore prima del trattamento MTZ.
- Preparare fresco soluzione 10 mM MTZ in acqua sistema in 0.1% DMSO. Pre-riscaldare la soluzione MTZ in un incubatore a 28 °. Trattare pesce con 500 ml di soluzione MTZ in 1 L Serbatoio di passaggio per 8 ore a 28 ° C, al riparo dalla luce con un foglio di alluminio.
- Osservare ogni ora durante il trattamento e rimuovere immediatamente pesci morti. Scartare pesci morti correttamente come un rischio biologico. Alla fine del trattamento MTZ, lavare MTZ trasferendo animali all'acqua sistema fresco due volte.
- Consentire agli animali di recuperare e mantenerli in un incubatore a 28 ° C. Mangimi e trasferire i pesci di acqua sistema fresca tutti i giorni fino al punto di tempo per le analisi.
8. Zebrafish adulti Fegato Fixation, Immunocolorazione, e confocale Imaging
- Anestetizzare il pesce adulto con 0,02% Tricaine e euthanize in acqua ghiacciata per 15 minuti. Pat secco pesce su un tovagliolo di carta e posizionarlo su una stuoia di dissezione.
- Esporre organi gastrointestinali, eliminando la pelle e muscoli come descritto in precedenza 20. Utilizzare forbici per tagliare la pelle e muscolo sottostante lungo il ventre dalla pinna anale alla opercolo, e quindi posteriormente lungo il lato del pesce torna alla pinna anale.
- Mettete il pesce in un tubo da 15 ml e lavare una volta con PBS. Rimuovere PBS e aggiungere 4 ml di preparati al momento 2% di formaldeide in tampone PEM di risolvere O / N a 4 ° C.
- Scartare fissa soluzione correttamente, e lavare 3 volte con PBS a temperatura ambiente. campioni fissi possono essere tenuti in PBS a 4 ° C per diversi giorni. Di procedere alla fase successiva dà subito risultati migliori immunocolorazione.
- Sezionare l'intero intestino con fegato dalla cavità corpo del pesce tagliando l'esofago. Incorporare gli organi gastrointestinali con 4% a basso punto di fusione agarosio in uno stampo di sezionamento.
- Utilizzare un vibratome per tagliare campioni in sezioni trasversali a 50 micron intervalli in ghiaccio PBS freddo, a partire dall'estremità anteriore. Trasferimento seczioni a 6 pozzetti con PBS utilizzando un pennello # 1.
- Permeabilize e le sezioni di blocco in blocco buffer di O / N a 4 ° C.
- Incubare con coniglio anti-collagene I anticorpi alla diluizione di 1: 100 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte, 15 minuti ciascuno con tampone di lavaggio.
- Incubare con AlexaFluor 647 coniugato asino anticorpi anti-coniglio alla diluizione di 1: 200 nel Blocco buffer di O / N a 4 ° C. Lavare 5 volte, 15 min ciascuno con tampone di lavaggio e una volta con PBS.
- trasferire delicatamente sezioni per vetrini utilizzando un pennello # 1. Rimuovere l'eccesso di PBS utilizzando Kimwipes, aggiungere una goccia di mezzi di montaggio e vetro di copertura di tenuta con smalto. Condurre confocale immediatamente è altamente consigliato.
- Utilizzare un sistema confocale dotata di un obiettivo 40X / 1.3 olio per catturare le immagini. Usare la forza del laser al 20-50%. Catturare immagini dello stack Z a intervalli di 1 micron.
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Representative Results
La figura 1 mostra lo sviluppo di un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish larvale. Per ottimizzare un protocollo per esporre le larve zebrafish di EtOH, in primo luogo abbiamo valutato la tossicità EtOH. 2,5 giorni post-fecondazione (DPF) larve sono stati esposti a concentrazioni EtOH 1%, 1,5%, o del 2% per 24 ore seguita da una 24 ore EtOH trattamento concomitante / MTZ. L'esposizione al 2% EtOH causato alto tasso di mortalità, mentre quasi tutte le larve esposto a 1% EtOH o meno hanno mostrato variazioni minime fibrogeniche con rara deposizione di proteine della matrice extracellulare come il collagene. Sulla base di questi risultati, le larve sono stati pretrattati con 1,5% EtOH per 24 ore (2,5-3,5 dpf) e poi contemporaneamente trattati con MTZ per 24 ore (3,5-4,5 DPF) (Figura 1A). Le larve EtOH / MTZ-trattati hanno mostrato anomalie morfologiche tra cui la curvatura verso l'alto del tronco e della coda, edema pericardico, e il fallimento per gonfiare vescica natatoria. (Figura 1B). Noiutilizzato tre linee transgeniche per analizzare i cambiamenti fibrogeniche nel fegato larvali EtOH / MTZ-trattati: 1) Tg (fabp10a: CFP-NTR) Linea GT1 esprime il gene NTR fuso con la proteina ciano fluorescente sotto la specifica-epatociti fabp10a promotore 15; 2) Tg (TP1: mCherry) Linea jh11 segna cellule con segnalazione attiva Notch (cellule Notch-reattiva, NRC) o cellule epiteliali biliari (BEC) con mCherry nucleare 17, che l'espressione è sotto il controllo del modulo TP1 contenente RBP- multipla siti di JK-vincolante; e 3) Tg (hand2: EGFP) Linea PD24, che le etichette cellule stellate epatiche (CSE) 13. Controllo DMSO trattato [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) PD24] fegato non ha mostrato alcun tipo fibrillare collagene deposizione 4,6,9 (Figura 1C, C '), mentre EtOH / MTFegati Z-trattati visualizzati tipo elevata collagene accumulo a 25 e 50 ore post-ablazione (hpa) (Figura 1D, D ', E, E'). Inoltre, rispetto ai fegati controllo DMSO-trattate (Figura 1C ''), CSE aumentata in numero con morfologia alterata da una configurazione a stella ad una forma miofibroblasti simile con processi citoplasmatici persi nel fegato rigeneranti EtOH / MTZ trattato ( Figura 1D '', E ''). Abbiamo osservato due popolazioni distinte di NRC mCherry-esprimono a 25 hpa nel fegato rigenerante EtOH / MTZ-trattati: dim NRC rosso (Figura 1D '' ', inserto, frecce bianche) e luminose NRC rossi (Figura 1D' '', inserto , punte di freccia di colore giallo). A 50 hpa, epatociti specifico CFP ha iniziato a co-express in NRC con l'espressione mCherry dim tutto i fegatini rigeneranti (Figura 1E '' ', inserto, frecce bianche). Questi PCP e dim mCherry-coexpreNRC ssing sono evidentemente distinguibili da NRC rosso brillante che sono negativi per la PCP (Figura 1E '' ', inserto, punte di freccia di colore giallo). Precedenti studi hanno dimostrato che, quando la proliferazione degli epatociti è stata soppressa dopo epatectomia parziale (PHx), HPC ampliata con la proliferazione concomitante di CSE 21. Inoltre, le HPC e BEC condivisi marcatori istochimiche 22. Quindi, i nostri risultati indicano che i NRC co-esprimono PCP e fioca mCherry ritraggono un zebrafish-controparte di HPC che si differenziano in epatociti incontrando Notch downregulation. I NRC mantenendo alti livelli di segnale di Notch possono rimanere come colangiociti, che sono differenziate BEC 23.
La Figura 2 mostra lo sviluppo di un modello di fegato fibrotico EtOH indotta in zebrafish adulti. In primo luogo, abbiamo esposto zebrafish adulto per 1%, 1,5%, o 2% EtOH per valutare la vitalità. La maggior parte zebrafish adulti ha fatto not sopravvive più di 72 ore di esposizione a concentrazioni EtOH superiore all'1% (dati non pubblicati). Pertanto, per zebrafish adulti, abbiamo pretrattato il pesce con 1% EtOH per 72 ore e seguito con trattamento MTZ (Figura 2A). Eseguendo analisi tempo-corso, abbiamo mostrato tipo significativamente elevata collagene deposizione nel fegato rigenerante EtOH / MTZ-trattati a 2, 3, e 4 giorni post-ablazione (dpa) (Figura 2C ', D', E ') rispetto ai fegati DMSO-trattate (Figura 2B '). Simile a quella osservata nelle larve, le cellule co-esprimono PCP e mCherry dim sono stati rilevati nel fegato rigenerante EtOH / MTZ-trattati di 12 mesi [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] pesci adulti a 3 e 4 DPA (Figura 2D, E, inserti in, frecce bianche). Questi dati indicano che l'HPC, sensibile alle Notch segnalazione, mantengono la loro capacità di rigenerare come epatociti inla presenza di insulto fibrogenica in zebrafish adulto.
La figura 3 mostra i risultati rappresentativi di screening chimico utilizzando il nostro modello di fegato fibrotico etanolo-indotta in zebrafish larvale. Per individuare composti bioattivi che accelerano la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico, abbiamo eseguito schermi genetici chimici. Abbiamo proiettato una libreria di 75 piccole molecole con attività biologica e farmaceutici ben caratterizzati (Stem Cell Signaling Biblioteca Compound, Selleckchem) e una biblioteca di 1.000 piccole molecole meno-caratterizzato (ActiProbe-1K Biblioteca, Timtec) utilizzando [Tg (fabp10a: CFP -NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larve. Abbiamo ablated epatociti in presenza di 1,5% EtOH / 15 mM MTZ e quindi esposti alle larve di 50 pM di composti per 50 ore (Figura 3A). Un certo numero di agonisti Wnt quali SB 415286 e CHIR-99021, inibitori di glicogeno sintasi chinasi-3, rigenerazione epatociti promosso (Figura 3C, D) rispetto al DMSO (Figura 3B). Inoltre, [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-il) -1,2,5-ossadiazolo-3-ylamine], abbreviato come HTOA, un romanzo Wnt pathway attivatore, maggiore rigenerazione degli epatociti in fegato fibrotico come indicato dalla grande fegato rigenerato (Figura 3E). Questi dati suggeriscono che il nostro modello fibrotico sostenuta fornisce uno strumento prezioso per scoprire piccole molecole che migliorano la rigenerazione degli epatociti.
Figura 1. Sviluppo di un modello di fegato fibrotico etanolo-indotta in zebrafish larvale. (A) Schema che illustra i periodi di EtOH e EtOH / MTZ trattamento per stabilire un modello di fegato fibrotico nelle larve. (B) a 50 ore post-ablazione (HPA), EtOH / MTZ-trattata lzebrafish Arval ha sviluppato anomalie morfologiche tra cui la curvatura verso l'alto del tronco e della coda, edema pericardico, e l'incapacità di gonfiare la vescica natatoria. (CC '' ') nel fegato di [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) PD24] larve trattate con DMSO, proteine ECM collagene 1a era quasi impercettibile (C, C ') e HSC quiescenti ha mostrato una configurazione a stella (C' '), mentre NRC distribuiti tra epatociti (C, C '' ', nel riquadro). (DE '' ') nel fegato di larve EtOH / MTZ-trattati, è stata osservata elevata deposizione di collagene 1a (D, D', E, E '). CSE è aumentata di numero e ha perso complessi processi citoplasmatici (D '', e ''). A 25 hpa, NRC mCherry-esprimenti sono composti da due distinte popolazioni. Giallo frecce indicano luminose NRC rossi (D '' ', inserto), mentre le frecce bianche indicano dim NRC rossi (D' '', nel riquadro). A 50 hpa, Tg (fabp10a: CFP-NTR) e Tg (TP1: mCherry) cellule co-esprimono iniziato emergenti in tutto il fegato rigeneranti (E '' ', inserto, frecce bianche), mentre i NRC di colore rosso vivo non ha avuto espressione PCP (E '' ', inserto, punte di freccia di colore giallo). Tutte le immagini confocale sono immagini piane singole tranne C '', D '', E '', che sono immagini di proiezione. Barre di scala: B, 100 micron; CE '' ', 20 micron. EtOH, etanolo; MTZ, metronidazolo; hpa, ore post-ablazione; dpf, giorni post-fertilizzazione. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sviluppo di un modello di fegato fibrotico etanolo-indotta in zebrafish adulto. (A) Schema che illustra i periodi di EtOH e MTZ trattamento per stabilire un modello di fegato fibrotico in adulti. (BE ') Tg (fabp10a: CFP-NTR), Tg (TP1: mCherry), e l'espressione di collagene 1a in vibratome sezioni del DMSO (B e B') e EtOH / MTZ-trattati (CE ') per adulti fegati zebrafish. (BB ') Nei controlli DMSO-trattati, il collagene 1a era quasi impercettibile (B') senza Tg (fabp10a: CFP-NTR) e Tg (TP1: mCherry) cellule co-esprimono (B). (CE ') nel fegato rigeneranti EtOH / MTZ-trattati, deposizione di collagene 1a era marcatamente elevata a 2, 3, e 4 DPA (C', D ', E') conpopolazione di Tg (fabp10a: CFP-NTR) e Tg (TP1: mCherry), le cellule co-esprimono a 3 e 4 dpa (D, E, inserti, frecce bianche). I NRC rosso vivo non ha avuto espressione CFP (D, E, inserti, punte di freccia di colore giallo). BE, confocale immagini piane singoli. B'-E ', immagini di proiezione confocale. barra della scala, 20 micron. EtOH, etanolo; MTZ, metronidazolo; dpa, giorni post-ablazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultati rappresentativi di screening chimico utilizzando il modello di fegato fibrotico etanolo-indotta in zebrafish larvale. (A) Schema per lo schermo la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico. (BE) Conosciuto e romanzo Wntattivatori aumentano la rigenerazione degli epatociti nel fegato fibrotico. Proiezioni confocale dei fegati EtOH / MTZ-trattati nel [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larve che sono stati somministrati con DMSO (B), SB415286 (C), CHIR-99021 ( D), o un romanzo Wnt attivatore [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-il) -1,2,5-ossadiazolo-3-ylamine] (abbreviato come HTOA) (e). SB415286 e CHIR-99021 sono glicogeno sintetasi chinasi-3 inibitori. Tutte le immagini sono immagini di proiezione confocale. barra della scala, 20 micron. EtOH, etanolo; MTZ, metronidazolo; hpa, ore post-ablazione; dpf, giorni post-fertilizzazione. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo osservato rigenerazione degli epatociti HPC-mediata nel fegato recupero EtOH / MTZ-trattati, suggerendo che anche in presenza di notevoli quantità di proteine ECM compresi tipo fibrillare collagene, i HPCs conservano la loro competenza per rigenerare come epatociti. L'unico MTZ-trattamento non ha aumentato la deposizione di proteine ECM in modo significativo, mentre il EtOH unico trattamento non ha indotto attivazione HPC 15. Utilizzando il trattamento EtOH / MTZ combinato, siamo stati in grado di studiare la rigenerazione HPC-driven nel fegato fibrotico. Come quasi completa eliminazione di epatociti suscita la rigenerazione degli epatociti HPC-driven, è fondamentale per risolvere le larve MTZ-trattati sulla base dei criteri di assenza di fluorescenza specifica-epatociti e il volume del fegato significativamente ridotto dalla NRC cluster. Nei pesci, i vasi sanguigni della branchie e pelle assorbono l'alcool 24, in modo che non vi è alcuna necessità di consentire agli animali di bere ad libitum o richiedono intragainfusione stric come nei modelli di mammifero. Abbiamo ospitato EtOH- e successive pesci adulti MTZ-trattati in serbatoi separati, senza la circolazione dell'acqua. È essenziale trasferire pesce soluzione EtOH fresco ogni giorno e mantenere il coperchio per minimizzare l'evaporazione di EtOH. Sebbene 48-72 hr EtOH trattamento / MTZ induce in modo efficiente la sintesi delle proteine ECM nei nostri protocolli, né fibrosi avanzata né la cirrosi è stato sviluppato in questi pesci. Pertanto, la combinazione di MTZ con una prolungata esposizione di etanolo come 12 settimane di trattamento 14, in particolare nei pesci adulti, può indurre ulteriori gravi danni al fegato per simulare in maniera corretta e interrogare la rigenerazione HPC-driven in caso di insufficienza epatica cronica.
Zebrafish serve come un modello animale eccezionale per test in vivo composti a causa della sua piccola dimensione, grande progenie, la trasparenza e la permeabilità di piccole molecole 25. Utilizzando il modello di fegato fibrotico in zebrafish, abbiamo identificato un certo numero di nota e romanzo Wnt activators e gli inibitori Notch che accelerato la rigenerazione degli epatociti 15. La nostra attuale basato sulla fluorescenza protocollo di screening chimico consiste di diverse fasi tra cui tutte eseguite manualmente la preparazione di prodotti chimici, trasferire EtOH trattati / larve degli epatociti-ablazione a piastre da 24 pozzetti, il trattamento di sostanze chimiche, e l'analisi degli effetti delle sostanze chimiche sulla rigenerazione degli epatociti. Impiega specificamente epifluorescenza e / o microscopio confocale per catturare immagini per singolo animale, che è laborioso e richiede tempo. Piattaforme high-throughput che gestiscono e acquisiscono immagini cellulari risoluzione di zebrafish in combinazione con la raccolta di dati quantitativi faciliterà di screening su larga scala 26,27 caratteristiche .Questi automaticamente saranno rafforzati se combinato con il sistema di dosaggio della droga automatizzato che determina l'intervallo di concentrazioni chimiche 28, che può dare una tossicità minima con la massima efficacia per migliorare la rigenerazione degli epatociti. Nonostante questi Limitazioni, come molti giocatori importanti e principali tipi di cellule del fegato sono conservati tra i zebrafish e mammiferi 29, impiegando in vivo -based piccola molecola di screening utilizzando il modello di fegato fibrotico zebrafish catalizzerà valida scoperta di nuove strategie terapeutiche per la malattia epatica cronica.
Due gruppi aggiuntivi in modo indipendente hanno dimostrato che dopo la perdita quasi totale di epatociti, senza insulti fibrogenici, BEC transdifferentiated in epatociti attraverso una fase di dedifferentiation 30,31 con il presupposto che colangiociti, completamente BECs differenziate, comprendono principalmente NRC / BEC in zebrafish. Sebbene transdifferentiation può essere uno dei meccanismi di azionamento rigenerazione degli epatociti, i nostri risultati indicano che gli HPC, che sono noti per costituiscono la maggioranza della BECs nel fegato zebrafish 32, downregulate attività Notch a differenziarsi in epatociti. Nel frattempo, è plausibile ipotizzare che esimoe completamente differenziate BEC, colangiociti, mantenere i livelli più elevati di attività Notch senza conversione al epatociti durante la rigenerazione. Curiosamente, in presenza di EtOH, come riportato in precedenza 13, abbiamo scoperto che CSE aumentata in numero con morfologia alterata da una configurazione a stella ad una forma miofibroblasti simile con processi citoplasmatici persi. Le HSC attivate caratterizzate da sintesi di proteine ECM sono il principio colpevole responsabile anormale guarigione della ferita durante il processo integrato di riparazione del fegato 4. Anche se lesione cronica spesso prevale notevole capacità del fegato per la rigenerazione, trapiantato HPC ripopolato con successo il fibrotica / cirrotico di fegato di ratto 33. Quindi, il nostro modello di fegato fibrotico zebrafish sarà uno strumento essenziale per chiarire i meccanismi molecolari e cellulari che mediano gli effetti della fibrosi sostenuta sulla rigenerazione degli epatociti HPC-mediata. Inoltre, definendo la c multicellularerosstalk che bilancia la rigenerazione e la fibrosi utilizzando il nostro modello di fegato fibrotico zebrafish ulteriormente facilitare progettare strategie terapeutiche valide per insufficienza epatica cronica in vivo.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal GTEC (2.731.336 e 1.411.318), il NIH (K01DK081351), e la NSF (1.354.837) per CHS Ringraziamo Alem Giorgis per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
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